抗原性组合物和方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年3月30日提交的美国临时申请序列号61/618,021和于2012年5月15日提交的美国临时申请序列号61/647,105的优先权，二者整体并入本文。

技术领域

本公开内容涉及抗原性组合物和使用方法，具体涉及含有抗原性表位的多层膜组合物。

背景技术：

如美国专利No.7,615,530所述，静电逐层(layer-by-layer)多层膜提供了用于用作例如疫苗的免疫原性组合物的平台。在静电逐层多层膜中，将带有相反电荷的聚电解质(polyelectrolyte)沉积在表面(例如颗粒)上，提供稳定的多层结构。可将多肽表位并入到带电荷的聚电解质(例如多肽中)中，允许将多肽表位并入膜中。所述膜含有可用于诱发免疫应答并提供针对靶标(例如病原体)之保护的表位。

虽然美国专利No.7,615,530中公开的组合物适用于其预期目的，但提高所述组合物的免疫原性将是有利的。本文中描述了用于产生对肽抗原之免疫应答的经修饰的多层膜组合物。

技术实现要素：

在一个方面中，组合物包含：

第一多层膜，其包含多个带相反电荷的聚电解质层，其中所述多层膜中的聚电解质层之一包含第一抗原性聚电解质，其中所述第一抗原性聚电解质包含病毒、细菌、真菌或寄生物的多肽表位，并且

其中所述组合物包含toll样受体配体，

其中所述多层膜中的聚电解质包含聚阳离子材料或聚阴离子材料，所述聚阳离子材料或聚阴离子材料具有大于1000的分子量和每分子至少5个电荷。

在另一个方面中，组合物包含：

第一多层膜，其包含多个带相反电荷的聚电解质层，其中所述第一多层膜中的聚电解质层之一包含第一抗原性聚电解质，其中所述第一抗原性聚电解质包含病毒、细菌、真菌或寄生物的多肽表位，

第二多层膜，其包含多个带相反电荷的聚电解质层，其中所述第二多层膜中的聚电解质层之一包含第二聚电解质，其中所述第二聚电解质包含toll样受体配体，并且

其中所述第一和第二多层膜中的聚电解质包含聚阳离子材料或聚阴离子材料，所述聚阳离子材料或聚阴离子材料具有大于1000的分子量和每分子至少5个电荷。

在又一方面中，本文中包括了在脊椎动物生物体中诱发免疫应答的方法，其包括向脊椎动物生物体施用本文中所述的多层膜组合物。

附图说明

图1至3示出了由疟疾Pam3Cys.T1B微颗粒在C57BL/6小鼠中诱发的抗体应答。在图1中，在笫28天，用ELISA测试血清中的T1B肽。结果示出每组10只小鼠的抗T1B IgG抗体效价的平均值±SD。§与MP-1167组相比P＜0.05。在图2中，用1∶250稀释的个体血清重复T1B ELISA，并且每个血清用同种型特异性检测抗体探查(probe)。结果示出每组10只小鼠的平均值±SD。在图3中，在第56天，小鼠通过暴露于PfPb感染的蚊子而被攻击(challenge)，40小时后通过qPCR测量肝中的寄生物负荷(parasite burden)。结果示出个体小鼠(圆圈)和组平均值(条)，插图示出受保护小鼠的数目(与通过虚横线示出的PBS组平均值相比，寄生物负荷降低≥90％)，与PBS组平均值相比，组平均值百分比降低。*与PBS组相比P＜0.05。#与ACT-1167组相比P＜0.05。

图4是IL8应答相对％颗粒混悬液的图，示出含有MPLA的微颗粒以剂量依赖的方式活化TLR-4细胞。

图5是溶液和溶解之颗粒的咪喹莫特(imiquimod，IM)吸光度的图。

图6示出通过用T1BT＊微颗粒免疫诱发的抗体应答。在第0天、第21天和第42天用指示的处理免疫C57BL/6J小鼠。用针对T1B肽的ELISA测试在第49天收集的血清。结果示出每组10只小鼠的平均值±SD。

图7示通过用T1BT＊微颗粒免疫诱发的抗体应答。血清以1∶250测试并且板用同种型特异性检测抗体探查。结果示出每组10只小鼠的平均值±SD。

图8示出针对T1BT＊微颗粒的T细胞应答。在第0天、第21天和第42天用指示的处理免疫C57BL/6小鼠。在第49天收获脾细胞并用IFNy和IL-5ELISPOT板中的T1B肽再刺激。数据描述3次的平均值±SD。

本领域技术人员将通过以下发明详述、附图和所附权利要求书认识和理解上述和其他特征。

具体实施方式

本文中公开了包含病毒、细菌、真菌或寄生物之多肽表位(也称作抗原)的多层膜，其中所述多层膜能够在施用至宿主后在所述宿主中诱发免疫应答。虽然已经示出含有来自病原体之表位的膜诱发免疫应答，但期望开发改进免疫应答的策略。本文中，本发明人已经发现将toll样受体(toll-like receptor，TLR)配体并入膜可定量和定性地改进免疫应答。虽然TLR配体之前已经用作疫苗佐剂，以具有来自病原体之抗原的多层膜的形式施用提供了递送佐剂和表位二者的有效且方便的手段。

特别地，本文中公开了包含多层膜的组合物，所述多层膜包含带相反电荷的聚电解质的交替层。任选地，所述聚电解质的一种或更多种是多肽。所述多层膜包含病毒、细菌、真菌或寄生物的多肽表位。所述多肽表位与聚电解质连接(例如共价连接)。在一个实施方案中，所述聚电解质是包含多肽表位并且具有充足电荷来沉积形成多层膜的多肽。所述组合物还包括作为多层膜的一部分沉积的或在多层膜沉积之前沉积在基底(substrate)(例如核心)上的TLR配体。此外，多肽表位和TLR受体配体可与相同或不同的聚电解质连接，和/或可存在于相同或不同的多层膜中。在一个实施方案中，多肽表位和TLR受体配体与相同的聚电解质共价连接，并且因此在相同的多层膜中。在另一个实施方案中，多肽表位和TLR受体配体与不同的聚电解质共价连接，但在同一多层膜中分层。在又一个实施方案中，多肽表位和TLR受体配体与不同的聚电解质共价连接，但在随后在施用前混合的不同多层膜中分层。在又一个实施方案中，将TLR受体配体沉积在核心上，之后沉积包含多肽表位的聚电解质。在另一个实施方案中，TLR受体配体与多层膜的聚电解质之一共沉积。在另一个实施方案中，TLR受体配体在与多层膜之聚电解质的沉积在一个或分开的步骤中沉积。

在前述的每个实施方案中，可以采用两种或更多种TLR配体。所述两种或更多种TLR配体可以在相同的多层膜中或在随后被混合以形成组合物的不同的多层膜中。

在一个实施方案中，组合物包含第一多层膜，所述第一多层膜包含多个带相反电荷的聚电解质层，其中多层膜中的聚电解质层之一包含第一抗原性聚电解质，其中第一抗原性聚电解质包含多肽表位，并且其中多层膜中的聚电解质包含聚阳离子材料或聚阴离子材料，所述聚阳离子材料或聚阴离子材料具有大于1000的分子量和每分子至少5个电荷。

在一个实施方案中，第一聚电解质包含来自相同病毒、细菌、真菌或寄生物的两种或更多种表位。所述表位可在多肽链上比邻或者被间隔区隔开。类似地，所述表位可在多肽的N端、多肽的C端或者之间的任何地方。

注意到当第一抗原性聚电解质是多肽时，该多肽含有充足的电荷来沉积形成多肽多层膜。在一个实施方案中，如本文中阐明的，多肽的每个残基之净电荷在pH7.0时大于或等于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。

在一个实施方案中，多层膜沉积在核心颗粒(例如CaCO₃颗粒、乳胶颗粒或铁颗粒)上。直径为5纳米(nm)至500纳米(nm)量级的颗粒大小是特别有用的，如同具有1μm或更大直径的更大颗粒(例如3μm直径的颗粒)。由另外的材料制成的颗粒也可用作核心，前提是它们为生物相容性的、具有可控的大小分布、并且具有充足的表面电荷(正或负)来结合聚电解质肽。实例包括由例如以下材料制成的纳米颗粒和微颗粒：聚乳酸(PLA)、聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、壳聚糖、透明质酸、明胶或其组合。核心颗粒也可由被认为不适合人用的材料制成，前提是它们可溶解并且在膜制作后与多层膜分离。模板核心物质的实例包括有机聚合物(例如乳胶)或无机材料(例如硅石)。

多层膜包含多肽表位，例如描述于美国专利No.7,615,530中的表位，其通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，抗原决定区包含病毒抗原。合适的病毒抗原包括但不限于：逆转录病毒抗原，例如HIV-1抗原，包括gag基因、pol基因和env基因的基因产物、Nef蛋白、逆转录酶、以及其他HIV组分；肝炎病毒抗原，例如乙肝病毒的S、M和L蛋白，乙肝病毒的前S抗原和其他肝炎(例如，甲肝、乙肝、丙肝)的病毒组分；流感病毒抗原，例如血凝素和神经氨酸酶和其他流感病毒组分；麻疹病毒抗原，例如麻疹病毒融合蛋白和其他麻疹病毒组分；风疹病毒抗原，例如蛋白E1和E2以及其他风疹病毒组分；轮状病毒抗原，例如VP7sc和其他轮状病毒组分；巨细胞病毒抗原，例如包膜糖蛋白B和其他巨细胞病毒抗原组分；呼吸道合胞病毒抗原，例如附着(G)蛋白、融合(F)蛋白和基质(M2)蛋白以及其他呼吸道合胞病毒抗原组分；单纯疱疹病毒抗原，例如立即早期蛋白(immediate early protein)、糖蛋白D以及其他单纯疱疹病毒抗原组分；水痘带状疱疹病毒抗原，例如gpI、gpII和其他水痘带状疱疹病毒抗原组分；日本脑炎病毒抗原，例如蛋白质E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A、80％E，以及其他日本脑炎病毒抗原组分；狂犬病病毒抗原，例如狂犬病糖蛋白、狂犬病核心蛋白和其他狂犬病病毒抗原组分；以及包含一个或更多个前述抗原决定区的组合。

在另一个实施方案中，抗原决定区域包含细菌抗原。合适的细菌抗原包括但不限于：百日咳菌抗原，例如百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素(pertactin)、FIM2、FIM3、腺苷酸环化酶和其他百日咳细菌抗原组分；白喉细菌抗原，例如白喉毒素或类毒素以及其他白喉细菌抗原组分；破伤风细菌抗原，例如破伤风毒素或类毒素以及其他破伤风细菌抗原组分；链球菌细菌抗原，例如M蛋白和其他链球菌细菌抗原组分；革兰阴性杆菌细菌抗原；结核分枝杆菌的细菌抗原，例如热休克蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌蛋白、抗原85A和其他分枝杆菌抗原组分；幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)细菌抗原组分；肺炎球菌细菌抗原，例如肺炎球菌溶血素(pneumolysin)以及其他肺炎球菌细菌抗原组分；流感嗜血杆菌细菌抗原；炭疽细菌抗原，例如炭疽保护性抗原以及其他炭疽细菌抗原组分；立克次体细菌抗原，例如romp和其他立克次体细菌抗原组分；以及包含前述抗原决定区中一个或更多个的组合。

在另一个实施方案中，抗原决定区包含真菌抗原。合适的真菌抗原包括但不限于：念珠菌属真菌抗原组分；组织胞浆菌属真菌抗原，例如如热休克蛋白60(HSP60)以及其他组织胞浆菌属真菌抗原组分；隐球菌真菌抗原，例如荚膜多糖以及其他隐球菌真菌抗原组分；球孢子菌属真菌抗原，例如小球(spherule)抗原以及其他球孢子菌属真菌抗原组分，以及癣真菌抗原，例如发癣菌素以及其他球孢子菌属真菌抗原组分；以及包含前述抗原决定区中一个或更多个的组合。

在另一个实施方案中，抗原决定区包含寄生物抗原。合适的原生动物和其他寄生物抗原包括但不限于：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)抗原，例如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原(circumsporozoite antigen)、配子母细胞/配子表面抗原、血液阶段抗原pf1 55/RESA以及其他疟原虫抗原组分；弓形虫抗原，例如SAG-1、p30和其他弓形虫抗原组分；血吸虫(schistosomae)抗原，例如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白以及其他血吸虫抗原组分；硕大利什曼原虫(leishmania major)和其他利什曼原虫(leishmaniae)抗原，例如gp63、脂磷聚糖(lipophosphoglycan)及其相关蛋白质和其他利什曼原虫抗原组分；以及克氏锥虫(trypanosoma cruzi)抗原，如75至77kDa的抗原、56kDa抗原和其他锥虫抗原组分；以及包含前述寄生物抗原中一个或更多个的组合。

在一个实施方案中，所述多肽表位来自呼吸道合胞病毒，例如来自附着(G)蛋白及其亚基、融合(F)蛋白及其亚基和基质(M2)蛋白及其亚基的表位。在另一个实施方案中，多肽表位来自流感病毒，例如来自血凝素(HA)蛋白及其亚基、神经氨酸酶(NA)蛋白及其亚基或基质蛋白胞外域(M2)的表位。在另一个实施方案中，多肽表位来自疟原虫，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)和三日疟原虫(P.malariae)，并且包括例如环子孢子(CS)蛋白和亚基(包括T1、B和T＊表位)。

如本文中所用的恶性疟原虫环子孢子蛋白抗原是：

T1：DPNANPNVDPNANPNV(SEQ ID NO：1)

B：NANP(SEQ ID NO：2)

T*：EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：3)

在某些实施方案中，T、B或T＊表位(特别是B表位)重复2次或更多次。

多层膜还包括toll样受体配体或TLR配体。TLR配体是与TLR结合并且活化或抑制TLR受体的分子。通过识别病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)活化TLR信号传导并且模拟物(mimic)导致编码促炎性细胞因子、趋化因子和共刺激分子之基因的转录活化，其可控制抗原特异性适应性免疫应答的活化。一直追求TLR作为多种炎性疾病和癌症的潜在治疗靶标。活化后，TLR诱导多个蛋白质家族(包括炎性细胞因子、I型干扰素和趋化因子)的表达。TLR受体配体可充当用于免疫应答的佐剂。

示例性TLR配体包括TLR1配体、TLR2配体、TLR3配体、TLR4配体、TLR5配体、TLR6配体、TLR7配体、TLR8配体、TLR9配体及其组合。

示例性TLR1配体包括三酰基细菌脂蛋白，例如Pam3Cys([N-棕榈酰基-S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸])。示例性TLR2配体包括二酰基细菌脂蛋白，例如Pam2Cys(Pam₂Cys[S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸])、支原体巨噬细胞活化脂肽-2(MALP2)或酵母聚糖(真菌的)。示例性TLR6配体为二酰基脂肽。TLR1和TLR6需要与TLR2异二聚化以识别配体。TLR1/2被三酰基脂蛋白(或脂肽，例如Pam3Cys)活化，而TLR6/2被二酰基脂蛋白(例如，Pam2Cys)活化，尽管可能有一些交叉识别。

示例性TLR3配体是聚(I：C)。示例性TLR4配体是脂多糖(LPS)、单磷脂A(MPLA)、呼吸道合胞病毒的融合蛋白和小鼠乳腺肿瘤病毒的包膜蛋白。一个示例性TLR5配体是鞭毛蛋白。示例性TLR7配体是核苷类似物，例如罗唑利宾(鸟苷类似物)和咪唑喹啉(imidazoquinoline)(例如咪喹莫特和R848)。示例性TLR8配体是单链RNA。示例性TLR9配体是未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸DNA。

在一个实施方案中，抗原性聚电解质(例如抗原性多肽)具有与其共价连接的TLR配体。例如，Pam3Cys可通过标准多肽合成化学与多肽链共价偶联。在一个实施方案中，Pam3Cys通过直接共价键与抗原性多肽共价连接，经Pam3Cys-OH(可购自Bachem，Inc.)的羧酸与肽的N端之间形成酰胺键。完成该反应的方便方式是在酰胺键形成剂的存在下将Pam3Cys-OH与固相合成树脂株上的合成肽偶联，所述酰胺键形成剂例如HBTU(O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐、HATU(2-(1H-7-偶氮苯并三唑-1-基)--1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸甲铵或DIPCDI(N，N′-二异丙基碳二亚胺)。偶联反应的进程可以通过茚三酮测定的比色监控，完成后，可将过量的Pam3Cys-OH和其他试剂冲走。从树脂上切下合成的Pam3Cys肽缀合物并通过色谱法纯化。例如Pam3Cys肽可通过使用C4柱和水/异丙醇梯度的反向色谱纯化。该方法的一个优势是Pam3Cys/抗原性多肽被严格控制在1∶1的比率。

在另一个实施方案中，将Pam3Cys-OH如上所述特异性缀合至赖氨酸残基的侧链ε-胺或特异性缀合到树脂结合的肽，或者使用水溶性偶联剂(例如EDC/磺基-NHS)非特异性缀合到未保护的肽或蛋白质。例如通过凝胶渗透色谱法或透析纯化反应的产物，然后通过LBL或其他方法并入颗粒。

在又一个实施方案中，Pam3Cys-OH缀合到高度带电的聚电解质(例如多聚赖氨酸)，然后与一个或更多个经设计肽一起并入到LBL膜中。由此，Pam3Cys例如酰胺缀合到含有过剩电荷的序列，例如长度为约4至约40个残基且如上所述纯化的多聚赖氨酸区段，或者是从商业供应商(EMD Biosciences)购买的Pam3Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-OH(Pam3Cys-SK₄)的情况。可以在并入抗原决定区之前、期间或之后的步骤中将肽(例如这些)并入到膜中。该方法的优势可以是仅一个或(或者也许数个)Pam3Cys聚电解质肽可用于与抗原性经设计多肽的任意组合，极大的简化了合成。此外，Pam3Cys/抗原性经设计多肽化学计量可按照期望变化以优化效力或最小化毒性。

在又一个实施方案中，可将市售可得的Pam3Cys试剂Pam3Cys-OH或Pam3Cys-SK4通过非LBL工艺直接并入颗粒。这些包括颗粒沉淀(例如在核心颗粒如CaCO₃的沉淀过程中)、颗粒制造(例如PLGA的油包水分散体中)或脂质体制造中。最后，Pam3Cys的疏水性可驱动吸附到表面上是可能的。因此，在Pam3Cys-OH或Pam3Cys-SK₄溶液中简单的孵育颗粒可产生并入了TLR-2配体的抗原性颗粒。

在另一个实施方案中，将单磷酰脂A(MPLA)缀合到经设计的肽是可能的并且合适的化学物质是本领域中已知的。这些化学物质允许MPLA衍生物通过叠氮化物/炔烃的环加成反应(点击化学)特异性地缀合到改性DP，其在水性缓冲液中容易且高效地发生(Guo等US20090239378，通过引用并入本文)。已使用该技术将肿瘤相关的碳水化合物抗原缀合到MPLA，并且示出所得的缀合物在小鼠中是免疫原性的。

或者，由于其高度疏水性，MPLA将高效地吸附到表面上。因此，MPLA的稀溶液，例如稀中性水性缓冲液中10-100μg/mL将吸附至用经设计肽膜包被的CaCO₃微颗粒的混悬液。可通过化学方法或通过基于细胞的生物测定监控加载工艺的效率。

在另一个实施方案中，咪喹莫特类似物已缀合到单克隆抗体(Stoermer等US20090035323，通过引用并入本文)。这些缀合物示出免疫应答调节能力，表明咪喹莫特类似物保留了充分的TLR-7活性以增强免疫应答。可以用经设计肽制造类似的缀合物并且并入疫苗颗粒。此外，已考虑到用不稳定的接头缀合到咪喹莫特(Stoermer等20100158928，通过引用并入本文)。在这些实例中，咪喹莫特可以扮演前药的角色。以缀合物形式，咪喹莫特类似物是无活性的，但切除不稳定接头后(通过化学或酶促方法)释放活性可溶性咪喹莫特用于免疫刺激。

在另一个实施方案中，通过与核心(例如CaCO₃)共沉淀将可溶性咪喹莫特并入颗粒中。咪喹莫特在水中的溶解度在pH 6及更高时迅速下降。因此，将CaCl₂和咪喹莫特的溶液在pH 5与Na₂CO₃的溶液混合将产生在中性或微碱性pH下咪喹莫特包埋在盐中的CaCO₃颗粒。颗粒的吞噬作用将把它们放置在酸性区室中，这将缓慢地溶解CaCO₃并释放可溶性咪喹莫特。

在另一个实施方案中，在聚电解质层的沉积之前，基底(例如模板核心)已经沉积在TLR配体上。在另一个实施方案中，TLR配体与一个或更多个聚电解质层在多层膜的组装期间共沉积。

聚电解质多层膜是由带相反电荷的聚电解质的交替层构成的薄膜(例如几纳米至几微米厚)。这样的膜可在适合的基底上通过逐层组装形成。在静电逐层自组装(“LBL”)中，聚电解质缔合的物理基础是静电吸引。膜建立是可能的，因为膜的表面电荷密度的符号与沉积的连续层相反。LBL膜加工的通用性和相对简单性允许将许多不同类型的聚电解质沉积在许多不同类型的表面上。多肽多层膜是聚电解质多层膜的一个子集，其包含至少一个包含带电荷之多肽(本文中称作经设计的多肽)的层。多肽多层膜超过由其他聚合物制造的膜的关键优势是其生物相容性。LBL膜也可用于包封。多肽膜和微胶囊的应用包括例如纳米反应器、生物传感器、人造细胞和药物递送载剂。

术语“聚电解质”包括聚阳离子和聚阴离子材料，其具有大于1000的分子量和每分子至少5电荷。合适的聚阳离子材料包括例如多肽或多胺。多胺包括例如：多肽(例如聚-L-赖氨酸(PLL)或聚-L-鸟氨酸)、聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚胺)，聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯氯化物)，聚(甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵)、壳聚糖以及包含一种或更多种前述聚阳离子材料的组合。合适的聚阴离子材料包括例如：多肽(例如聚-L-谷氨酸(PGA)和聚-L-天冬氨酸)、核酸(例如DNA和RNA)、藻酸类、角叉菜胶、红藻胶(furcellaran)、果胶、黄原胶、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸葡聚糖、聚(甲基)丙烯酸、氧化纤维素、羧甲基纤维素、酸性多糖、和交联羧甲纤维素、合成聚合物和含有侧链羧基基团的共聚物以及包含一种或更多种前述聚阴离子材料的组合。在一个实施方案中，多肽表位和聚电解质具有相同的电荷符号。

在一个实施方案中，膜的一个或更多个聚电解质层(任选地包含含有多肽表位的聚电解质)是经设计的多肽。在一个实施方案中，适用于静电逐层沉积的多肽的设计原理在美国专利公开No.2005/0069950中阐明，对于其多肽多层膜的教导通过引用并入本文。简言之，主要设计考虑是多肽的长度和电荷。静电是最重要的设计关注，因为它是LBL的基础。没有合适的电荷特性，多肽可以基本上不溶于pH4至10的水溶液并且不能容易地用于通过LBL制造多层膜。其他设计关注包括多肽的物理结构、由多肽形成的膜的物理稳定性、以及膜和组成多肽的生物相容性和生物活性。

经设计的多肽意指多肽具有充足的电荷用于与带相反电荷的表面稳定结合，即，多肽可沉积在多层膜的层中，其中用于膜形成的驱动力是静电。短的稳定膜是这样的膜，其一旦形成，在PBS中于37℃孵育24小时后其组分保留超过一半。在一些具体实施方案中，经设计多肽的长度为至少15个氨基酸并且多肽的每个残基的静电荷量级在pH 7.0下大于或等于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。在pH7.0带正电荷(碱性)的天然氨基酸是精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、鸟氨酸(Orn)和赖氨酸(Lys)。在pH7.0带负电荷(酸性)的天然氨基酸残基是谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)。可以采用相反电荷的氨基酸残基的混合物，只要电荷的总净比率满足指定的标准即可。在一个实施方案中，经设计的多肽不是均聚物。在另一个实施方案中，经设计的多肽不分支。

一个设计关注是控制多肽LBL膜的稳定性。离子键、氢键、范德华相互作用和疏水相互作用有助于多层膜的稳定性。另外，在同一层内或在相邻层中多肽的含巯基氨基酸之间形成的共价二硫键可以提高结构强度。含巯基的氨基酸包括半胱氨酸和同型半胱氨酸并且这些残基可以容易地并入到合成的经设计肽。此外，巯基可以通过在文献中充分描述的方法并入聚电解质均聚物，例如聚-L-赖氨酸或聚-L-谷氨酸。含巯基氨基酸可用于通过氧化电势的变化来“锁定”(结合在一起)和“解锁”多层多肽膜的层。此外，在经设计的多肽中并入含巯基氨基酸使得能够借助于分子间二硫键的形成而在薄膜制造中使用相对短的肽。

在一个实施方案中，在还原剂的存在下通过LBL组装经设计的含巯基多肽(无论化学合成或在宿主生物体中产生)以阻止过早的二硫键形成。膜组装之后，移除还原剂并添加氧化剂。在氧化剂的存在下，在巯基基团之间形成二硫键，由此在巯基存在之处将层内和层之间的多肽“锁定”在一起。合适的还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(BME)、还原型谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、以及这些化学品中多于一种的组合。合适的氧化剂包括氧化型谷胱甘肽、叔丁基过氧化氢(t-BHP)、硫柳汞、二酰胺、5，5′-二硫代-双-(2-硝基-苯甲酸)(DTNB)、4，4′-二硫二吡啶、溴酸钠、过氧化氢、连四硫酸钠、porphyrindin、邻亚碘酰苯甲酸钠(sodium orthoiodosobenzoate)、以及这些化学品中多于一种的组合。

作为二硫键的替代，产生其他共价键的化学物质可用于稳定LBL膜。对于由多肽构成的膜，产生酰胺键的化学物质是特别有用的。在适当的偶联剂的存在下，酸性氨基酸(侧链含有羧酸基团的那些，例如天冬氨酸和谷氨酸)将与其侧链含有氨基的氨基酸(例如赖氨酸和鸟氨酸)反应以形成酰胺键。酰胺键在生物学条件下比二硫键更稳定并且酰胺键不会发生交换反应。许多试剂可用于活化多肽侧链用于酰胺键合。碳二亚胺试剂(例如水溶性1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)将与天冬氨酸或谷氨酸在微酸性pH下进行反应，形成中间产物，其将与胺不可逆地反应形成酰胺键。通常将添加剂(例如N-羟基琥珀酰亚胺)添加至反应以加速酰胺形成的速率和效率。反应后，通过离心和吸出将可溶性试剂从纳米颗粒或微颗粒中去除。其他偶联试剂的实例包括二异丙基碳二亚胺、HBTU、HATU，HCTU、TBTU和PyBOP。其他添加剂的实例包括磺基-N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑和1-羟基-7-氮杂-苯并三唑。酰胺交联的程度可以通过调节偶联试剂的化学计量、反应时间或反应温度来控制，并且可以通过例如傅立叶变换-红外光谱(FT-IR)技术来监测。

共价交联的LBL膜具有期望的性质，例如提高的稳定性。更大的稳定性允许在纳米颗粒、微颗粒、纳米胶囊或微胶囊制作过程中使用更严格的条件。严格条件的实例包括高温、低温、深冷温度(cryogenic temperature)、高离心速度、高盐缓冲液、高pH缓冲液、低pH缓冲液、过滤和长期存储。

制造聚电解质多层膜的方法包括将多个带相反电荷的化学物质(chemical species)的层沉积在基底上。在一个实施方案中，至少一层包含经设计多肽。连续沉积的聚电解质将会具有相反的净电荷。在一个实施方案中，聚电解质的沉积包括将基底在聚电解质对LBL具有合适净电荷的pH下暴露于含有聚电解质的水溶液。在另一些实施方案中，在基底上沉积聚电解质通过连续喷涂带相反电荷的多肽溶液来实现。在又一些实施方案中，在基底上沉积是通过同时喷涂带相反电荷的聚电解质。

在形成多层膜的LBL方法中，相邻层的相反电荷提供用于组装的驱动力。在相对的各层中聚电解质具有相同的净线性电荷密度不是关键的，仅指相对的层具有相反的电荷。通过沉积的一个标准膜组装过程包括：在它们离子化的pH值(即，pH 4-10)下形成聚离子的水溶液，提供带有表面电荷的基底，以及将基底交替浸入到带电荷的聚电解质溶液中。在交替层的沉积之间任选地洗涤基底。

适用于聚电解质之沉积的聚电解质浓度可容易地由本领域普通技术人员确定。示例性浓度是0.1至10mg/mL。对于典型的非多肽聚电解质(例如聚(丙烯酸)和聚(烯丙基胺盐酸盐))，典型的层厚度为约至约取决于溶液的离子强度。短聚电解质通常形成比长聚电解质更薄的层。关于膜的厚度，聚电解质膜的厚度取决于湿度，以及层的数目和膜的组成。例如，PLL/PGA膜50nm厚，用氮干燥后收缩至1.6nm。一般情况下，1nm至100nm或更厚的膜可根据膜的水合状态和组装中采用的聚电解质的分子量来形成。

此外，形成稳定的聚电解质多层膜所需的层数将取决于膜中的聚电解质。对于仅包含低分子量多肽层的膜，膜通常将具有带相反电荷的多肽的4个或更多个双层。对于包含高分子量聚电解质(例如聚(丙烯酸)和聚(烯丙基胺盐酸盐))的膜，包含带相反电荷之聚电解质的单一双层的膜可是稳定的。研究表明，聚电解质膜是动态的。包含在膜中的聚电解质可在层之间迁移，并且当混悬在聚电解质溶液中时可与相同电荷的可溶性聚电解质交换。此外，聚电解质膜可以响应于环境(例如温度、pH、离子强度或混悬缓冲液的氧化电势)的变化而解组装或溶解。因此，一些聚电解质(并且特别是肽聚电解质)表现出短暂的稳定性。肽聚电解质膜的稳定性可以通过将膜在受控条件下混悬在合适的缓冲液中，持续一段固定的时间，然后用合适的测定(例如氨基酸分析、HPLC测定或荧光测定)来测量所述膜中的肽量。肽聚电解质膜在其贮藏并用作疫苗相关的条件(例如在中性缓冲液中并且在环境温度(例如4℃至37℃))下最稳定。在这些条件下，稳定的肽聚电解质膜将保持其大部分组分肽至少24小时并且经常多达或超过14天。

在一个实施方案中，经设计的多肽包含与一个或更多个多肽表位共价连接的一个或更多个表面吸附区，其中经设计的多肽和一个或更多个表面吸附区具有相同符号的电荷，即二者都是正电荷或都是负电荷。如本文中所用的，表面吸附区是经设计多肽的带电荷区域，其有利地提供了充足的电荷，以使得含有多肽表位的肽例如可沉积在多层膜中。在一个实施方案中，一个或更多个表面吸附区和一个或更多个多肽表位具有相同的净极性。在另一个实施方案中，经设计的多肽在pH 4至10的溶解度大于或等于约0.1mg/mL。在另一个实施方案中，经设计的多肽在pH 4至10的溶解度大于或等于约1mg/mL。溶解度是有助于多肽从水溶液中沉积的实际限制。抗原性多肽的聚合程度的实际上限为约1000个残基。然而，可以想到，更长的复合多肽可以通过恰当的合成方法实现。

在一个实施方案中，经设计的多肽包含被两个表面吸附区(N端表面吸附区和C端表面吸附区)侧翼的单个多肽表位。在另一个实施方案中，经设计的多肽包含被与多肽表位之N端相连的一个表面吸附区侧翼的单个多肽表位。在另一个实施方案中，经设计的多肽包含被与多肽表位之C端相连的一个表面吸附区侧翼的单个抗原性多肽表位。

经设计的多肽的每一个独立区域(例如，多肽表位和表面吸附区)可通过溶液相肽合成、固相肽合成或合适的宿主生物体的基因工程分别地合成。溶液相肽合成是用于生产目前市场上大多数经批准的肽药物的方法。溶液相和固相方法的结合可用于合成相对长的肽以及甚至小的蛋白质。肽合成公司具备专业知识和经验以基于付费服务合成困难的肽。合成在药品生产质量管理规范(good manufacturing practices，GMP)条件和适合于临床试验和商业化药物开发的规模进行。

或者，多个独立的区可作为单个多肽链通过溶液相肽合成、固相肽合成或合适的宿主生物的基因工程一起合成。在任何特定情况下的方式选择将是方便或经济的问题。

如果多个多肽表位和表面吸附区是分开合成的，一经纯化(例如通过离子交换色谱或通过高效液相色谱)，它们通过肽键合成连接(joined)。即，表面吸附区的N端和多肽表位的C端共价连接以产生经设计的多肽。或者，表面吸附区的C端和多肽表位的N端共价连接以产生经设计的多肽。个体片段可通过固相方法合成和获得，作为完全保护、完全未保护或部分保护的区段。区段可在溶液相反应或固相反应中共价连接。如果一个多肽片段含有半胱氨酸作为其N端残基并且其他多肽片段在其C端残基含有硫酯或硫酯前体，两个片段将在溶液中通过(本领域技术人员)通常称作自然连接(Native Ligation)的特异性反应自发偶联。自然连接对于经设计的肽合成是特别有吸引力的，因为它可用完全去保护的或部分保护的肽片段在水溶液中并且在稀释浓度下进行。

在一个实施方案中，多肽表位和/或表面吸附区通过如美国专利No.7,723,294(通过引用并入本文)所描述的肽键或非肽键连接以连接用于多层膜的多肽区段。适合的非肽接头包括例如，烷基接头例如-NH-(CH₂)_s-C(O)-，其中s＝2-20。烷基接头任选地被非空间阻碍基团取代，例如低级烷基(如C₁-C₆)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH₂、苯基等。另一个示例性非肽接头是聚乙二醇接头，例如-NH-(CH₂-CH₂-O)_n，-C(O)-，其中n使得该接头具有100Da至5000Da，特别是100Da至500Da的分子量。许多本文描述的接头可从商业供应商以适合于固相肽合成中使用的形式获得。

在一个实施方案中，一种或更多种多肽表位通过共价键与一种或更多种聚电解质共价连接，例如多肽或其他聚电解质。合适的共价键的实例包括酰胺、酯、醚、硫醚和二硫化物(disulfide)。本领域技术人员可以利用见于表位肽内的官能团的范围来将键改造成合适的电解质。例如，可在见于C端或者天冬氨酸或谷氨酸侧链上表位肽中的羧酸。可用合适的肽偶联试剂(例如1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC))活化羧酸，以与在肽聚电解质(例如聚-L-赖氨酸)中发现的伯胺和仲胺反应。所得到的酰胺键在环境条件下是稳定的。相反，可用EDC活化肽聚电解质的酸基团用于与表位肽中的胺基反应。可用的胺基可见于表位肽的N端或赖氨酸残基的侧链上。

表位肽也可经二硫键与聚电解质连接。聚电解质(例如PGA或PLL)可经化学修饰使得其侧链的部分(fraction)含有巯基。在合适的氧化剂存在下，那些巯基将与包含在表位肽内的半胱氨酸残基的巯基反应。半胱氨酸可以是来自病原体(例如疟原虫原生动物)的蛋白质序列的天然半胱氨酸或者其可以是在肽合成期间有意并入表位的非天然半胱氨酸。合适的氧化剂包括DTNB、2，2′-二硫代吡啶、过氧化氢、胱氨酸和氧化型谷胱甘肽。通过二硫键将表位肽与聚电解质连接是特别有用的。二硫化物在膜制作和储存在正常条件下是稳定的，但容易被天然见于细胞中的还原剂切割，这释放用于免疫加工的表位肽。

表位肽也可以通过硫醚键与聚电解质连接。合成的表位肽可以用与巯基发生特异性反应的适当的亲电试剂(例如卤代乙酰基团)来合成。例如，在其N端含有氯乙酰基的表位肽将会与具有巯基的聚电解质(例如上述的PGA-SH)形成稳定的键。

表位肽还可通过双功能接头分子与聚电解质共价连接。双功能接头通常含有两个亲电基团，其可与在表位肽或者聚电解质分子上存在的亲核物反应。市售两类接头分子，同双功能接头和异双功能接头。同双功能接头包含两个拷贝的由非反应性间隔子连接的亲电基团。常用的亲电物是活性酯，如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(磺基NHS)，其与亲核胺反应。同双功能NHS酯的实例包括双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯、二硫代双(琥珀酰亚胺基)丙酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯。有时亲电物是与表位和聚电解质分子上的亲核胺形成酰亚胺的醛基。酰亚胺键是瞬时稳定的，但可以用还原剂(例如硼氢化钠)或催化加氢转变成稳定的结构。最常用的同双功能醛接头是戊二醛。

其他常用同双功能接头含有与亲核硫醇特异性反应的亲电物，其可用于将含有半胱氨酸的表位肽与如上所述的含有巯基的聚电解质连接。巯基特异性同双功能接头的实例包括1，4二马来酰亚氨丁烷、1，4二马来酰亚胺基-2，3-二羟基丁烷、v双马来酰亚胺己烷、双-马来酰亚胺基乙烷、1，4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫)-丙酰氨基]丁烷、二硫代-二马来酰亚胺基乙烷、1，6-己烷-双-乙烯基砜。

交联试剂的异双功能类成员含有两种不同的反应性基团，经常但不总是亲电物，其与底物分子中的不同功能基团特异性反应。特别有用的是这样的接头，其含有一个对巯基特异性的亲电基团和另一个对胺特异性的亲电物。这些试剂的实例包括N-磺基琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚胺基3-[溴代乙酰氨基]丙酸、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯、磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯、琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯、([N-e-马来酰亚胺基己酰基氧基]磺基琥珀酰亚胺酯、间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯、琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸、4-琥珀酰亚胺基-甲基-a-[2-吡啶基二硫]甲苯。

通常存在于表位肽和聚电解质二者中或者其可容易地装配到二者中任一种分子的官能团的广泛范围允许人们选择最适合目的基底的连接策略。可能的实例是将含有半胱氨酸的表位肽与PLL连接。

可以多种方式连接多肽区段，取决于非肽接头的化学性质。例如，第一个多肽区段的N端与第二多肽区段的C端连接；第一多肽区段的N端与第二多肽区段的N端连接；第一多肽区段的C端与第二多肽区段的C端连接；第一多肽区段的C端与第二多肽区段的N端连接；第一多肽区段的C端或N端与第二多肽区段的侧链(pendant side chain)连接；或者第二多肽区段的C端或N端于第一多肽区段侧链连接。然而，不考虑连接点，第一和第二区段通过非肽接头共价连接。

在一个实施方案中，经设计的多肽是一个或更多个表面吸附区与一个或更多个多肽表位共价连接的独特组合。对于多肽表位的长度没有特别的限制，多肽表位可以是线性表位或者是构象表位。表位可包含复杂构象表位的从约3个氨基酸残基至多达数百个氨基酸残基的任何地方。

在一个实施方案中，经设计的多肽包含一个多肽表位和一个表面吸附区。在另一个实施方案中，经设计的多肽包含一个多肽表位和两个表面吸附区，其中一个与多肽表位的N-端连接，一个与多肽表位的C端连接。表面吸附区域的目的是使多肽吸附到带相反电荷的表面上以建立多层膜。

在经设计的多肽中表面吸附区的数目相对于多肽表位的数目和/或长度与溶解度的需求相关。例如，如果多肽表位是例如三个氨基酸残基的短氨基酸序列，将仅需一个至少8个氨基酸残基的表面吸附区将经设计的多肽吸附到合适的带电荷表面。反之，如果多肽表位是包含例如120个氨基酸残基的蛋白质的可溶性折叠结构域，可需要两个表面吸附区以给予足量的电荷以使经设计的多肽变成水溶性的并且适于吸附。表面吸附区可以是连续的且位于结构域的N端，连续的且位于结构域的C端，或者不连续的(一个位于N端并且一个位于C端)。此外，多肽表位在其天然序列内可以含有带电荷的区段(带正电荷或带负电荷)，其可充当表面吸附区。

多肽或抗原可以含有一个或更多个不同的抗原决定簇。抗原决定簇可以指多链蛋白质的免疫原性部分。

用于确定特异性抗体的抗原决定簇或表位的位置和组成的方法和技术在本领域内是公知的。这些技术可用于鉴定和/或表征用作多肽表位的表位。在一个实施方案中，抗原特异性抗体的表位的作图/表征方法可通过表位“足迹法”确定，所述足迹法使用在抗原性蛋白中暴露的胺/羧基的化学修饰。这样的足迹法技术的一个实例是使用HXMS(通过质谱法检测氢-氘交换)，其中受体和配体蛋白酰胺质子的氢/氘交换，结合并发生返交换(back exchange)，其中参与蛋白质结合的骨架酰胺基团受到返交换的保护并且由此将保留氘化(deuteriated)。可以通过消化蛋白性水解、快速微孔高效液相色谱法分离和/或电喷雾离子化质谱在这一方面鉴定相关区域。

在另一个实施方案中，合适的表位鉴定技术是核磁共振表位作图(NMR)，其中通常比较游离的抗原和与抗原结合肽(例如抗体)复合的抗原的二维NMR谱中信号的位置。抗原通常用¹⁵N选择性的同位素标记，使得在NMR谱中看到仅对应于抗原的信号并且没有来自抗原结合肽的信号。源自参与抗原结合肽相互作用之氨基酸的抗原信号通常在复合物的谱中与游离抗原的谱相比将移动位置，这种方式可以鉴定参与结合的氨基酸。

在另一个实施方案中，表位作图/表征可通过肽扫描来完成。在这种方法中，制备跨越抗原的多肽链之全长的一系列重叠肽，并单独针对免疫原性进行测试。通过标准方法(例如酶联免疫吸附测定)确定对应的肽抗原的抗体效价。然后根据免疫原性将多个肽排序，提供了选择用于疫苗开发的肽设计的经验基础。

在另一个实施方案中，蛋白酶消化技术也可用于表位作图和鉴定的情况中。抗原决定簇相关区/序列可以被蛋白酶消化，例如通过以约1∶50的比率对抗原性蛋白质使用胰蛋白酶，在37℃和pH 7-8消化过夜(O/N)，随后质谱法(MS)分析用于肽鉴定。随后可以通过比较经胰酶消化的样品和用CD38BP孵育并且然后经历被例如胰蛋白酶消化的样品来鉴定被抗原性蛋白保护免受胰蛋白酶切割的肽(由此揭示了结合物(binder)的足迹)。另一些酶(例如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等)也可以或作为替代地用于类似的表位表征方法中。此外，蛋白酶消化可以提供用于使用已知抗体确定在已知抗原性蛋白内潜在的抗原决定簇序列之位置的快速方法。在另一个实施方案中，蛋白酶消化技术也可用于表位作图和鉴定的情况中。

本文中还公开了免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含含有两个或更多个聚电解质层的多层膜，其中相邻层包含带相反电荷的聚电解质，其中一层包含多肽表位。所述免疫原性组合物任选地还包含一个或更多个包含经设计的多肽的层。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在相同或不同的聚电解质上包含多种多肽表位，例如，经设计的多肽。多种抗原决定簇可来自相同或不同的感染性病原体(infectious agent)。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含多种独特的抗原性聚电解质。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含多种在每个聚电解质内包含多种多肽表位的免疫原性的聚电解质。这些免疫原性组合物的优势是多种抗原决定簇或单个线性抗原决定簇的多个构象可存在于单个合成的疫苗颗粒中。具有多种抗原决定簇的这种组合物可潜在地产生针对多种表位的抗体，提高例如由生物体的免疫系统产生的至少一些抗体将中和病原体或癌症细胞上靶标特异性抗原的可能性。

免疫原性组合物的免疫原性可以以多种方式增强。在一个实施方案中，多层膜任选地包含一个或更多个附加的免疫原性生物活性分子。虽然不是必需的，但是一个或更多个附加的免疫原性生物活性分子通常将包含一个或更多个附加的抗原决定簇。合适的附加免疫原性生物活性分子包括例如：药物、蛋白质、寡核苷酸、核酸、脂质、磷脂、碳水化合物、多糖、脂多糖、低分子量免疫刺激分子，或其包含一种或更多种前述生物活性分子的组合。其他类型的附加的免疫增强剂包括功能性膜片段、膜结构、病毒、病原体、细胞、细胞聚集体、细胞器或包含一个或更多个前述生物活性结构的组合。

在一个实施方案中，多层膜任选地包含一种或更多种附加的生物活性分子。所述一种或更多种附加的生物活性分子可以是药物。或者，该免疫原性组合物是中空外壳或围绕核心之涂层的形式。核心包含多种不同的包封材料，例如，一种或更多种附加的生物活性分子，包括例如药物。因此，如本文中所设计的免疫原性组合物还可以用于联合治疗，例如，诱发免疫应答并且用于靶向药物递送。“结晶”形式的合适治疗材料的微米大小的“核心”可以被包含免疫原性多肽的免疫原性组合物包封，并且所得到的微胶囊可用于药物递送。该核心可以在某些条件(例如高pH或低温)下不溶，并且在将发生控制释放的条件下是可溶的。晶体上的表面电荷可以通过ζ-电势测量值(用于确定在液体介质中的胶体颗粒上静电单元的电荷)确定。该微胶囊的内容物从微胶囊的内部释放到周围环境的速率将取决于许多因素，所述因素包括包封壳的厚度、在该外壳中使用的抗原性多肽、二硫键的存在、肽的交联程度、温度、离子强度以及用于组装肽的方法。通常来说，胶囊越厚，释放时间越长。

在另一个实施方案中，附加的免疫原性生物分子是能够指导宿主生物中合成期望的免疫原或干扰来自病原体的遗传信息之表达的核酸序列。在前者的情况下，这样的核酸序列例如通过本领域技术人员已知的方法插入到合适的表达载体中。适用于体内产生高效基因转移的表达载体包括逆转录病毒、腺病毒和牛痘病毒载体。这样的表达载体的操纵元件包括至少一个启动子、至少一个操纵子、至少一个前导序列、至少一个终止子密码子和必要或优选的适合于转录以及随后翻译载体核酸的任何其他DNA序列。特别地，可以预期的是这样的载体将包含至少一个被宿主生物体识别的复制起点连同至少一个选择性标志，以及至少一个能够诱发核酸序列之转录的启动子序列。在后一种情况下，将制备这样的核酸序列的多个拷贝用于递送，例如通过将核酸包封在多肽多层膜内，以胶囊的形式用于静脉内递送。

在重组表达载体的构造中，应该另外注意的是，可以将目的核酸序列及其伴随的操纵元件的多个拷贝插入到各个载体。在这样的一个实施方案中，宿主生物将产生每个载体更大量的期望蛋白质。可以插入到载体的核酸序列的多个拷贝的数量仅受限于待转移到适当宿主微生物中并且在其中复制和转录的产物载体的能力(由于其大小)。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含抗原性聚电解质/免疫原性生物活性分子的混合物。这些可以源自相同的抗原，它们可以是来自相同感染性病原体或疾病的不同抗原，或者它们可以来自不同感染性病原体或疾病。因此，复合物或混合物将提高针对多种抗原的免疫应答，并且通过递送系统的抗原性肽/蛋白质组分指定可能多种的感染性病原体或疾病。

在一个实施方案中，多层膜/免疫原性组合物唤起免疫系统对病原体的应答。在一个实施方案中，疫苗组合物包含与可药用载体组合的免疫原性组合物。因此针对病原性疾病的疫苗接种方法包括向需要接种疫苗的对象施用有效量的免疫原性组合物。

可药用载体包括但不限于：大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、灭活的病毒颗粒等。可药用盐也可以在组合物中使用，例如，无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸的盐例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。所述组合物还可以包含液体，例如水、盐水、甘油和乙醇，以及例如润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂的物质。脂质体也可以用作载体。

在脊椎动物中诱发针对疾病或病原体免疫应答的方法(例如，疫苗接种)包括施用包含含有多肽表位之多层膜的免疫原性组合物。在一个实施方案中，含有该多肽表位的聚电解质是多层膜的最外层或暴露于溶剂的层。免疫原性组合物可以经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下、腹膜内、舌下、皮内、经肺或经皮施用，具有或不具有加强剂量。通常来说，所述组合物以与剂型相容的方式并且以这样的将是预防和/或治疗有效的量施用。待施用的免疫原性组合物的精确量取决于实施者的判断并且可以是特定于每个对象。对本领域技术人员将明显的是，免疫原性组合物的治疗有效量将尤其是取决于施用时间表、所施用抗原的单位剂量、该组合物是否与其他治疗剂组合施用、以及接受者的免疫状态和健康状况。如本领域中公知的，治疗有效剂量可通过普通医务技术人员根据患者的特征(年龄、体重、性别、病症、并发症、其他疾病等)来确定。另外，还进行了常规研究，对用于多名患者中的多种病症之治疗的恰当剂量水平将出现更具体的信息，并且普通技术人员(考虑治疗背景、年龄和接受者的一般健康状况)能够确定恰当的剂量。

免疫原性组合物任选地包含佐剂。佐剂一般包含以非特异性方式增强宿主免疫应答的物质。佐剂的选择取决于待接种的对象。优选地，使用可药用佐剂。例如，用于人的疫苗应避免油或烃乳剂佐剂，包括完全和不完全弗氏佐剂。适合用于人的佐剂的一个实例是明矾(氧化铝凝胶)。然而，用于动物的疫苗可包含不适用于人的佐剂。

考虑免疫应答可以通过呈递能够诱发此类应答的任何蛋白质或肽诱发。在一个实施方案中，抗原是关键表位，其产生对感染性疾病的特定物质的强免疫应答，即免疫显性表位(immunodominant epitope)。如果期望的话，可在免疫原性组合物中包含超过一种抗原或表位以提高免疫应答的可能性。

在一个实施方案中，多个多肽表位并入LBL膜。不同的表位可以合成或在单个经经设计的肽分子中合成或表达。预期将多个表位放置在单个经经设计肽中将有某些优势。例如，其应该简化LBL制作过程并提高再现性。此外，将多个表位放置在单个经经设计肽中将以期望的比例(例如1∶1)锁定不同表位的摩尔比。

或者，表位可并入不同的经设计肽。在一个或更多个成层步骤期间将经设计肽并入LBL膜。使用多个不同经设计肽制作膜也可存在某些益处。应当简化经设计肽合成，降低成本。也将能够使每种经设计肽在膜内的相对剂量变化和优化。例如，如果临床前或临床的生物数据表明，最佳的疫苗应含有一个表位的五个拷贝对应第二表位的每一个拷贝(5∶1比例)，不同的表位设计肽方法将有利于此类疫苗的制造。

经设计肽借助于经设计肽的带电的表面吸附区与膜的带相反电荷表面之间的静电引力吸附到LBL膜的表面上。吸附效率将在很大程度上取决于表面吸附区的组成。因此，具有不同的表位，但具有类似的表面吸附区的经设计肽将具有类似的吸附效率。为制造具有两个各自以1∶1摩尔比的不同经设计肽的膜，可以在该摩尔比混合肽并在特定的层同时沉积它们。或者，可以单独地沉积各个肽在不同的层。吸附的肽的摩尔比将在很大程度上反映在它们成层时的相对浓度或者在它们被并入过程中成层步骤的数目。

可以以多种方式来测量并入LBL膜的经设计肽的量。定量氨基酸分析(AAA)特别适合于这个目的。通过用浓盐酸(6M)并加热(通常为在115℃下15小时)处理，含有经设计肽的膜分解为其组成氨基酸。然后使用本领域技术人员公知的色谱技术测量每种氨基酸的量。仅在膜的一个经设计肽中出现的氨基酸可以用作该肽的示踪剂。当经经设计肽缺乏独特的氨基酸时，可以在合成过程中将非天然氨基酸(例如氨基丁酸或高缬氨酸(homovaline))并入经设计的肽。这些示踪剂氨基酸在AAA实验过程中很容易被鉴定，并且可以用于定量膜中肽的量。

本文所使用的特异性T细胞应答是对目的表位(特别是多肽表位)特异性的应答。

本文所使用的特异性抗体应答是对目的表位(特别是如本文所公开的多肽表位)特异性的应答。

如本文所用的“层”意指例如在吸附步骤后在用于膜形成的模板上厚度提高。“多层”意指多个(即两个或更多个)厚度提高。“聚电解质多层膜”是包含聚电解质的一个或更多个厚度提高的膜。沉积后，多层膜的层可以不保持为分离的层。事实上，可能有物质的显著混合，特别是在厚度提高的交界面处。混合或不存在混合，可以通过分析技术监测，例如ζ电势测量值、X射线光电子能谱和飞行时间二次离子质谱。

“氨基酸”意指多肽的结构单元。本文所用的“氨基酸”包括20种常见的天然L-氨基酸，所有其他天然氨基酸，所有的非天然氨基酸，以及所有的氨基酸模拟物，例如，拟肽(peptoid)。

“天然氨基酸”意指甘氨酸加20种常见的天然L-氨基酸，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸。

“非天然氨基酸”意指除了任何20种常见的天然L-氨基酸之外的氨基酸。非天然氨基酸可以具有L-立体化学或D-立体化学。

“拟肽”或N取代的甘氨酸，意指对应氨基酸单体的类似物，具有与相应的氨基酸相同的侧链，但侧链附加到氨基的氮原子上而不是残基的α-碳。因此，聚拟肽(polypeptoid)的单体之间的化学键不是肽键，其可以用于限制蛋白水解消化。

“氨基酸序列”和“序列”意指至少两个氨基酸残基长的多肽链的连续长度。

“残基”意指聚合物或寡聚体中的氨基酸；它是从其中形成聚合物的氨基酸单体的残基。多肽合成涉及脱水，即，在向多肽链添加氨基酸时“丢失”单个水分子。

本文所用的“肽”和“多肽”均指通过邻近氨基酸的α-氨基和α-羧基之间的肽键连接的一系列氨基酸，并且可以含有或没有修饰，例如糖基化、侧链氧化或磷酸化，前提是这样的修饰或缺乏修饰不破坏免疫原性。本文所用的术语“肽”意指肽和多肽或蛋白质二者。

“经设计多肽”意指多肽具有充分的电荷以稳定的结合带相反电荷的表面，即，多肽可沉积在多层膜的层中，其中膜形成的驱动力是静电。在一些具体的实施方案中，经设计多肽的长度为至少15个氨基酸并且该多肽的每个残基的静电荷量级在pH7.0时大于或等于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。在一个实施方案中，相同极性的带电荷残基的数目减去相反极性的残基数目后与多肽中的残基总数的比值在pH 7.0时大于或等于0.5。换句话说，多肽的每个残基的净电荷的量级大于或等于0.5。虽然多肽的长度没有绝对上限，一般而言，适用于LBL沉积的经设计多肽具有的实际长度上限为1000个残基。经设计多肽可包含见于自然界中的序列，例如多肽表位以及为肽提供功能的区域，例如带电荷区，本文也称作表面吸附区，其允许它允许经设计的多肽沉积在多肽多层膜中。

“一级结构”意指在多肽链的氨基酸的连续线性序列，并且“二级结构”意指通过非共价键相互作用(通常是氢键)稳定的多肽链的或多或少规律的结构类型。二级结构的实例包括α-螺旋、β-片层和β转角。

“多肽多层膜”意指包含一种或更多种如上所限定经设计多肽的膜。例如，多肽多层膜包含第一层和第二层，所述第一层包含经设计多肽，所述第二层包含具有与经设计的多肽极性相反之净电荷的聚电解质。例如，如果第一层具有净正电荷，那么第二层具有净负电荷；并且如果第一层具有净负电荷，那么第二层具有净正电荷。第二层包括另一种经设计的多肽或另一种聚电解质。

“基底”意指具有用于吸附来自水溶液的聚电解质的合适表面的固体材料。基底的表面可以具有基本上任何形状，例如，平面、球形、棒状等。基底表面也可以是规则或不规则的。基底可以是晶体。基底可以是生物活性分子。基底的大小范围从纳米尺度到宏观尺度。此外，基底任选地包含数种小的子颗粒。基底可以由有机材料、无机材料、生物活性材料或其组合制造。基底的非限制性实例包括硅片；带电胶体颗粒，例如，CaCO₃或三聚氰胺甲醛的微颗粒；生物细胞，例如红细胞、肝细胞、细菌细胞或酵母细胞；有机聚合物晶格，例如，聚苯乙烯或苯乙烯共聚物晶格；脂质体；细胞器；以及病毒。在一个实施方案中，基底是医疗装置，例如人工心脏起搏器、耳蜗植入剂或支架。

在膜形成期间或之后基底被降解或者以其他方式移除，称作“模板”(用于膜形成)。模板颗粒可以溶解在适当的溶剂中或通过热处理除去。例如，如果使用部分交联的三聚氰胺-甲醛模板颗粒时，可通过温和的化学方法分解模板，例如在DMSO中或通过pH值的改变。模板颗粒溶解后，保留由交替的聚电解质层构成的中空多层壳。

“胶囊”是以空壳或围绕核心的涂层形式的聚电解质膜。核心包含多种不同的包封剂，例如，蛋白质、药物或其组合。直径小于约1μm的胶囊被称为纳米胶囊。直径大于约1μm的胶囊被称为微胶囊。

“交联”意指在两个或更多个分子之间形成共价键或数个键或许多键。

“生物活性分子”意指具有生物效应的分子、大分子或大分子组装。具体的生物效应可在适合的测定中测量，并且归一化生物活性分子的每单位重量或每分子。生物活性分子可被聚电解质膜包封、保留在其背后或包封在聚电解质膜内。生物活性分子的非限制性实例是：药物、药物的晶体、蛋白质、蛋白质的功能片段、蛋白质的复合物、脂蛋白、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖体、活性治疗剂、磷脂、多糖、脂多糖。本文所用的“生物活性分子”还涵盖生物活性的结构，例如，功能性膜片段、膜结构、病毒、病原体、细胞、细胞聚集体和细胞器。可被多肽膜包封或保留在其后的蛋白质的实例是血红蛋白；酶，例如葡萄糖氧化酶、脲酶、溶菌酶等；胞外基质蛋白，例如，纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和胶原蛋白；以及抗体。可被聚电解质包封或保留在其后的细胞的实例是移植的胰岛细胞、真核细胞、细菌细胞、植物细胞和酵母细胞。

“生物相容性”意指在经口摄取、表面施用、经皮施用、皮下注射、肌内注射、吸入、植入或静脉内注射后没有引起显著(substantial)的不利健康影响。例如，生物相容性膜包括当与例如人的免疫系统接触后不引起显著的免疫应答。

“免疫应答”意指细胞或体液免疫系统对在身体的任何地方的物质存在的应答。免疫应答可以以多种方式表征，例如，通过提高识别某个抗原的抗体在血流中的数量。抗体是由B细胞分泌的蛋白质，并且免疫原是诱发免疫应答的实体。人体通过提高血流和其他地方的抗体数量来对抗感染并抑制再感染。

“抗原”意指当引入到易受影响的脊椎动物生物体的组织中后诱发免疫应答(例如，产生特异性抗体分子)的外源物质。抗原含有一个或更多个表位。该抗原可以是纯物质，物质的混合物(包括细胞或细胞碎片)。术语抗原包括合适的抗原决定簇、自身抗原、自抗原、交叉反应抗原、异型抗原、耐受原、变应原、半抗原和免疫原或其一部分，及其的组合，并且这些术语可以互换使用。抗原通常为高分子量并且通常是多肽。将诱发强免疫反应的抗原称作是强免疫原性的。互补的抗体可特异性结合的抗原上的位点称为表位或抗原决定簇。

“抗原性”指组合物产生对组合物特异的抗体或产生细胞介导的免疫应答的能力。

本文使用的术语“表位”和“抗原决定簇”可互换使用并且意指被抗体识别的抗原(例如蛋白质或经设计肽)之结构或序列。通常表位将在蛋白质的表面上。“连续表位”是指包含数个连续氨基酸残基的表位，而不是折叠蛋白质的空间中恰好接触或在受限的区域中的氨基酸残基的表位。“构象表位”包含来自在蛋白质的三维结构中变成接触的蛋白质之线性序列的不同部分的氨基酸残基。为了在抗原和抗体之间发生有效的相互作用，表位对于结合必须是容易可得的。因此，表位或抗原决定簇存在于抗原的天然细胞环境中或仅在变性时暴露。在其天然形式中，它们可以是胞质性的(可溶)、膜相关的或分泌的。表位的数目、位置和大小将取决于在抗体加工期间呈递抗原的多少。

本文所使用的“疫苗组合物”是指在其所施用的哺乳动物中诱发免疫应答的组合物，并且其可保护经免疫的生物体后续免受免疫剂或免疫学交叉反应剂的攻击。与未疫苗接种的生物体相比，保护可完全或部分减轻症状或感染。免疫学交叉反应性剂可以是例如从其来源的亚基肽已用作免疫原的全蛋白(例如，葡糖基转移酶)。或者，免疫学交叉反应剂可以是不同的蛋白质，其全部或部分地被免疫剂诱发的抗体识别。

本文所用的“免疫原性组合物”旨在涵盖在其所施用的生物体中诱发免疫应答的组合物，其可以或可以不保护受免疫的哺乳动物后续免受免疫剂攻击。在一个实施方案中，免疫原性组合物是疫苗组合物。

还通过以下非限制性的实施例举例说明本发明。

实施例

测试方案

小鼠和免疫接种：从Jackson Laboratories获得雌性、6至8周龄的C57BL/6J并安置在NorthEast Life Sciences，New Haven。在使用前使小鼠适应环境至少一周。将微颗粒重悬在PBS中至期望的DP浓度(例如，10μg/100μl/注射)并且在超声波处理10分钟后立即装载注射器并免疫接种。在笫0天、第21天和第42天用混悬液在后脚垫(rear footpad，f.p.)免疫小鼠。皮下(s.c.)免疫接种阳性对照小鼠，在第0天用完全弗氏佐剂(CFA)中的经设计肽(DP)进行或第21天和笫42天用不完全弗氏佐剂(IFA)中的经设计肽(DP)进行；阴性对照小鼠用PBS进行模拟免疫。

ELISA：在第28天(第一次加强后)、笫49天(第二次加强后)和笫58天(攻击后)对小鼠采血，并收获血清用于使用包被T1B肽的ELISA板分析抗体响应。用HRP标记的山羊抗小鼠IgG检测抗体结合。

ELISPOT：在第28天处死小鼠，收获脾并处理成(teased into)单细胞悬液。用指示的IFNγ或IL-5ELISPOT板的最小表位肽再刺激未分级的脾细胞，所述ELISPOT板使用商业试剂(BD Biosciences)和板(Millipore Corporation)并遵循制造商的使用说明书。在AID Viruspot Reader中对每个板中印迹的数目进行计数。

PfPb攻击：如上所述免疫C57BL/6J小鼠。在第56天，用PfPb(用恶性疟原虫的CS基因转染的伯氏疟原虫(Plasmodium bergheii))攻击小鼠。通过麻醉小鼠并允许感染PfPb的蚊子叮咬它们10分钟来完成攻击。攻击后两天，对受攻击的小鼠放血并处死，提取肝RNA用于通过qPCR分析寄生物负荷。

转基因子孢子中和测定(transgenic sporozoite neutralization assay，TSNA)：通过本领域中已知的方法进行TSNA中血清寄生物中和活性。简言之，将1∶5稀释的每个血清样品与PfPb寄生物(用恶性疟原虫的CS基因转染的伯氏疟原虫)在冰上孵育40分钟。将混合物添加至含有HepG2细胞的孔中并在37℃下孵育72小时。通过qPCR测量每种培养物中寄生物18S rRNA水平，并且与用已知量的质粒18S cDNA建立的标准曲线进行比较。通过与含有PfPb和HepG2细胞但没有血清的对照孔进行比较，计算寄生物生长的百分比抑制。

RNA分离和qPCR：攻击后大约40小时，处死小鼠，收获肝脏并用10ml无菌PBS洗涤两次。用polytron匀浆器(Fisher Scientific PowerGen500)在最高设定运行1分钟，将肝脏在10ml TriReagent(Molecular Research Center，cat#TR118)中匀浆。将匀浆物涡旋两分钟并允许在室温(RT)静置10分钟。将澄清的匀浆物收集到无菌的Eppendorf管中，向其添加200μl的氯仿(Sigma C-0549)。将样品涡旋2分钟，允许在室温静置15分钟，然后在4℃以14,000rpm离心15分钟。将水相(450μl)收集到无菌1.5ml Eppendorf管中，向其添加等体积的异丙醇(Sigma405-7)。将样品涡旋10秒，允许在RT静置10分钟，然后在RT以14,000rpm离心10分钟。倾泻出上清液，并且将沉淀物用1ml的70％EtOH(Sigma E7023)洗涤，涡旋10秒，并在RT以14,000rpm离心10分钟。倾泻出上清液，将沉淀在室温下干燥。将干燥的沉淀物重悬于200μl DEPC H₂O(Invitrogen cat#750023)中用于qPCR。

还使用Qiagen RNeasy MiniPrep方案(Qiagen)从TriReagent匀浆物分离RNA，并使用iScript RT Supermix(Bio-Rad)转变成cDNA，各自根据制造商的方案。在CFX96(Bio-Rad)上进行PCR以确定伯氏疟原虫18S rRNA在肝组织中的拷贝数目。使用的引物序列是：

正向5’-AAGCATTAAATAAAGCGAATACATCCTTAC-3’(SEQ ID NO：4)

反向5’-GGAGATTGGTTTTGACGTTTATGTG-3’(SEQ ID NO：5)

使用iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)的循环条件是：95℃ 3分钟，然后[95℃ 20秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒]重复40次。为确定拷贝数目，使用已知浓度的含有伯氏疟原虫18S rRNA序列(NYU)的质粒来构建标准曲线。

实施例1：Pam3Cys.T1B疟疾微颗粒的免疫原性

合成了含有多种T1B构型的一系列DP(参见表1)。T1和B恶性疟原虫环子孢子蛋白抗原的序列如下给出：

T1：DPNANPNVDPNANPNV(SEQ ID NO：1)

B：NANP(SEQ ID NO：2)

CaCO₃核心得自Plasma Chem GmbH，Germany(3μm、介孔(mesoporous)、球形)。PLL和PGA得自Sigma-Aldrich，USA。将PLL，PGA和ACT-2062

(T1BT*K₂₀Y：

DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY(SEQ ID NO：6))溶解在10mM HEPES(pH7.4)中。基本上按照对LbL纳米颗粒所述(Powell等2011.Vaccine 29：558)制造LbL颗粒。用PGA和PLL组装7个基础层后，将膜用200mM磷酸缓冲液(pH 6.5)中的200mM EDC和50mM磺基-NHS交联。用10mM HEPES缓冲液洗涤颗粒两次以移除任何残余的试剂。添加DP(ACT-2062，SEQ ID NO：6)作为第8层以产生微颗粒ACT-1141。洗涤成熟的颗粒并在4℃或RT作为潮湿的沉淀储藏，直到使用。

在溶液相合成期间通过添加丝氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸间隔子延伸DP-2163(T1₃B₅Pf)的N端，随后N端偶联Pam3修饰的半胱氨酸残基，由此并入TLR2配体Pam3Cys以产生DP-2167(Pam3.T1₃B₅Pf)。

表3：微颗粒的列表

SEQ ID NO：7(SKKKK(NANPNVDP)₃(NANP)₅K₂₀Y)

SKKKKNANPNVDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY

用MP-1141、MP-1167或MP-1164免疫C57BL/6小鼠，还包括分别用在CFA中的PBS或DP-2062(T1BT＊(SEQ ID N：6))免疫小鼠作为阴性对照和阳性对照。对在第28天收集的血清的ELISA分析示出含有经Pam₃Cys修饰的DP的MP-1164可与弗氏佐剂中的阳性对照DP-2062(T1BT＊)相当，并且统计学上比含有相同DP但没有Pam₃Cys的MP-1167更有效(P＝0.02，Wilcoxon秩和检验)(图1)。MP-1164也产生了与阳性对照组中一致的抗体同种型谱，包括Th1相关的IgG2c同种型，其由MP-1167或MP-1141最低限度地诱导(图2)，其各自都缺乏Pam₃Cys。经Pam₃Cys修饰的MP-1164与DP 2062肽/CFA阳性对照组一样有效，保护90％的小鼠免受肝阶段感染(图3)。与中和抗体相关的保护在MP-1164组中最强(数据未显示)，在MP-1141中温和(数据未显示)，并且在MP-1167组中较弱(数据未示出)。由此，DP的简单Pam₃Cys修饰产生改进的LbL疫苗，其诱发更强大的抗体响应并提供更高水平的保护以免受寄生物攻击。

实施例2：经Pam₃Cys经设计肽的合成

使用用微波温度控制的Liberty^TM(CEM，Matthews，NC)自动合成仪通过逐步固相多肽合成法合成含有来自疟疾(恶性疟原虫)之环子孢子蛋白的含抗原性序列的经设计肽。使用低负载Rink酰胺聚苯乙烯树脂(0.10mmol)、标准Fmoc氨基酸、HBTU/DIEA活化和常规的双偶联。自动化合成20％的树脂(0.02mmol)后，Fmoc脱保护并用新鲜制备在约1.5mL 20％DCM/DMF中的30mg Pam₃Cys-OH(0.032mmol，Bachem Bioscience目录号#F-2630)、12mg HBTU、8uL DIEA的溶液处理。该浆液搅拌4小时后，树脂过滤并充分洗涤，并通过定性茚三酮测定确认Pam₃Cys的偶联。将树脂在真空下干燥并通过用TFA/三异丙基硅烷/酚/3，6-二氧代-1，8-辛二硫醇/水处理(86∶4∶4∶3∶3)处理两小时切割肽。将粗制肽用醚沉淀，然后通过使用水(0.1％三氟乙酸)/异丙醇梯度的C₄反相HPLC纯化。通过电喷雾质谱(ESMS)确认纯化的肽的鉴定。计算的(平均)MＷ＝8683.4g/mol，实测MＷ＝8682.1g/mol。

实施例3：疟疾微颗粒疫苗ACT-1164(Pam₃-SEQ ID NO：7)的制造

新鲜制备聚-L-谷氨酸、钠盐、聚-L-赖氨酸HBr盐的1.0mg/mL母液(wt/v)，和pH 7的10mM HEPES缓冲液中FITC标记的多聚-L-赖氨酸。将180mg碳酸钙(CaCＯ₃，PlasmaChem GmbH)微颗粒混悬在3.0mL的PGA溶液中并充分涡旋。在室温震荡混合物10分钟，然后离心(2000g，2分钟)，吸出，用10mM的HEPES缓冲液洗涤以除去未连接的聚合物，再次离心并吸出。将颗粒重混悬于3.0mL的PLL-FITC溶液中，震荡10分钟，然后如前离心并洗涤。这些步骤使用PGA和PLL溶液交替重复五次或更多次，直到一共7层组装在颗粒上。然后将颗粒混悬于3.0mL含1.5mg经设计肽ACT-2167的HEPES中。将混合物在室温下振荡10分钟，离心并洗涤两次。沉积的经设计肽的总量通过氨基酸分析测定，实测为0.99mg(66％效率)。颗粒通过荧光显微镜检查，结果为很好地分散(数据未示出)。颗粒作为潮湿的沉淀储存在4℃，持续长达30天。或者，颗粒以30mg/mL混悬在5％甘露醇和0.2％羧甲基纤维素中，在液氮中快速冷冻，在室温下冻干过夜，然后储存在4℃，持续长达12个月。

实施例4：含有Pam₂Cys的经设计肽的替代合成

在如实施例2中所述的固相树脂上合成经设计肽。N端去保护树脂(0.020mol)用制备的约1.5mL 20％DCM/DMF中的29mg Fmoc-Pam₂Cys-OH(0.032mmol，Bachem Bioscience目录号#B-3760)、12mg HBTU、8uL DIEA的溶液处理。该浆液搅拌4小时，树脂过滤并充分洗涤，并通过定性茚三酮测定确认Pam₂Cys的偶联。该树脂通过如下进行N端脱保护：用在DMF中的20％哌啶处理10分钟，充分洗涤并在真空下干燥。通过TFA裂解和实施例2中所描述的C₄HPLC纯化得到粗制肽。

实施例5：将TLR-4配体MPLA并入到3μm疫苗微颗粒

含有7层同聚物和一层经设计肽的疫苗微颗粒组装到如实施例3中描述的3μm CaCO₃颗粒上。将疫苗颗粒以60mg/mL混悬在HEPES缓冲液中，并且将100μL等分试样放置在500μL Eppendorf管中。制备在纯DMSO中的单磷酰脂A的5.0mg/mL母液，并且向100μL等分试样添加0.2μL或2.0μL(MPLA终浓度分别为10μg/mL和100μg/mL)将颗粒涡旋并震荡20分钟，离心，并用HEPES缓冲液洗涤3次。将颗粒重悬至100uL并在基于细胞的TLR-4测定中测试。结果显示MPLA包被的颗粒以剂量依赖的方式刺激TLR-4细胞(图4)。

实施例6：CaCO₃和咪喹莫特的共沉淀

将243mg无水氯化钙和1.0mg咪喹莫特溶解在5.0mL水中的溶液与137mg碳酸钠的溶液在快速搅拌下混合。搅拌持续45-60秒，并且通过离心收集形成的CaCO₃微颗粒。包封在颗粒中的咪喹莫特的量通过将一个等分试样的颗粒溶解到1M HCl中测量，并且测量所产生的澄清溶液在317nm的UV吸光度。

实施例7：将TLR-7配体咪喹莫特并入3μm疫苗微颗粒

如实施例2中所述制备PGA和PLL的新鲜配制溶液。将9.0mg的3μm CaCO₃颗粒混悬在300μL PGA溶液中并震荡10分钟。将颗粒离心，吸出，用10mM HEPES缓冲液洗涤，在300μL缓冲液中重悬，并取出25μL用于UV测定。添加6.0μL咪喹莫特(30μg)的5mg/mL水溶液并震荡颗粒10分钟，然后离心。取出上清液的一份等分试样(25μL)用于UV测定，洗涤颗粒，然后重悬在275μL缓冲液中并取出一份等分试样(25μL)用于UV测定。如实施例3所述添加7层同聚物(PLL、PGA、PLL、PGA、PLL、PGA、PLL)。颗粒混悬在250μL缓冲液中并取出等分试样(25μL)用于UV测定。用125μL 1.0M HCl处理25μL等分试样以溶解颗粒，并且在微滴定板中在317nm处测定所产生的轻微浑浊溶液的OD。UV吸光度示出大部分可溶的咪喹莫特与颗粒结合并且在随后的成层步骤中保持结合(图5)。

实施例8：基于HEK-293细胞测定TLR4激动剂

商业购买用人TLR4、MD2和CD14基因稳定转染的HEK-293细胞系并且使用供应商描述的条件培养。将MPLA的颗粒样品和/或可溶标准品(standard)用DMEM/10％FBS连续稀释，100μl/孔。将TLR4转染的细胞调节至DMEM/10％FBS中2x 10^5细胞/mL，向每孔添加100μl，并且将细胞在37℃孵育过夜。收集上清液并通过使用以下匹配的单克隆抗体对通过夹心ELISA测量分泌的IL-8：将IL-8包被抗体在PBS中稀释至2μg/ml并将生物素化的IL-8检测抗体在ELISA缓冲液中稀释至0.5μg/ml。亲和素-HRP缀合物在ELISA缓冲液中以1∶1000稀释并且TMB基底被用来开发板。用H₂SO₄终止反应后，在450nm处读取光密度。

实施例9：疟疾Pam₃Cys.T1BT＊的免疫原性和效力

用交联的构建体ACT-1200(T1BT＊，bXL)或ACT-1201(Pam₃Cys.T1BT＊，bXL)或者非交联的构建体ACT-1198(T1BT＊，nXL)或ACT-1199(Pam₃Cys.T1BT＊，nXL)在第0天、第28天和第42天经f.p.免疫6至8周龄的雌性C57BL/6J小鼠。构建体在下表中描述：

nXL＝无交联；bXL＝在添加DP前交联的基础层

在第49天收集血清用于通过ELISA确定T1B特异性抗体效价。图6中的结果示出所有构建体诱发了T1B特异性抗体应答。未交联的ACT-1198(T1BT＊)最低效力的制剂。使用同种型特异性检测试剂在ELISA中检测T1B特异性同种型分布。图7示出所有构建体主要诱发IgG₁和IgG_2b同种型(Th2相关的)，而ACT-1199和ACT-1201诱发IgG_2c同种型(Th1相关的，等同于BALB/c品系中的IgG_2a)，产生的谱和效力与由ACT-2062肽在CFA/IFA中诱导的几乎一致。

在第49天，通过ELISPOT测量T细胞应答。用除ACT-1198外的所有构建体免疫小鼠，通过IFNγ和IL-5ELISPOT证明稳固的平衡细胞应答(图8)。值得注意的是，ACT-1200诱发大量的IL-5分泌细胞，而含有Pam3Cys的ACT-1201没有。

这些结果表明，交联或纳入Pam₃Cys均提高微颗粒的效力，并且与未修饰的微颗粒相比，在相同微颗粒中两种修饰的组合产生定量(抗体效价)和定性(抗体同种型和T细胞表型)改进。

没有量词修饰的名词(特别是在所附权利要求书的内容中)被解释为一个/种或更多个/种，除非另有说明或与上相文明显矛盾。本文中所用的术语第一，第二等并不意味着表示任何特定的顺序，而只是为了方便起见以表示多个(例如)层。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)，除非另有说明。值的范围的记载仅旨在用作单独提及落在该范围内的每一个独立的值的简便方法，除非本文另有说明，并且每个独立的值被并入到本说明书中，如同其在本文中单独记载一样。所有范围的端点都包括在范围和独立组合内。本文中所述的所有方法可以以适合的顺序执行，除非本文中另有说明，或以其他方式与上下文明显矛盾。任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明且不构成对本发明的范围的限制，除非另有声明。在说明书中没有语言应该被解释为指示任何未要求保护的要素对于实践本文中所用的发明是必须的。

虽然已参照示例性实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当理解，可进行多种改变并且等价物可用于取代其要素，而不背离本发明的范围。此外，可根据本发明的教导进行多种修改以适应特定情况或材料，而不脱离其基本范围。因此，意图是本发明不限于公开的考虑用于实施本发明的最佳方式的特定实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求书的范围内的所有实施方案。本发明涵盖以其所有可能的变化形式的以上所述要素的任何组合，除非本文另有说明或以其他方式与上下文明显矛盾。

以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：

1.组合物，其包含：

第一多层膜，其包含多个带相反电荷的聚电解质层，其中所述多层膜中的所述聚电解质层之一包含第一抗原性聚电解质，其中所述第一抗原性聚电解质包含病毒、细菌、真菌或寄生物的多肽表位，

其中所述多层膜包含toll样受体配体，并且

其中所述多层膜中的所述聚电解质包含聚阳离子材料或聚阴离子材料，其具有大于1000的分子量和每分子至少5个电荷。

2.项1所述的组合物，其中所述第一抗原性聚电解质是多肽。

3.项1所述的组合物，其中所述TLR配体与所述第一抗原性聚电解质共价连接。

4.项1所述的组合物，其中所述第一多层膜沉积在核心颗粒上。

5.项1所述的组合物，其中所述toll样受体配体与所述多层膜中的第二聚电解质共价连接。

6.项1所述的组合物，其中所述toll样受体配体不与聚电解质共价连接，并且与所述多层膜的所述聚电解质层之一共沉积。

7.项1所述的组合物，其还包含第二多层膜，所述第二多层膜包含多个带相反电荷的聚电解质层，其中所述第二多层膜的所述层之一包含第二抗原性聚电解质，

其中所述第二抗原性聚电解质包含病毒、细菌、真菌或寄生物的多肽表位，其中所述第一和第二抗原性聚电解质包含来自相同或不同生物的不同多肽表位。

8.项7所述的组合物，其中所述第一和第二抗原性聚电解质是多肽。

9.项8所述的组合物，其中所述第一和第二多层膜沉积到核心颗粒上。

10.项1所述的组合物，其中所述第一多层膜沉积在包含所述toll样受体配体的核心颗粒上。

11.项1所述的组合物，其中所述toll样受体配体结合TLR1、TLR2、TL3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9受体。

12.项1所述的组合物，其中所述TLR配体是N-棕榈酰基-S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸、Pam₂Cys[S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸]、单磷脂A、咪喹莫特或其组合。

13.项1所述的组合物，其中所述第一聚电解质是多肽并且所述N-棕榈酰基-S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸与所述多肽共价连接。

14.项1所述的组合物，其包含两种或更多种不同的toll样受体配体。

15.组合物，其包含：

第一多层膜，其包含多个带相反电荷的聚电解质层，其中所述第一多层膜中的所述聚电解质层之一包含第一抗原性聚电解质，其中所述第一抗原性聚电解质包含病毒、细菌、真菌或寄生物的多肽表位，

第二多层膜，其包含多个带相反电荷的聚电解质层，其中所述第二多层膜中的所述聚电解质层之一包含第二聚电解质，其中所述第二聚电解质包含toll样受体配体，并且

其中所述第一和第二多层膜中的所述聚电解质包含聚阳离子材料或聚阴离子材料，其具有大于1000的分子量和每分子至少5个电荷。

16.项15所述的组合物，其中所述第一抗原性聚电解质和所述第二聚电解质是多肽。

17.项15所述的组合物，其中所述toll样受体配体结合TLR1、TLR2、TL3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9受体。

18.项17所述的组合物，其中所述TLR配体是N-棕榈酰基-S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸、Pam₂Cys[S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸]、单磷脂A、咪喹莫特或其组合。

19.项15所述的组合物，其中所述第二聚电解质是多肽并且所述N-棕榈酰基-S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸与所述多肽共价连接。

20.项15所述的组合物，其中所述第一和第二多层膜沉积到不同的核心颗粒上。

21.项15所述的组合物，其还包含第三多层膜，所述第三多层膜包含多个带相反电荷的聚电解质层，其中所述第三多层膜中的所述聚电解质层之一包含第三聚电解质，其中所述第三聚电解质包含第二toll样受体配体，其中所述第一聚电解质中的toll样受体配体与所述第二toll样受体配体不同。

22.项1所述的组合物，其中所述多层膜包含多肽聚电解质并且是共价交联的。

23.项22所述的组合物，其中所述共价交联是涉及氨基酸侧链官能团的酰胺键。

24.在脊椎动物生物体中诱发免疫应答的方法，其包括向所述脊椎动物生物体施用项1至23中任一项所述的组合物。