新的欧洲型猪生殖与呼吸综合征病毒株的制作方法

技术领域：
本发明涉及一种欧洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(EuropeanPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus；PRRSV)的活减毒株、产生所述病毒株的方法、基于所述病毒株的疫苗、用于产生所述疫苗的方法，以及其用于治疗猪的用途。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)被许多人视为目前影响全世界养猪业的最重要的疾病。1987年，该综合征首先在美国描述为“神秘猪疾病”且迅速传遍全球。其引起生殖力严重降低，致使因继发性感染引起的死亡率增加，且导致饲料转化率及平均日增重降低。不幸的是，已证明难以控制引起PRRS的病毒。PRRS病毒(PRRSV)为一种归类于动脉炎病毒家族(familyArteriviridae)的包膜单链RNA病毒(Cavanaugh,1997)。其引起广泛的猪疾病，该猪疾病首先于1987年在美国描述为“神秘猪疾病”(Hill,1990)。该疾病在所有年龄组的猪中均表现为呼吸疾病，引起一些较年轻的猪死亡以及在繁殖适龄母猪中产生严重的生殖问题。PRRSV可经由受感染猪与易感染猪之间的直接接触传播且常常如此。在极短距离内也可能通过空气或经由精液传播。一旦感染，病毒可在成年猪血液中保留约两周，且在受感染猪中保留1至2个月或更长时间。受感染公猪可持续将病毒排在精液中长达100天以上。此长期病毒血症显著提高传播的可能性。此外，PRRS病毒可在妊娠期倒数第三期期间穿过胎盘，感染子宫内的仔猪且引起死胎或产下弱仔猪。所有类型及规模的畜群，包括健康状态良好或一般的或者来自室内或室外单元的畜群，均可感染PRRS病毒。感染畜群可能遭遇严重的生殖力降低，以及断乳后肺炎程度提高且生长缓慢。生殖期通常持续两至三个月；然而，断乳后问题经常变成地方病。生殖疾病的特征为在妊娠后期影响母猪与小母猪的流产爆发。在妊娠约109天及112天过早产下小猪。死胎及产下弱仔猪的数目增加且引起断乳前死亡率显著增加。传统上已在养殖场，特别是连续流动养殖场中见到呼吸期。然而，也可在肥育畜中见到作为猪呼吸疾病综合症(porcinerespiratorydiseasecomplex；PRDC)的一部分的由PRRS病毒引起的呼吸问题。生长速率会降低，不能出售的猪的百分比增加，且断乳后死亡率升高。诊断结果指示存在与PRRS病毒相关联的高程度肺炎，以及一般视为继发感染原的多种其他微生物。细菌分离株可尤其包括猪链球菌(Streptococcussuis)、猪嗜血杆菌(Haemophilussuis)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、猪放线杆菌(Actinobacillussuis)、猪肺炎霉浆菌(Mycoplasmahyopneumoniae)及多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)。通常涉及的病毒剂包括猪流感病毒及猪呼吸道冠状病毒。患病猪很少对高水平的药物治疗起反应，且全进/全出(all-in/all-out)系统已无法控制该疾病。PRRSV病毒以两种称为“美国”型与“欧洲”型的基因型存在，这种基因型共享约50％序列同源性(DeaS等人，(2000).ArchVirol145:659-88)。此两种基因型也可以其免疫性质而加以区分。有关各种分离株的大部分序列信息是基于结构蛋白，即仅占病毒基因组约4％的包膜蛋白GP5，而关于非结构蛋白(nsp)所知甚少。PRRSV的分离及疫苗的制造已在多个公开案中描述(WO92/21375、WO93/06211、WO93/03760、WO93/07898、WO96/36356、EP0676467、EP0732340、EP0835930)。疫苗接种为减轻PRRS负担的关键方法，因为自PRRS感染恢复的猪将发展免疫反应，此免疫反应在正常情况下将保护猪免遭相同病毒株再次感染。然而，PRRS病毒能够发生变化(通过突变或重组的方式)；因此，可能出现新的病毒株。在这种状况下，病毒株之间的交叉保护可能不存在，且在先前已感染的农场中可能观察到新的爆发。因此，持续需要其他疫苗。技术实现要素：本发明涉及欧洲基因型的经改良修饰的活PRRS疫苗，及可用于制造所述疫苗的新PRRSV株。特别是，本发明提供经改良的PRRS病毒株，其已根据布达佩斯条约的规定保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号ECACC11012501及ECACC11012502(各自于2011年1月25日保藏)下，或上述病毒株之一的任何后代或子代。在具体实施方案中，本发明描述一种欧洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，其为保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号ECACC11012501或登录号ECACC11012502下的病毒株。PRRSV的特征在于通过在细胞培养物中传代至少36次来使该病毒减毒，使得当将经修饰的病毒给予至易感染PRRSV的猪或其他哺乳动物时，其无法引起PRRSV疾病的临床征象，但能够诱导使哺乳动物对PRRSV的病原性形式免疫的免疫反应。亦涵盖一种制备保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号ECACC11012502下的活减毒PRRSV或自保藏在登录号ECACC11012501下的亲本株减毒的PRRSV的方法，其包括使MA104生长的欧洲型PRRSV适应非MA104哺乳动物细胞。本发明的另一方面涵盖一种用于保护猪免遭PRRSV感染的疫苗，其包含保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号ECACC11012502下的活减毒PRRSV或自保藏在登录号ECACC11012501下的亲本株减毒的PRRSV及药学上可接受的载剂。该种疫苗宜进一步包含一或多种非PRRSV的减毒或钝化病原体或其抗原性物质。举例而言，非PRRSV病原体可选自假狂犬病毒(Pseudorabiesvirus)、猪流感病毒(Porcineinfluenzavirus)、猪细小病毒(Porcineparvovirus)、传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、猪丹毒杆菌(Erysipelorhusiopathiae)、支气管败血性博德氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)、猪霍乱沙门氏杆菌(Salmonellacholerasuis)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、猪链球菌(Streptococcussuis)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)及胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)。在其他实施方案中，疫苗可进一步包含一或多种选自以下的其他欧洲型PRRSV株：保藏在登录号莱利斯塔病毒株(Lelystadvirusstrain)(莱利斯塔物质(CDI-NL-2.91))下的PRRSV株，或其他病毒株，诸如保藏在登录号ECACC04102703、ECACC04102702、ECACC04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCCVR2332、VR2385、VR2386、VR2429、VR2474及VR2402；CNCMI-1102、CNCMI-1140、CNCMI-1387、CNCMI-1388或ECACCV93070108下的病毒株；或实际上可为美国型株，诸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC登录号VR-2332、ATCC登录号VR-2368；ATCCVR-2495；ATCCVR2385、ATCCVR2386、ATCCVR2429、ATCCVR2474及ATCCVR2402。预期疫苗可包含适于皮内或肌内应用的载剂。在一些实施方案中，疫苗呈冷冻干燥形式。在具体实施方案中，疫苗包含至少约107个病毒粒子。本发明的另一方面涉及一种制备用于对抗PRRS的活减毒疫苗的方法，其包括将保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号ECACC11012502下的活减毒PRRSV病毒或自保藏在登录号ECACC11012501下的亲本株减毒的PRRSV与药学上可接受的载剂混合。在所述方法中，活减毒PRRSV优选可进一步包含一或多种选自保藏在登录号ECACC04102703、ECACC04102702、ECACC04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387及CNCM登录号I-1388下的PRRSV株的其他欧洲型PRRSV株。在一些实施方案中，活减毒PRRSV可进一步包含佐剂。亦涵盖一种使猪对猪生殖与呼吸综合征(PRRS)免疫的方法，该方法包括向猪给予包含活的猪生殖与呼吸综合征病毒与药理学相容的载剂的混合物的疫苗组合物的步骤，该病毒包含PRRS94881病毒，其在细胞培养物中传代至少36次以修饰该病毒，以使得当经修饰的病毒给予至易感染PRRS的猪或其他哺乳动物时，其无法引起PRRS疾病的临床征象，但能够诱导使哺乳动物对PRRS的病原性形式免疫的免疫反应。在一些实施方案中，进行该方法，其中猪在疫苗接种后无肺损伤。在其他实施方案中，相比于接种Porcilis疫苗，猪在疫苗接种后肺损伤较少。本发明的另一方面涉及一种具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:10中所述的序列具有至少95％同源性的核苷酸序列的PRRS病毒。亦涵盖一种PRRS病毒，其包含至少一个编码与SEQIDNO:2至9或SEQIDNO:11至SEQIDNO:18中所述的任何序列具有至少98％一致性的蛋白的ORF。亦涵盖一种PRRS病毒，其具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:10的核苷酸序列或者SEQIDNO:1或SEQIDNO:2任一者的片段的核苷酸序列，其中该片段编码选自以下的ORF：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17及SEQIDNO:18。本发明进一步涉及一种用于接种猪科动物的亚单位疫苗，其中该疫苗包含一或多种核苷酸，所述核苷酸编码选自以下的ORF：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17及SEQIDNO:18。本发明的另一方面涉及一种用于接种猪科动物的亚单位疫苗，其中该疫苗包含一或多种选自以下的核苷酸：SEQIDNO:19；SEQIDNO:20；SEQIDNO:21；SEQIDNO:22；SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；SEQIDNO:26；SEQIDNO:27；SEQIDNO:28；SEQIDNO:29；SEQIDNO:30；SEQIDNO:31；SEQIDNO:32；SEQIDNO:33；及SEQIDNO:34。亦涵盖一种组合物，其包含一或多种蛋白，其具有选自以下的序列：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17及SEQIDNO:18。亦涵盖一种分离的核酸，其包含选自以下的序列：SEQIDNO:19；SEQIDNO:20；SEQIDNO:21；SEQIDNO:22；SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；SEQIDNO:26；SEQIDNO:27；SEQIDNO:28；SEQIDNO:29；SEQIDNO:30；SEQIDNO:31；SEQIDNO:32；SEQIDNO:33；SEQIDNO:34。本发明进一步涉及一种重组表达载体及/或包含所述表达载体的疫苗，其中所述载体包含编码一或多种选自以下的PRRSVORF的核酸序列(该核酸序列可操作地连接于启动子)：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17及SEQIDNO:18。在所述实施方案中，编码ORF的核酸可优选选自以下：SEQIDNO:19；SEQIDNO:20；SEQIDNO:21；SEQIDNO:22；SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；SEQIDNO:26；SEQIDNO:27；SEQIDNO:28；SEQIDNO:29；SEQIDNO:30；SEQIDNO:31；SEQIDNO:32；SEQIDNO:33；及SEQIDNO:34。具体的，本发明涉及以下项：1.一种欧洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，其为保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号ECACC11012501或登录号ECACC11012502下的病毒株。2.如项1的PRRSV，其中该病毒通过在细胞培养物中传代至少36次来减毒，以使得当该经修饰的病毒给予至易感染PRRSV的猪或其他哺乳动物时，其无法引起PRRSV疾病的临床征象，但能够诱导使该哺乳动物对PRRSV的病原性形式免疫的免疫反应。3.一种制备如项1的活减毒PRRSV的方法，其包括使MA104生长的欧洲型PRRSV适应非MA104哺乳动物细胞。4.一种用于保护猪免遭PRRSV感染的疫苗，其包含如项1的活减毒PRRSV及药学上可接受的载剂。5.如项4的疫苗，其进一步包含一或多种非PRRSV的减毒或钝化病原体或其抗原性物质。6.如项5的疫苗，其中该非PRRSV病原体选自假狂犬病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌、猪丹毒杆菌、支气管败血性博德氏杆菌、猪霍乱沙门氏杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体及胸膜肺炎放线杆菌。7.如项4的疫苗，其进一步包含一或多种选自以下的其他欧洲型PRRSV株：保藏在登录号莱利斯塔病毒株(莱利斯塔物质(CDI-NL-2.91))下的PRRSV株，或其他病毒株，诸如保藏在登录号ECACC04102703、ECACC04102702、ECACC04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCCVR2332、VR2385、VR2386、VR2429、VR2474及VR2402；CNCMI-1102、CNCMI-1140、CNCMI-1387、CNCMI-1388或ECACCV93070108下的病毒株；或实际上可为美国型株，诸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC登录号VR-2332、ATCC登录号VR-2368；ATCCVR-2495；ATCCVR2385、ATCCVR2386、ATCCVR2429、ATCCVR2474及ATCCVR2402。8.如项4的疫苗，其包含适于皮内或肌内应用的载剂。9.如项4的疫苗，其呈冷冻干燥形式。10.如项4的疫苗，其中该疫苗包含至少约107个病毒粒子。11.一种制备用于对抗PRRS的活减毒疫苗的方法，其包括混合如项1的活减毒PRRSV与药学上可接受的载剂。12.如项11的方法，其中该活减毒PRRSV进一步包含一或多种选自以下的其他欧洲型PRRSV株：保藏在登录号ECACC04102703、ECACC04102702、ECACC04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387及CNCM登录号I-1388下的PRRSV株。13.如项11的方法，其中该活减毒PRRSV进一步包含佐剂。14.一种使猪对猪生殖与呼吸综合征(PRRS)免疫的方法，该方法包括向猪给予疫苗组合物的步骤，其中该疫苗组合物包含活的猪生殖与呼吸综合征病毒与药理学相容的载剂的混合物，该病毒包含在细胞培养物中传代至少36次的PRRS94881病毒以修饰该病毒，以使得当该经修饰的病毒给予至易感染PRRS的猪或其他哺乳动物时，其无法引起PRRS疾病的临床征象，但能够诱导使该哺乳动物对PRRS的病原性形式免疫的免疫反应。15.如项14的方法，其中该猪在疫苗接种后未呈现肺损伤。16.如项14的方法，其中相比于用Porcilis疫苗接种，该猪在疫苗接种后呈现较少肺损伤。17.一种PRRS病毒，其具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:10中所述的序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。18.一种PRRS病毒，其包含至少一个编码与SEQIDNO:2至9或SEQIDNO:11至SEQIDNO:18中所述的任何序列具有至少98％一致性的蛋白的ORF。19.一种PRRS病毒，其具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:10的核苷酸序列或者SEQIDNO:1或SEQIDNO:2任一者的片段的核苷酸序列，其中该片段编码选自以下的ORF：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17及SEQIDNO:18。20.一种用于接种猪科动物的亚单位疫苗，其中该疫苗包含一或多种核苷酸，所述核苷酸编码选自以下的ORF：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17及SEQIDNO:18。21.一种用于接母猪科动物的亚单位疫苗，其中该疫苗包含一或多种选自以下的核苷酸：SEQIDNO:19；SEQIDNO:20；SEQIDNO:21；SEQIDNO:22；SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；SEQIDNO:26；SEQIDNO:27；SEQIDNO:28；SEQIDNO:29；SEQIDNO:30；SEQIDNO:31；SEQIDNO:32；SEQIDNO:33；及SEQIDNO:34。22.一种组合物，其包含一或多种蛋白，其具有选自以下的序列：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17及SEQIDNO:18。23.一种分离的核酸，其包含选自以下的序列：SEQIDNO:19；SEQIDNO:20；SEQIDNO:21；SEQIDNO:22；SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；SEQIDNO:26；SEQIDNO:27；SEQIDNO:28；SEQIDNO:29；SEQIDNO:30；SEQIDNO:31；SEQIDNO:32；SEQIDNO:33；及SEQIDNO:34。24.一种重组表达载体，其包含编码一或多种选自以下的PRRSVORF的核酸序列：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17及SEQIDNO:18，所述核酸序列可操作地连接于启动子。25.如项24的重组表达载体，其中编码所述ORF的该核酸选自以下：SEQIDNO:19；SEQIDNO:20；SEQIDNO:21；SEQIDNO:22；SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；SEQIDNO:26；SEQIDNO:27；SEQIDNO:28；SEQIDNO:29；SEQIDNO:30；SEQIDNO:31；SEQIDNO:32；SEQIDNO:33；及SEQIDNO:34。26.一种疫苗，其包含如项24或25中任一项的重组表达载体。附图说明图1A：使用欧洲型攻毒(challange)病毒株的呼吸攻毒模型中咳嗽评分的临床观察结果。图1B：使用欧洲型攻毒病毒株的呼吸攻毒模型中总临床评分的临床观察结果。图2：使用欧洲型攻毒病毒株的呼吸攻毒模型中的直肠温度测量。图3：使用欧洲型攻毒病毒株的呼吸攻毒模型中的平均日增重测量。图4：使用欧洲型攻毒病毒株的呼吸攻毒模型中如经由定量PCR所指示的PRRS病毒血症。图5：使用欧洲型攻毒病毒株的呼吸攻毒模型中如通过ELISA所指示的PRSS血清学。图6：使用欧洲型攻毒病毒株的呼吸攻毒模型中肺损伤的宏观检验。图7A-C：组织病理学测量。图7A显示平均宏观肺损伤；图7B显示对照动物组织病理学；图7B显示PRRS感染动物组织病理学。图8：显示RT-PCT时间PCR结果，其描绘经欧洲型PRRS94881疫苗接种的动物中的病毒血症％。图9：大规模生产欧洲型PRRS94881的并行方法。发明详述本发明提供治疗猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染或降低其严重程度的方法，以及预防PRRSV感染的方法。一般而言，该方法用于治疗猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染或降低其严重程度或发病率。“治疗或降低严重程度或发病率”是指降低通常与感染相关的临床征象、症状及/或病理性征象的严重程度，直至且包括预防任何所述征象或症状。“病理性征象”是指在显微镜下或在尸检期间发现的感染迹象(例如肺损伤)。该方法一般包括向规定年龄或年龄范围的猪给予治疗量的PRRSV抗原的步骤。举例而言，在本发明的一个方面中，一治疗量的PRRSV抗原可给予约三周龄或更小的仔猪，且不同治疗量的抗原可给予约3周龄与4周龄之间的猪。类似地，更为不同的治疗量可给予约四周龄与十六周龄之间(或此范围内的任何年龄，例如五周至六周龄、九周至十五周龄、七周至十周龄等)的猪或超过十六周龄的猪，诸如成年母猪。在具体实施方案中，本发明涉及一种减毒的非典型PRRSV株及相应经改良修饰的活疫苗，所述疫苗对此新发现的典型PRRSV株赋予有效免疫力。“有效免疫力”是指疫苗预防可引起疾病实质性临床征象的猪PRRSV感染，包括非典型PRRSV感染的能力。应了解，经免疫接种的猪可能对PRRSV呈血清反应阳性或不对PRRSV呈血清反应阳性，但猪未显示任何实质性临床症状。在优选形式中，本发明的疫苗包括毒力已减弱的活欧洲型PRRS活病毒。所得减毒病毒已显示在经过攻毒的对照宿主动物研究中无毒性且赋予有效免疫力。欧洲型PRRS的此特定病毒株毒力不如其他强，且因此，作为疫苗候选者，其为有吸引力的选择。PRRSV94881亲本株未在怀孕母猪中引起严重的非典型PRRS疾病，亦未在幼猪中引起严重肺损伤。此病毒株最初在NorthRhineWestphalia(Germany)自患有严重呼吸病症的三周龄仔猪分离。随后该病毒株经由在MA104细胞中连续传代进行减毒。该减毒株由BioscreenGmbH,Mendelstrasse11,48149,Muenster,Germany于2011年1月25日保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)(PortonDown，Salisbury，Wiltshire，SP40JG，GreatBritain)且给予登录号11012502。此减毒病毒为一种优选的种原病毒(MasterSeedVirus，MSV)，其随后传代且开发为一种有效的PRRSV疫苗。该命名为94881的毒性亲本株亦由BioscreenGmbH,Mendelstrasse11,48149,Muenster,Germany根据布达佩斯条约于2011年1月25日保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)(PortonDown，Salisbury，Wiltshire，SP40JG，GreatBritain)且给予登录号11012501。在某些例示性实施方案中，经修饰的活病毒疫苗经由肌内注射对猪以1ml的剂量进行测试且对母猪以2ml的剂量进行测试，且显示有效产生保护性免疫力。使用经典病毒学方法实现病毒传代以使其减毒。特别是，亲本分离株PRRS94881经由在MA104细胞中连续传代以在初始分离后达成108代的最大传代来进行活体外减毒。简言之，该物质在T-25cm2或T-75cm2烧瓶中以每周约1至2代传代，总共传代108代。将具有约12-30mL补充有6％胎牛血清(FBS)的最低必需培养基(MEM)的汇合MA104细胞培养物用100至300μl该病毒接种。培养物在湿润腔室培育箱中于37℃及4-6％CO2下培育3-7天。一旦培养物达到>25％细胞损伤效应(CPE)，则通过抽取上清液收获烧瓶。一部分上清液转送至新的烧瓶内且将2mL收获物等分储存在-60℃至-80℃。本领域技术人员利用常规技术能够确定保藏在ECACC登录号11012502下的减毒病毒的基本核酸序列。因此，本发明进一步涵盖保藏在ECACC登录号11012502下的减毒PRRSV94481所特有的核酸序列。优选地，本发明进一步涵盖与SEQIDNO:1或SEQIDNO:10的序列共享至少95％序列同源性的PRRS病毒核酸序列，因为所述病毒可能在动物以含有所述同源序列的减毒病毒进行疫苗接种后有效赋予其免疫力。SEQIDNO:1中所示的序列为减毒PRRS94881MSV的全长序列且具有14843bp的全长序列。此序列的ORF1至7已注释如下：SEQIDNO:10中所示的序列为亲本PRRSV94881株第5代的全长序列且具有14843bp的全长序列。此序列的ORF1至7已注释如下：伴随此新减毒欧洲型PRRS病毒株的分离，可产生改良的PRRS疫苗，其含有反映目前此领域中发现的毒性PRRS株的最新PRRS株。特别是，新减毒欧洲型PRRS病毒可用以制备经修饰的活疫苗(MLV)。经修饰的活疫苗的特征在于其含有可在猪中复制，但不引起PRRS临床疾病的活病毒。此外，在给予时，其在猪中诱导免疫反应，该免疫反应一般对后续病原性PRRS病毒感染产生显著的防护。显示所述特征的病毒通常称为减毒病毒。此外，本发明提供PRRSV94881的亲本株与减毒株两者的ORF序列的详情。因此，预期本领域技术人员可在亚单位疫苗中采用本文所示的任一或多种ORF的序列。如上所述，一般而言，可通过在可感染病毒的适合宿主细胞中重复传代，直至病毒显示所需性质，自病原性病毒分离株产生减毒病毒(WO92/21375、WO93/06211、WO93/03760、WO93/07898、WO96/36356、EP0676467、EP0732340、EP0835930)。或者，其可经由使用感染性纯系，通常使用病毒基因组的全长互补DNA转录物进行重新遗传工程改造而产生(WO98/18933、EP1018557、WO03/062407、Nielsen等人，JVirol2003，77:3702-3711)。在一优选实施方案中，本发明涉及一种含有欧洲基因型94481的减毒PRRS病毒的MLV，该病毒自保藏在ECACC登录号11012501下的亲本病毒减毒。优选MLV含有保藏在ECACC登录号11012502下的本发明的减毒病毒。在另一方面中，本发明涵盖于2011年1月25日保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)(PortonDown，Salisbury，Wiltshire，SP40JG，GreatBritain)登录号ECACC11012502(MLV的减毒株)及11012501(亲本株)下的PPRS病毒的子代或后代的制备与分离。因此，本发明延及经由以相同或相异形式自保藏株繁殖或繁育的PRRS病毒株，尤其具有保藏株的基本特征的后代。在持续繁殖后，所述病毒株可获得突变，大部分突变不会显著改变这些病毒株的性质。本发明的病毒株亦可进一步修饰以赋予所述病毒株其他所需性质。此可通过经典繁殖及选择技术，如在适合宿主细胞中持续繁殖以扩展减毒表型来达成。或者，病毒株可通过适合基因工程改造技术，使这些病毒株的基因组的核酸序列定向突变来进行遗传修饰。PRRSV的基因组已获得完全或部分定序(Conzelmann等人，1993；Meulenberg等人，1993a；Murtaugh等人，1995)，且除RNA依赖性RNA聚合酶(ORF1a及1b)外，亦编码六种结构蛋白，其中包括四种称为GP2(ORF2)、GP3(ORF3)、GP4(ORF4)及GP5(ORF5)的包膜糖蛋白、一种非糖基化膜蛋白M(ORF6)及核衣壳蛋白N(ORF7)(Meulenberg等人，1995，1996；vanNieuwstadt等人，1996)。欧洲型及美国型PRRSV株的免疫学表征及核苷酸定序已鉴别出PRRSV株内位于结构病毒蛋白中的次要抗原差异(Nelson等人，1993；Wensvoort等人，1992；Murtaugh等人，1995)。已将本发明的PRRS94881MSV与欧洲参考病毒株莱利斯塔病毒(LV)相比较，表明8种不同病毒基因中的核苷酸同源性在85.40％至95.09％的范围内，并且两种病毒株之间的氨基酸一致性为86.39％至97.27％。可鉴别出相比于LV，94881MSV的ORF1a中存在两个缺失。举例而言，94881MSV的ORF1a与莱利斯塔病毒具有85.40％核苷酸同源性，使得氨基酸一致性为86.39％；94881MSV的ORF1b与莱利斯塔病毒具有92.12％核苷酸同源性，使得氨基酸一致性为97.27％；94881MSV的ORF2与莱利斯塔病毒具有91.07％核苷酸同源性，使得氨基酸一致性为90.76％；94881MSV的ORF3与莱利斯塔病毒具有90.98％核苷酸同源性，使得氨基酸一致性为89.43％；94881MSV的ORF4与莱利斯塔病毒具有90.58％核苷酸同源性，使得氨基酸一致性为87.43％；94881MSV的ORF5与莱利斯塔病毒具有90.43％核苷酸同源性，使得氨基酸一致性为88.56％；94881MSV的ORF6与莱利斯塔病毒具有95.02％核苷酸同源性，使得氨基酸一致性为97.11％；94881MSV的ORF7与莱利斯塔病毒具有95.09％核苷酸同源性，使得氨基酸一致性为92.97％。实际上，本发明的PRRS94881病毒可制成嵌合病毒，其中修饰ECACC登录号11012502下的PRRS病毒或实际上保藏在ECACC登录号11012501下的亲本株的骨架，以用来自不同PRRS病毒株的相应ORF置换ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6或ORF7中一或多者的内源性序列。举例而言，不同PRRS病毒株可为不同的欧洲型株，诸如莱利斯塔病毒株(莱利斯塔物质(CDI-NL-2.91))，或其他株，诸如保藏在登录号ECACC04102703、ECACC04102702、ECACC04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCCVR2332、VR2385、VR2386、VR2429、VR2474及VR2402；CNCMI-1102、CNCMI-1140、CNCMI-1387、CNCMI-1388或ECACCV93070108下的株；或实际上可为美国型株，诸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC登录号VR-2332、ATCC登录号VR-2368；ATCCVR-2495；ATCCVR2385、ATCCVR2386、ATCCVR2429、ATCCVR2474及ATCCVR2402。用于制备经修饰的序列的重组技术为本领域技术人员所熟知，且通常采用构筑病毒基因组的全长互补DNA副本(感染性纯系)，接着可通过DNA重组及操纵方法(如定点诱变等)进行修饰。以此方式，可修饰例如病毒蛋白的抗原性位点或酶促性质。文献中已报导欧洲及北美基因型的PRRS病毒株的感染性纯系。适于本发明疫苗的本发明PRRS病毒株可通过此项技术中已知的方法生长及收获，例如通过在如类人猿细胞株MA-104、Vero细胞或猪肺泡巨噬细胞的适合宿主细胞中繁殖。PRRSV优先在肺泡肺巨噬细胞中生长(Wensvoort等人，1991)。诸如CL2621及自猴肾细胞株MA-104选殖的其他细胞株等几个细胞株(Benfield等人，1992；Collins等人，1992；Kim等人，1993)亦容易受病毒感染。因此，本发明的优选实施方案为包含保藏在ECACC登录号11012501、11012501、登录号ECACC04102703、ECACC04102702、ECACC04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387及CNCM登录号I-1388下的任一PRRSV株PRRS病毒的疫苗以及这些株或其后代的任何组合。在具体实施方案中，PRRS病毒94881以如下方法生长，其中病毒与宿主细胞在同一天一起并行接种至生物反应器中，如图9中所示。产生PRRS病毒94881的方法的其他特征可如与本文同时申请的美国临时申请案(名称为“PRRSV的商业化规模生产方法(ACommercialscaleprocessforproductionofPRRSV)”，的申请号为61/444,071)中所述。虽然此为一种生长PRRSV94881的方法，但应了解该病毒可根据本领域技术人员已知的任何已知方法繁殖。优选地，本发明的疫苗为经修饰的活疫苗，其包含一或多种这些活株于适合载剂中，但钝化病毒亦可用以制备灭活疫苗(KV)。MLV通常调配成允许每一剂量给予101至107个病毒粒子，优选每一剂量103至105个粒子，更优选为每一剂量104至105个粒子(4.0-5.0log10TCID50)。KV可基于每一剂量103至1010个病毒粒子的钝化前效价调配。疫苗可包含药学上可接受的载剂，例如生理盐溶液。猪可经由口鼻途径感染PRRSV。肺中的病毒由肺的肺泡巨噬细胞吸收且在这些细胞中在9小时内完成PRRSV复制。PRRSV在12小时内自肺行进至肺淋巴结，且在3天内行进至周围淋巴结、骨髓及脾。在这些部位，仅少许细胞对病毒抗原呈染色阳性。病毒在血液中存在至少21天的时间且通常时间长得多。7天后，在血液中发现PRRSV抗体。PRRS感染的猪中病毒与抗体的组合存在表明尽管存在抗体，但病毒感染可持续长时间，不过程度较低。在至少7周期间，肺中的肺泡细胞群体不同于正常SPF肺。本发明的疫苗可以活病毒的冷冻干燥制剂形式提供，其用溶剂重组，以产生注射用溶液。溶剂可例如为水、生理盐水或缓冲液或辅助溶剂。溶剂可含有佐剂。重组疫苗接着可注射至猪中，例如以肌内或皮内注射液形式注射至颈中。对于肌内注射，可应用2ml体积，对于皮内注射，其通常为0.2ml。因此，在另一方面中，本发明为一种疫苗产品，其在各别容器中包含病毒的冷冻干燥组合物及重组用溶剂，且视情况进一步含有包含使用说明书的活页或标签。本发明的疫苗不仅可包含一或多种上述株，而且亦可包括对PRRS或其他猪病毒性或细菌性疾病(如猪环状病毒或经典猪瘟病毒)具有活性的其他组分。因此，本发明进一步涉及所述疫苗，其特征在于其含有至少一种对非PRRS的猪疾病具有活性的其他抗原。举例而言，所述其他抗原可包括猪肺炎支原体、PCV2、SIV、副猪嗜血杆菌、猪丹毒杆菌、猪链球菌、猪放线杆菌、钩端螺旋体属(Leptospirasp.)细小病毒及其类似物。此外，疫苗可包含某些药学上或兽医学上可接受的佐剂。本发明提供新型疫苗组合物，尤其是包含PRRSV94881的PRRS病毒疫苗，其进一步包含增强疫苗功效的佐剂，使得在给予佐剂与疫苗的组合时，见到优于给予单独疫苗的临床反应/结果。举例而言，本发明的疫苗组合物可包含PRRSV94881病毒疫苗及选自以下的佐剂：MCP-1、α-生育酚(例如α-生育酚乙酸酯，其一例示性形式以Diluvac出售)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilussonmus)级分、卡波普(carbopol)及其组合。在一些实施方案中，包含PRRS94881病毒疫苗的病毒疫苗可为重组亚单位疫苗或者可为活减毒病毒疫苗。所存在的一例示性活疫苗为MLV，且PRRS94881可以类似于MLV的方式调配。除上述外，本发明的免疫原性组合物亦可含有其他成分，只要所述其他成分不干扰佐剂或基本病毒疫苗即可。所述其他成分包括例如粘合剂、着色剂、干燥剂、消毒剂、湿润剂、稳定剂、赋形剂、粘着剂、塑化剂、增粘剂、增稠剂、贴附材料、软膏基质、角蛋白脱除剂、碱性物质、吸附促进剂、脂肪酸、脂肪酸酯、高级醇、表面活性剂、水及缓冲剂。优选其他成分包括缓冲剂、软膏基质、脂肪酸、消毒剂、碱性物质或表面活性剂。本发明中所用的佐剂的含量或量可变化，且可通过考虑例如所用PRRS病毒疫苗的性质及剂型来确定。佐剂可包含例如1至100重量％。本发明的基于PRRSV94881的组合物通过将佐剂组分(其为单独组分或存在各种其他成分)与病毒疫苗组分混合在一起来产生。组合物可使病毒疫苗与佐剂作为一种调配物呈现，或者佐剂与疫苗呈现于可同时或依序给予的不同调配物中。因此，本发明免疫原性组合物的佐剂组分可在给予生物体时与病毒疫苗分开给予。或者，本发明的佐剂可连同病毒疫苗一起以单一疫苗组合物形式给予。病毒疫苗可为任何病毒疫苗。更具体实施方案涵盖使用包含PRRSV94881的PRRS病毒疫苗。此外，该种疫苗可与诸如PRRSMLV及/或的其他疫苗组合。此仅为一种例示性PRRS病毒组合疫苗且其他此类疫苗组合可容易地制备。本文所述的免疫原性组合物尤其有利于诱导产生对PRRS病毒的抗体反应。给予疫苗优选减轻一或多种临床症状的严重程度，诸如与PRRSV感染有关的肺损伤、厌食症、皮肤变色、昏睡、呼吸征象、干瘪仔猪、咳嗽、腹泻及其组合。因此，相比于由单独给予PRRS病毒疫苗获得的结果，组合物尤其增强患病动物中的临床结果。在具体实施方案中，增强的临床结果为与未接受免疫原性组合物与该佐剂组合的动物相比，肺损伤百分比降低至少50％。在其他实施方案中，增强的临床结果为与未接受免疫原性组合物与该佐剂组合的动物相比，动物的病毒血症降低至少45％。因此，在一个方面中，本发明涉及一种改良疫苗，更特别是还涉及改良的PRRS病毒疫苗，其中改良包含将选自MCP-1、睡眠嗜血杆菌级分、卡波普及其组合的佐剂与病毒疫苗混合。本发明的疫苗组合物可进一步包含药学上可接受的载剂。本发明的疫苗组合物可通过调配技术中已知的任何方法调配成例如液体制剂、悬浮液、软膏、散剂、洗剂、油包水乳液、水包油乳液、乳液、乳膏、泥敷剂、贴剂及凝胶剂，且优选用作药剂。因此，根据本发明的另一方面，提供一种包含以上疫苗组合物的医药组合物。本发明的疫苗组合物在经皮给予时可显著诱导抗体产生。因此，在本发明的另一优选实施方案中，疫苗组合物可以经皮制剂形式提供。此外，如上所述，本发明中的病毒及佐剂可以单一疫苗组合物形式一起给予生物体，或以佐剂制剂与疫苗的抗原性PRRS病毒组分分开且不同的形式给予生物体，其中佐剂的作用体现在：使生物体中回应于PRRS病毒疫苗所产生抗体的量与单独给予PRRS病毒疫苗相比显著增加。当佐剂及PRRS病毒疫苗给予生物体时，动物的临床结果增强。佐剂的有效量及PRRS病毒疫苗的免疫有效量可由一般技术者考虑例如抗原性物质的类型及性质、生物体物种、年龄、体重、疾病严重程度、疾病类型、给药时间及给药方法来容易地确定，并且使用生物体中针对抗原性物质所产生抗体的量作为指标。PRRS病毒疫苗、佐剂或其组合可通过根据例如动物病状及疾病性质而选择的任何适合方法给予生物体。所述方法的实施例包括腹膜内给予、经皮给予(例如皮下注射、肌内注射、皮内注射及贴剂)、经鼻给予、经口给予、经粘膜给予(例如直肠给予、阴道给予及角膜给予)。其中优选肌内给予。PRRSVMLV的一例示性治疗剂量为约两毫升(2mL)。本领域技术人员将认识到，剂量可基于个别个体的品种、体型及其他身体因素以及PRRSVMLV的特定调配物及给药途径而变化。优选地，PRRSVMLV以单一剂量给予；然而，其他剂量可为适用的。此外，本领域技术人员经由本发明将认识到，剂量及给药次数受个别猪的年龄及身体情况、此行业所共同的其他考虑因素以及给予PRRSVMLV的特定条件影响。在某些其他实施方案中，疫苗可为包含两种或两种以上PRRS病毒的多价疫苗，其中至少一种PRRS病毒为保藏在ECACC登录号11012502下的减毒94881病毒。其他PRRS病毒可为一或多种选自以下的病毒：PRRSV株莱利斯塔病毒(莱利斯塔物质(CDI-NL-2.91))，或其他株，诸如保藏在登录号ECACC04102703、ECACC04102702、ECACC04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCCVR2332、VR2385、VR2386、VR2429、VR2474及VR2402；CNCMI-1102、CNCMI-1140、CNCMI-1387、CNCMI-1388或ECACCV93070108下的株；或实际上可为美国型株，诸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC登录号VR-2332、ATCC登录号VR-2368；ATCCVR-2495；ATCCVR2385、ATCCVR2386、ATCCVR2429、ATCCVR2474及ATCCVR2402。基于PRRS病毒的疫苗可用以接种仔猪与母猪。在本发明的一个方面中，基于猪的年龄及选用于给予的抗原选择特定剂量方案。此将使任何年龄的猪接受最有效的剂量。在一优选方法中，将治疗量的PRRSV94881MLV给予约两周±5日龄的猪或仔猪。所选量将视猪的年龄而变化。或者，将不同治疗量的该种MLV给予约3周龄以上的猪或仔猪，且此量亦随接受所述给药的猪长大或年龄增长而变化。因此，约四周龄、六周龄、八周龄、十周龄、十二周龄、十四周龄、十六周龄的猪、小母猪或母猪均将接受不同量。待使用的治疗剂量在此领域中将最优选化，且通常在临床研究中确定，其中基于针对易感染猪中毒性异源性PRRSV攻毒的防护来确定最小免疫剂量。优选地，根据本文所述的方法产生的PRRSVMLV经由肌内给予；然而，可使用此项技术中熟知且使用的其他给药方法，诸如皮内、鼻内、视网膜内、经口、皮下及其类似方法。本领域技术人员将认识到疫苗接种方法可包含确定针对PRRSV对猪进行疫苗接种的适当时机及剂量。所述方法一般包含确定至少一个选自猪的年龄、健康状态、先天性免疫程度及主动免疫程度的变量，并调整标准剂量浓度以适于这些变量的步骤。一般而言，先天性免疫程度及主动免疫程度将通过参考由来自类似年龄及健康状态的猪群的平均程度构成的标准来确定。在一尤其优选方法中，所有变量均在确定最优选剂量浓度及给药时间选择之前加以考虑。在优选实施方案中，本发明亦涉及分离的核酸，其编码保藏在ECACC登录号11012502下的减毒94881病毒及保藏在ECACC登录号11012501下的亲本毒性94881病毒的特定开放阅读框架(openreadingframe，ORF)。举例而言，保藏在ECACC登录号11012502下的减毒94881病毒的完整核苷酸序列具有SEQIDNO:1的序列，其分别编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8及SEQIDNO:9的ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7蛋白序列。保藏在ECACC登录号11012501下的亲本毒性94881病毒的完整核苷酸序列具有SEQIDNO:10的序列，其分别编码SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17及SEQIDNO:18的ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7蛋白序列。PRRSV94881疫苗可以任何常规方式给予且在一些优选方法中给药为肌内给药。优选地，所给予的PRRSV疫苗在单次剂量后如同一样，提供治疗PRRSV感染或降低其严重程度或发病率的益处，然而，若选择其他抗原或组合或多价疫苗，则应了解其可以以常规方式给予，所述方式包括初始给药后的一或多个增强剂量。本领域技术人员将能够基于所选PRRSV疫苗及抗原所给予的动物的年龄范围确定适当给药量。在下文呈现的具体实施例中，猪及母猪用能够在仔猪中可再现性产生呼吸疾病的新欧洲来源PRRSV株攻毒。历史上，欧洲来源PRRSV株已不能在仔猪模型中再现呼吸疾病，且因此呼吸攻毒模型依赖于用非欧洲型株感染。因为高遗传多样性，所以在欧洲对基于欧洲型株的新疫苗存在需求。在其他实施例中，用在小母猪/母猪攻毒模型中引起生殖衰竭的病毒株对动物进行攻毒。已发现基于保藏在ECACC登录号11012502下的减毒94881病毒或由此株或保藏在ECACC登录号11012501下的亲本株制备的任何病毒的MLV疫苗的功效均可使用多种攻毒模型展示，因为此株在其他PRRS病毒诱导的呼吸或生殖衰竭模型中亦有效。实施例实施例1：PRRSV呼吸攻毒模型的描述如上所述，历史上，欧洲来源PRRSV株无法在仔猪模型中再现呼吸疾病。因为高遗传多样性，所以在欧洲对基于欧洲型株的新疫苗存在需求，且利用毒性欧洲来源PRRSV株的可再现呼吸攻毒的优良模型为进行研究所必需。在以下实施例中，本发明者展示用低传代欧洲型攻毒株(第4代)攻毒猪可靠地产生呼吸症状。在此研究中，12只动物被分为3组，在分配时为三周龄且在攻毒时为约10周龄：第1组：对照组第2组：攻毒组(SD35)第3组：用接种，并接着攻毒(SD35)。该研究进行56天的时间，在攻毒后10天测量来自各组的6只动物的尸检；所有剩余动物的尸检均在攻毒后21天进行。每日研究参数包括：直肠温度、呼吸及其他临床征象。其他研究参数包括：体重、死亡率、病毒血症、血清转化、肺的病理学及组织学检查。在研究第-7天，猪群分配至各组。在研究第0天，第3组接种在研究第35天，用欧洲型攻毒株攻毒第2组及第3组。在第45天，对来自各组的6只动物实施安乐死。剩余动物在第56天实施安乐死。图1A显示的是每只动物及每周呈平均评分形式的咳嗽测量结果。可见在单独攻毒(第2组)与Porcilis组(第3组)中攻毒后咳嗽增加。图1B显示的是自呼吸困难、咳嗽、鼻与眼睛排出物及行为获得的总临床评分。这些数据展示在攻毒及Porcilis组中攻毒后总临床评分整体增加。在攻毒之前及之后监测动物的直肠温度，且展示在攻毒及Porcilis组中攻毒后直肠温度增加(SD>35，组1-2p≤0.001；组1-3p≤0.001)(图2)。平均日体重的测量(图3)显示在攻毒后直至第一次及直至第二次尸检，攻毒(SD35-44p≤0.001及SD35-56p≤0.01)及Porcilis接种组(SD35-44p≤0.05及SD35-56p≤0.05)中ADW显著较低。使用PCR(图4)及ELISA分析(图5)监测病毒血症。在第1组中显示的PCR：所有来自对照组的动物均保持阴性。在第2组中：所有动物在攻毒后均为PRRSV阳性；在第3组中：所有动物在疫苗接种后均为PRRSV阳性。ELISA显示：在第1组中：所有动物均保持阴性；在第2组中：所有动物在攻毒后均为PRRSVAB阳性；在第3组中：所有动物在疫苗接种后均为PRRSVAB阳性。亦对肺进行宏观检查(图6)，其中评估肺的棕褐色斑点区域及实变(consolidation)区域：与对照组相比，在攻毒及Porcilis组中可观察到明显宏观变化(组1-2p≤0.001；组1-3p≤0.05)。在组织病理学检查中，数据亦展示疫苗接种功效(图7A至7C)。与对照组相比，平均肺损伤评分在攻毒及Porcilis组中显著较高(组1-2p≤0.001；组1-3p≤0.001)。感染后10天微观损伤较强。总之，与阴性对照组相比，在攻毒对照及Porcilis接种组中攻毒后，咳嗽、总临床评分及直肠温度增加，并且攻毒对照及Porcilis组中体重显著较低(p<0.05)。所有来自Porcilis组的动物在疫苗接种后PRRS病毒及抗体均呈阳性。所有来自攻毒对照的动物在攻毒后PRRS病毒及抗体均呈阳性。肺的宏观及组织学分析展示与阴性对照组相比，攻毒对照及Porcilis组中宏观及微观肺损伤严重。因此，此研究证实，与阴性对照组相比，所用欧洲型攻毒株诱发明显(p<0.05)疾病：发热、咳嗽、体重减轻及严重的宏观及微观肺损伤。此外，欧洲型攻毒株已成功证明，在猪攻毒模型中产生一致且可再现的PRRSV特异性呼吸疾病，因此适用作未来功效研究中的攻毒病毒。在此研究的参数内，PorcilisPRRS显示缺乏针对欧洲型攻毒株的功效。实施例2：用异源性欧洲型PRRS分离株攻毒后，评估易感染2周龄仔猪中减毒PRRS病毒94881的最小免疫剂量。以评估通过向约14日龄的猪生殖与呼吸综合征(PRRS)易感染仔猪给予猪生殖与呼吸综合征疫苗欧洲来源分离株94881的经修饰活病毒(PRRS94881MLV)，在三种不同效价水准下进行疫苗接种-攻毒研究，以评价用异源性欧洲型PRRS分离株攻毒后使肺损伤相对减少的最小免疫剂量(MID)。各疫苗接种组(第1-3组)以及攻毒对照组(第4组)中包括15只仔猪。阴性对照组(第5组)中包括10只仔猪。监测疫苗组及攻毒对照组的多个参数，包括：攻毒后病毒血症、疫苗接种后临床评定、PRRS血清学、疫苗接种后病毒血症、攻毒后临床观察、平均日增重(ADWG)、直肠温度及肺中的PRRS病毒检测。未受攻毒的阴性对照组(第5组)亦包括在此研究中以通过证明在整个研究持续期间未破坏生物安全性来达成验证研究有效的目的。攻毒对照组及阴性对照组在直至攻毒之日(D28)均为PRRS阴性，且阴性对照组在研究剩余时间(D38)保持PRRS阴性，因此验证了该研究有效。攻毒在疫苗接种后4周进行。此时，仅低效价疫苗组中2只动物、中等效价疫苗组中1只动物及高效价疫苗组中3只动物的血清呈PRRSqPCR阳性。攻毒对照组显示攻毒后PRRS所特有的显著肺损伤。攻毒后，低、中等及高效价疫苗组分别具有0.13％、0.55％及0.40％的中值总肺损伤评分，而攻毒对照组具有33.40％的中值总肺损伤评分。三个疫苗效价组的中值总肺损伤评分显著低于攻毒对照组(p<0.0001)。疫苗效价组之间总肺损伤评分无统计差异(p≥0.1484)。阴性对照组具有0.00％的中值总肺损伤评分。在攻毒后时期的研究第31、35及38天，三个疫苗效价组的病毒血症显著少于攻毒对照组(p≤0.0093)。除D35，高效价疫苗组显示病毒血症显著低于中等效价疫苗组(p＝0.0442)之外，攻毒后病毒血症在疫苗效价组之间无统计差异。阴性对照仔猪在D31、D35及D38为病毒血症阴性。临床上，在攻毒后的期间(第29天-第38天)，三个疫苗效价组中咳嗽严重程度(p≤0.0082)及频率(p≤0.0268)不如攻毒对照组中严重。攻毒后，攻毒对照组中的发热比三个疫苗效价组显著。三个疫苗效价组的ADWG显著高于攻毒对照组(p≤0.0027)。基于接受毒性异源性欧洲来源PRRS攻毒后与攻毒对照的比较，所有三个效价水准的总体肺损伤的相关性降低，如此研究中所确定的PRRS94881MLV的MID与1×102.77TCID50/mL的低效价疫苗水准相关。当检查次要参数时，所有三个疫苗效价水准均与功效相关联且效价组之间未显示明显差别。研究的一般设计：此为在70只在第0天(D0)断乳的14-16日龄PRRS易感染仔猪中进行的盲法随机化设计研究。处理组的描述展示于下表2.1中：表2.1处理组组第0天的动物数第0天的处理115IVP第1号(平均效价为1×102.77的PRRS94881MLV)215IVP第2号(平均效价为1×104.42的PRRS94881MLV)315IVP第3号(平均效价为1×105.84的PRRS94881MLV)415CP(无PRRS94881MLV的安慰剂匹配产品)510CP(无PRRS94881MLV的安慰剂匹配产品)83只仔猪符合研究入选准则，其中首批70只在D-3通过生物统计学家随机分配至五组之一。仔猪以每组15只分配至第1-4组，且10只分配至第5组。所有83只仔猪均呈PRRS血清阴性。自D-1至D26观察仔猪的疫苗接种后临床评定，且观察结果记录在临床评定记录表格上。血清学：在D0、D7、D14、D21、D28自仔猪收集静脉全血。记录样品的收集。血液样品经离心且自各管收获血清，分离且转移至适当标记的管。一组血清样品保持在2-8℃且另一组血清样品保持在-70±10℃。测试在第0、7、14、21、28及38天收集且保持在2-8℃的该组血清样品的PRRS抗体。结果报导为阴性(ELISAS/P比率<0.4)或阳性(ELISAS/P比率≥0.4)。PRRS病毒血症：通过qPCR(附录1，附件7)测试在第0、7、14、21、28、31、35及38天收集且保持在-70±10℃的该组血清样品的PRRSvRNA。结果报导为n.d.(未检测)、阳性(检测到欧洲型PRRSv，但不可定量，GE/mL(基因组当量)＝<3.3log)或报导值(logGE/mL)。出于统计目的，“未检测”指定为0logGE/mL的值，且“阳性”值指定为3.0logGE/mL的值。平均日增重(ADWG)：每只猪在校准天平上称重且记录个别体重。测定D0至D28及D28至D38的平均日增重。攻毒后临床观察：由研究调查者或被指定者观察仔猪D27至D38的疾病临床征象且记录在临床观察记录表格上。观察结果包括基于临床观察评分系统的呼吸、行为及咳嗽，如下表2.2中所示。表2.2临床观察评分系统每只仔猪的每日总临床观察评分通过将其每日呼吸、行为及咳嗽评分求和来确定。自D27至D38收集直肠温度。总肺损伤评分：对在D38之前死亡的所有仔猪以及在D38实施安乐死的剩余仔猪进行尸检。检查每组肺的任何总体肺病理学及确定每一肺叶的病理百分比。若注意到其他器官的病理学，则亦加以描述及记录。PRRSV的肺qPCR：对于各组肺，保留来自左及右顶叶、左及右心叶、左及右隔叶及中叶的两个样品。对于一组肺样品，所有来自左侧的三个样品组合在一个容器中；而所有三个来自右侧的样品及中间肺叶样品组合在另一容器中。每一容器填充足够量的10％甲醛溶液。对于其他组的肺样品，所有来自左侧的三个肺样品组合在一个中；而所有三个来自右侧的样品及中间肺叶样品组合在另一中。冷冻肺组织样品保持在-70±10℃，直至进一步分析。对于每只仔猪，将所有左肺样品均质化且以单一组合样品形式测试；且将所有右肺组织及中间肺叶样品均质化且以单一组合样品形式测试。对于左及右肺样品，结果报导为n.d.(未检测)、阳性(检测到欧洲型PRRSv，但不可定量，GE/mL(基因组当量)＝<3.3log)或测试值(logGE/mL)。为达成分析每只仔猪的目的，记录下左及右肺样品qPCR结果的平均值。出于统计目的，“未检测”指定为0logGE/mL的值，且“阳性”值指定为3.0logGE/mL的值。结果攻毒后总肺损伤评分：总肺损伤评分的组最小值、最大值、中值、95％置信区间、Q范围及平均值的概述显示，低、中等及高效价疫苗组分别具有0.13％、0.55％及0.40％的中值总肺损伤评分；而攻毒对照组具有33.40％的中值总肺损伤评分。三个疫苗效价组的中值总肺损伤评分显著低于攻毒对照组(p<0.0001)。疫苗效价组之间总肺损伤评分无统计差异(p≥0.1484)。阴性对照组具有0.00％的中值总肺损伤评分。对于一只动物(高效价疫苗组)，注意到具有大量纤维素脓性胸膜炎的组织学轻度化脓性间质性肺炎。除了散布的嗜中性白血球，气管及肺泡相对并不显著。肺组织的猪肺炎支原体、PCV2、PRRSv及SIV抗原呈IHC阴性。肺损伤与一般与细菌剂有关的浆膜炎一致(附录12；登记号2009030254)。分离来自肺组织的若干纯细菌培养物且鉴别为支气管败血性博德氏杆菌及凝固酶阴性葡萄球菌(coagulasenegativeStaphylococcus)。虽然自肺组织分离出两种类型的细菌，但此仔猪未自第3组总肺损伤评分分析中移除。10只阴性对照仔猪中2只显示极微小的肺损伤(第1767号，0.55％；第1789号，0.61％)。认为这些损伤无关紧要且并不指示PRRS。10只阴性对照仔猪中2只显示极微小的肺损伤(第1767号，0.55％；第1789号，0.61％)。认为这些损伤无关紧要且并不指示PRRS。攻毒后PRRS病毒血症：将攻毒后PRRS病毒血症个别结果(D31-D38)制成表格，且发现三个疫苗效价组及攻毒对照组中所有仔猪在攻毒后均具有病毒血症。在攻毒后所有三个时间点，三个疫苗效价组的病毒血症显著少于攻毒对照组(p≤0.0093)。除D35，高效价疫苗组显示平均病毒血症低于中等效价疫苗组(p＝0.0442)之外，攻毒后病毒血症在疫苗效价组之间无统计差异。阴性对照仔猪在D31、D35及D38为病毒血症阴性。曲线下面积(AUC)表示病毒负荷的量及持续时间且为检查病毒血症的优良评定工具。亦在三个疫苗效价组与攻毒对照组之间检测到D28至D38(p≤0.0162)与D31至D38(p<0.0001)的AUC的显著差异。在疫苗效价组之间未检测到两个时间间隔的AUC的差异(p≥0.3669)。亦概述病毒血症阳性仔猪D31至D28的组频率且展示于表2.3中。因为所有疫苗及攻毒对照仔猪在攻毒后均呈病毒血症阳性，所以在每一时间点各组的病毒血症阳性仔猪频率为100％。因此，对攻毒后病毒血症频率不进行分析。表2.3病毒血症阳性仔猪的组频率的概述-D31至D38*第1组＝低效价PRRS94881MLV；第2组＝中等效价PRRS94881MLV；第3组＝高效价PRRSMLV；第4组＝攻毒对照组；第5组＝阴性对照组肺qPCR结果：攻毒后个别肺病毒分离结果的组间差异如qPCR阳性肺样品测试结果的频率(p值)所概述。所有三个疫苗效价组及攻毒对照组中来自仔猪的肺组织在攻毒后对PRRSv均呈qPCR阳性。疫苗效价组与攻毒对照组之间未检测到显著差异(p＝1.0000)。因为所有疫苗效价仔猪对PRRSv均呈qPCR阳性，所以在疫苗效价组之间不进行测试。虽然在疫苗效价组与攻毒对照组之间未检测到qPCR阳性肺组织的频率的差异，但肺组织中病毒负荷的差异明显。实际上，低、中等及高效价疫苗组分别具有6.88、6.80及6.81log10GE/mL的中值肺qPCR值；而攻毒对照组具有8.13log10GE/mL的中值肺qPCR值。疫苗效价组与攻毒对照组之间的差异显著(p≤0.0001)。反之，在疫苗效价组之间未检测到中值肺qPCR值的差异(p≥0.7379)。攻毒后临床观察评分：所有五组的中值最大临床评分为0(评分0代表正常呼吸或正常行为)，这表明攻毒后异常呼吸及异常行为不严重。此外，在疫苗效价组与攻毒对照组之间未检测到异常呼吸及异常行为两者的显著差异(p≥0.0996)。在所有三个疫苗效价组及攻毒对照组中注意到咳嗽，但在攻毒对照组中较严重。对于三个疫苗效价组，每组具有代表轻柔或间歇咳嗽的最大咳嗽评分1，及中值最大咳嗽评分0。反之，攻毒对照组具有代表剧烈或严重反复咳嗽的最大咳嗽评分2及中值最大咳嗽评分1。三个疫苗效价组的咳嗽严重程度显著轻于攻毒对照组(p≤0.0082)。在阴性对照组中未注意到咳嗽。所有三个疫苗效价组具有最大总评分1及中值最大评分0。反之，攻毒对照组具有最大总评分4及中值最大评分1。三个疫苗组的最大总临床评分显著低于攻毒对照组(p≤0.0047)。此外，阴性对照组具有最大总临床评分0及中值最大总临床评分0。所有组中D29至D38至少一天的异常呼吸或异常行为频率均较低。实际上，D29至D38，低及中等疫苗效价组中未注意到异常呼吸。高效价疫苗组中15只仔猪有1只(7％)具有异常呼吸且攻毒对照组中14只仔猪有3只(21％)具有异常呼吸。在任何疫苗效价组中均未注意到异常行为；而14只攻毒对照仔猪中2只(14％)显示攻毒后至少一天有异常行为。在疫苗效价组与攻毒对照组之间，攻毒后至少一天异常呼吸或异常行为的频率之间未观察到显著差异(p≥0.0996)。阴性对照组中未注意到异常呼吸或异常行为。攻毒对照组中的咳嗽频率远高于三个疫苗效价组。实际上，低、中等及高效价疫苗组的攻毒后至少一天咳嗽的频率分别为14％、13％及27％。反之，攻毒对照组的攻毒后至少一天咳嗽的频率为71％。三个疫苗效价组的咳嗽频率显著低于攻毒对照组(p≤0.0268)。如总临床评分>0所表示，攻毒对照组中攻毒后任何临床征象的频率高于三个疫苗效价组。类似于咳嗽频率，低、中等及高效价疫苗组的攻毒后至少一天的任何临床征象频率分别为14％、13％及33％；而攻毒对照组中79％的仔猪在攻毒后具有至少一个临床征象。三个疫苗效价组在攻毒后的任何临床征象频率显著低于攻毒对照组(p≤0.0253)。在此同一时期内，在阴性对照组中未注意到临床征象。所有组中D29至D38的异常呼吸或异常行为的平均评分均较低。实际上，低及中等疫苗效价组的平均呼吸评分为0.00(正常)，高效价疫苗的平均呼吸评分为0.01，且攻毒对照组的平均呼吸评分为0.03。所有三个疫苗效价组的平均行为评分为0.00；而攻毒对照组的平均行为评分为0.01。此外，在疫苗效价组与攻毒对照组之间未检测到平均呼吸及行为评分的显著差异(p≥0.0996)。阴性对照组的呼吸及行为平均评分为0.00。攻毒对照组的平均咳嗽评分高于三个疫苗效价组。实际上，低、中等及高效价疫苗组的平均咳嗽评分分别为0.01、0.01及0.04。反之，攻毒对照组的平均咳嗽评分为0.28。三个疫苗效价组的平均咳嗽评分显著低于攻毒对照组(p≤0.0077)。攻毒对照组中的平均总评分高于三个疫苗效价组。类似于平均咳嗽评分，低、中等及高效价疫苗组的攻毒后平均总评分分别为0.01、0.01及0.04；而攻毒对照组的平均总评分为0.32。三个疫苗效价组的平均总评分显著低于攻毒对照组(p≤0.0025)。攻毒后直肠温度：D29至D38之间低、中等及高效价疫苗组的最大组平均直肠温度分别为40.20℃(D33)、40.33℃(D35)及40.20℃(D37)。D29与D38之间攻毒对照组及阴性对照组的最大组平均直肠温度分别为40.51℃(D33)及39.95℃(D33)。在D29(39.47℃对39.90℃)、D31(39.85℃对40.20℃)、D35(39.80℃对40.22℃)及D38(39.86℃对40.32℃)，低效价疫苗组的直肠温度显著低于攻毒对照组(p≤0.0317)；而在D30，低效价疫苗的直肠温度显著高于攻毒对照组(40.08℃对39.58℃；p＝0.0003)。在D32-D34及D36-D37，在低效价疫苗组与攻毒对照组之间未检测到显著差异(p≥0.0545)。在D31(39.62℃对40.20℃)、D33(40.15℃对40.51℃)及D38(39.58℃对40.32℃)，中等效价疫苗组的直肠温度显著低于攻毒对照组(p≤0.0227)。在D29-D30、D32及D34-D37，在中等效价疫苗组与攻毒对照组之间未检测到显著差异(p≥0.0580)。在D33(40.12℃对40.51℃)、D35(39.79℃对40.22℃)及D38(39.55℃对40.32℃)，高效价疫苗组的直肠温度显著低于攻毒对照组(p≤0.0147)；而在D32，高效价疫苗组的直肠温度显著高于攻毒对照组(40.31℃对39.90℃；p＝0.0063)。在D29-D31、D34及D36-D37，在高效价疫苗组与攻毒对照组之间未检测到显著差异(p≥0.0708)。攻毒后三个疫苗效价组中的发热频率与攻毒对照组相比较低。发热频率整体较低且在疫苗效价组之间类似。平均日增重(ADWG)：低、中等及高效价疫苗组的D0至D28最小平方平均ADWG分别为0.4、0.3及0.4kg/天。攻毒对照组在此同一时期内的最小平方平均ADWG为0.3kg/天。D0至D28，低效价疫苗组的最小平方平均ADWG显著高于攻毒对照组(p＝0.0292)；而在疫苗效价组与攻毒对照组之间(p≥0.1262)或在疫苗效价组之间(p≥0.1293)未检测到最小平方平均ADWG的显著差异。在此同一时期内，阴性对照组的平均ADWG为0.5kg/天。低、中等及高效价疫苗组的D28至D38最小平方平均ADWG分别为0.5、0.5及0.4kg/天。攻毒对照组在此同一时期内的最小平方平均ADWG为0.3kg/天。攻毒后三个疫苗效价组增重显著超过攻毒对照组(p≤0.0027)。在此同一时期内，阴性对照组的平均ADWG为0.6kg/天。疫苗接种后临床评定：在低效价疫苗组中，注意到一只仔猪(1735)自D0至D10变瘦。此外，注意到一只仔猪自D6开始变瘦，持续16天，显示咳嗽2天及抑郁9天，且出于健康欠佳的动物福利原因，在D21实施安乐死。仔猪1727的总肺损伤评分为10.8％。因为此值在攻毒前测定，所以其未包括在攻毒后总肺损伤分析内。此外，注意到肺的腹侧前方区域中红色/紫色实变区域，肝脏为苍白色且肾的肾盂中具有多个红色/紫色区域。病理学家注意到肝脏中中央小叶的脂肪浸润，此一般在负能量平衡及随之脂肪分解的情况下可看到。肝、肾及肺切片中未观察到其他损伤。通过PCR，测得肺组织呈欧洲型PRRS阳性。对于常规细菌培养，未检测到生长。在中等效价疫苗组中，在处理之前D0，自研究排除1只仔猪，因为其健康欠佳，且用另一仔猪替换。2只仔猪分别显示咳嗽1天及三天，始于D12。注意到4只仔猪在D2和/或D3变瘦。在高效价疫苗组中，1只仔猪(1728)自D7至D26显示一只腿跛行或一只腿跛行及肿胀。自疫苗接种后18天开始，注意到1只仔猪变瘦，持续6天，且显示咳嗽1天且被毛粗糙4天。注意到另一仔猪在D2变瘦。2只仔猪分别显示咳嗽2天及1天，始于D9。1只仔猪显示腹泻1天(D14)。在攻毒对照组中，6只仔猪显示周期性咳嗽，累计1至6天，以第一只仔猪在D7开始且以三只仔猪在D21结束。注意到2只仔猪变瘦，分别持续2天及11天，其中一只仔猪始于D1。此两只仔猪中的第二只仔猪亦显示抑郁且被毛粗糙4天，腿虚弱1天，且发现在D15死亡。在此仔猪尸检时，注意到无肺损伤(肺损伤评分为0％)，胃中无饲料，且无腹部脂肪，并诊断死亡原因为饥饿。因为此肺损伤评分在攻毒前测定，所以其未包括在攻毒后肺损伤分析内。概述D1至D26至少一天的任何异常临床评定的组测试结果(p值)。在疫苗效价组与攻毒对照组之间未检测到显著差异(p≥0.0502)；在疫苗效价组之间亦未检测到显著差异(p≥0.3898)。阴性对照组中无仔猪显示D1至D26的异常临床评定。PRRS血清学：概述个别仔猪的PRRSELISA血清学结果。阴性对照组中仔猪在整个研究期间保持PRRS血清阴性。在3个疫苗效价组中至疫苗接种后14天可观察到血清转化；而攻毒对照组保持PRRS血清阴性，直至攻毒后。攻毒后10天(D38)，低效价及高效价疫苗组及攻毒对照组中的所有仔猪均为PRRS血清阳性；而中等效价疫苗组中15只仔猪中的14只为PRRS血清阳性。针对组间差异，测定PRRSELISA阳性血清学测试结果(p值)。在D14、D21及D28，三个疫苗效价组的PRRSELISA阳性仔猪频率显著高于攻毒对照组(p<0.0001)。在D38，在三个疫苗效价组与攻毒对照组之间未检测到显著差异(p＝1.0000或未进行测试)，在三个疫苗效价组之间在任何时间点亦未检测到显著差异(p＝1.0000或未进行测试)。疫苗接种后PRRS病毒血症：测定疫苗接种后的个别PRRS病毒血症结果。出于统计目的，“未检测”结果指定为0logGE/mL的值，且“阳性”值指定为3.0logGE/mL的值。所有组在D0均为PRRS病毒血症阴性。评估组病毒血症(qPCR)(疫苗接种后D7至D28的效价(logGE/mL)数据)。三个疫苗效价组中的仔猪在D7达到峰值平均病毒血症，接着在攻毒(SD28)之前所有三个组的效价水准缓慢下降。反之，攻毒对照组及阴性对照组在研究的攻毒前阶段期间保持病毒血症阴性。根据D7、D14、D21及D28qPCR结果的组测试结果(p值)，可见在D7-D28，所有三个疫苗效价组的中值qPCR值均显著高于攻毒对照组(p≤0.0159)。中等疫苗效价组的qPCR中值显著高于低效价疫苗组(p＝0.0193)；另外，攻毒前在疫苗组之间未检测到qPCR中值的差异(p≥0.0594)。疫苗接种后4周，在三个疫苗效价组中病毒血症频率较低。以下结论可基于这些研究结果得出：·在研究期间生物安全性未受到任何破坏及证实仔猪易感染PRRS，证实该研究的有效且适于说明；·实质性PRRS临床疾病在攻毒对照组中明显，因此验证此攻毒模型为足以评估PRRS疫苗功效，更特别是用作PRRS94881MLV的MID的实验室工具；·PRRS94881MLV的所有三个剂量均引起肺损伤显著减少，以及攻毒后病毒血症、肺组织中病毒负荷、咳嗽、总临床观察评分、发热及ADWG显著减少；·接受毒性异源性欧洲来源PRRS攻毒后，所有三个效价水准的总体肺损伤与攻毒对照相比均相对降低，因此研究中所确定的PRRS94881MLV的MID与1×102.77TCID50/mL的低效价疫苗水准相关。结果的进一步描述每天进行临床观察。使用PRRSV欧洲型特异性引物，对来自血液、口腔、粪便及鼻拭子以及肺灌洗液的样品进行定量RT-PCR。根据这些研究，数据显示除了几只猪跛行外，仔猪均显示正常健康。事后剖析，尸检时无异常，除了1-2只动物显示腹股沟淋巴结轻微增大以外。重要的是，可见在疫苗接种组中未观察到肺损伤。图8显示相比于用含有保藏在ECACC登录号11012502下的减毒PRRS病毒株的组合物进行疫苗接种的组，警哨(sentinel)组中病毒血症动物的百分比。此图显示该疫苗株自疫苗接种动物传播至警哨。在如定量RT-PCR所检测的PRRS病毒血症峰值(SD21)时，警哨感染猪(平均病毒负荷为3.347GE/ml)中的病毒负荷比疫苗接种动物(平均病毒负荷为4.014GE/ml)低78.47％。在未经PRRS处理的母猪与其疫苗接种后代混杂的房间内，8只母猪中仅3只母猪通过RT-PCR测试为血液中呈PRRSV阳性，因此证实PRRSMLV疫苗暴露于未处理成年动物中有限且低效。此研究中，疫苗病毒94881MLV主要在粪便中排出。实际上，在粪便中，可在疫苗接种后1天至21天检测到病毒。疫苗接种后5天，几乎30％的疫苗接种动物在粪便中排出病毒。鼻的分泌物中未检测到PRRS病毒，且仅少数动物中PRRS病毒经由口腔分泌物检测到(疫苗接种后5天，56只取样动物中有2只检测到)。实施例3：使用PRRS作为实施例用于测试疫苗功效的例示性材料与方法此研究中使用选定数目(例如14只)来自证实为PRRSV阴性畜群(经病毒学及血清学测试)的健康怀孕母猪。母猪面临第一次或第二次分娩，且在怀孕第94天时在疫苗接种/攻毒感染时证实其怀孕。母猪分成3个处理组。第一组在怀孕第94天用2ml含有至少104.0TCID50的PorcilisTMPRRS的商业剂量处理(经由肌内给予)。攻毒对照组(第2组)经鼻内接受含104.72TCID50病原性欧洲型野外分离株(第4代)的2ml细胞培养基的剂量。第3组在授精前7天经肌内用2ml含有107.6TCID50PRRSMLV的剂量接种，该PRRSMLV含有于2011年1月25日保藏在ECACC登录号11012502下的减毒PRRS病毒株，且在怀孕第94天，用欧洲野外分离株(第4代)攻毒(鼻内含104.72TCID50的2ml细胞培养基)。监测来自第1组的动物，直至产仔后第5天。监测来自第2组及第3组的动物，直至产仔后第28天。动物期：在疫苗接种前1周，使所有母猪均适应动物实验室。研究者每日观察母猪及仔猪的整体健康状态。死亡或实施安乐死的每只动物均经受死后检查及后续实验室分析。通过超声波检查证实怀孕。在研究第0、7、14天及产仔时自母猪获得血清以进行PCR及ELISA研究。与流产相关的任何材料均经受实验室研究。对所有死产仔猪进行常规宏观病理学研究。自死产仔猪及其母亲收集来自所有肺叶的肺组织样品。用于PCR测试的样品储存在-70℃。在出生之日收集2ml来自各仔猪的哺乳前血液。制备血清且等分试样储存在-70℃。血清用于测试病毒血症以评估经胎盘感染。第1组的所有存活至第5天的仔猪在5日龄时实施安乐死。临床及生殖效能参数：以下准则为可研究的例示性标准(优先顺序)：分别为每窝活产仔猪的数目、每窝死产仔猪的数目、每窝干瘪胎猪的数目及存活至5日龄或28日龄的仔猪的数目。使用哺乳前血清测定生来患有病毒血症的仔猪的数目。研究来自母猪及/或仔猪的PCR阳性血液及组织样品的频率以评估感染的流行病学及过程。野外样品：此研究中所研究的野外样品取自常规PRRSV诊断法且由来自不同欧洲国家的血液、血清及各种器官材料(主要为肺及淋巴结)组成。样品储存在-20℃最长3天，接着制备RNA，随后残余材料转移至-70℃供长期储存。RNA及RT-PCR产物储存在-20℃。细胞培养：MA104细胞(纯系CL2621)生长于补充有10％FCS及抗生素的MEM(Dulbecco，Germany)中。使用Wensvoort等人(Wensvoort，G.等人，Vet.Quat.1991，13:121-130)描述且有如下修改的方法收获猪肺泡巨噬细胞：各肺叶输注50-100mlPBS，且随后按摩3至5分钟。接着自肺叶中收回流体且通过纱网过滤器(gazefilter)。重复此程序，直至灌洗液澄清。汇集灌洗液，在室温下在500g下离心15分钟。离心沉淀物在PBS中洗涤，并将含1×107个细胞的50％RPMI1640(Biochrom)、40％FCS及10％DMSO的等分试样冷冻在-196℃。为进一步使用，PAM在补充有10％FCS及抗生素的RPMI1640培养基中培养。在细胞培养物中制备器官材料供病毒分离：约0.5cm3组织材料转移至含有1个钢制均质化球的管中的1.8ml无菌PBS中。管搅动10分钟，直至器官材料均质化。细胞碎片通过在450g及室温下离心2分钟来集结。使上清液通过0.45μm孔无菌过滤器且储存在-70℃。使用24孔微量滴定盘，使用30μl的等分试样接种一个半汇合细胞培养物单层。RNA分离：根据制造商的建议，用RNeasyMini试剂盒自器官材料萃取RNA且使用QTAamp病毒RNAMini试剂盒(均为Qiagen)自血清、血浆、细胞培养物上清液及疫苗溶液萃取RNA，各制备分别使用约100mg器官材料及140μl流体材料。如制造商所建议，RNA最终在65μl缓冲液中溶离。病毒的噬斑纯化：之前在10cm细胞培养皿中接种48小时的Ma104细胞汇合单层，用自10-1按十倍稀释至10-4的各别病毒感染。细胞与病毒稀释液一起培育1小时，接着将稀释液移除且细胞用30ml含有5％甲基纤维素的Ma104培养基(Sigma)覆盖。5至7天后挑选噬斑且转移至24孔板中的Ma104单层中。来自这些板的病毒在约50％CPE时收获且经受进一步分析。免疫荧光分析：使用冰冷丙酮：甲醇(1:1)在-20℃将细胞固定15分钟，接着风干。在PBS中再水合后，细胞与在PBS中按1:1000稀释的PRRSV特异性单克隆抗体SDOW17(RuralTechnologiesInc.，USA)一起培育1小时。用PBS洗涤3次后，细胞再与山羊抗小鼠FITC结合的二级抗体(Dianova，Hamburg，Germany)(PBS中1:150)一起培育1小时。用PBS最后洗涤3次后，细胞用甘油：PBS溶液(1:1)覆盖且经免疫荧光显微法检测。诊断nRT-PCR：可进行诊断性RT-nPCR以检查样品中PRRSV-欧洲型病毒的存在。例示性诊断性RT-nPCR可用TitanOneTube试剂盒(RocheMolecularBiochemicals)如下进行：[5μl总RNA制剂、1*RT-PCR缓冲液、0.4mMdNTP、20pmol引物PLS及PLR、5mM二硫苏糖醇、1mMMgCl2、2.5-5URNasin(PromegaLtd)、1-2.5U酶混合物，用经DEPC处理的蒸馏水调整至25μl最终体积]。所用常规循环条件可为：45℃1小时，94℃2分钟，及30次94℃30秒、58℃45秒及68℃45秒循环，最终为68℃5分钟的延长步骤。巢式PCR反应用QiagenTaq(QiagenAG)如下进行：[1μlRT-PCR产物、1*PCR缓冲液、10μlQ-溶液、3.5mMMgCl2、0.3mMdNTP、各20pmol的EU-7-n-s及EU-7-n-as引物、2.5UTaq聚合酶，用蒸馏水调整至50μl最终体积]。循环条件如下：7次94℃1分钟、58℃1分钟及72℃1分钟循环，接着30次94℃1分钟及70℃1.5分钟循环(无退火步骤)，最终为70℃5分钟的延长步骤。核苷酸定序：可对巢式PCR产物进行核苷酸定序，所述产物用含有M13标签的引物直接自PCR反应产生，或自通过琼脂糖凝胶切除且经JETsorb凝胶萃取试剂盒(Genomed)纯化的PCR产物产生。定序使用自动定序仪LI-CORDNAAnalyzerGENEREADIR(LI-CORInc.，Lincoln，Nebr.，USA)进行。核苷酸及所推断出的氨基酸序列可用1.1版(LI-CORInc.，Lincoln，Nebr.，USA)及DNASIS.RTM.2.6软件包(HitachiSoftwareGeneticSystemsInc.，SanFrancisco，USA)分析。实施例4：测定全长基因组序列PRRSV94881本实施例展示减毒94881株及其亲本株94881第5代的全长基因组核苷酸序列的测定。这些序列未显示任何指示同源性病毒内含物存在的不明核苷酸位置。94881种原病毒(masterseedvirus)与欧洲参考病毒株莱利斯塔病毒(LV)的比较表明，8种不同病毒基因中的核苷酸同源性在85.40％至95.09％的范围内，且两种病毒株之间的氨基酸一致性在86.39％至97.27％的范围内。相比于LV，可鉴别出94881MSV的ORF1a中有两处缺失。94881种原病毒与其亲本株第5代之间的比较表明两者之间有26个核苷酸交换，导致总共14个氨基酸交换。对于94881种原病毒的全长基因组序列测定，进行总共1个逆转录、17个外部PCR及58个内部PCR，产生40个PCR产物，其用于定序。在94881第5代的情况下，亦进行1个逆转录、17个外部PCR及67个内部PCR，产生40个PCR产物，亦用于定序。对各自包含完整开放阅读框架(ORF)1a至7的两种病毒分离株的重迭序列比对分析，产生14843个核苷酸的全长序列。此外，可分别测定5'-非转译区(5'NTR)的177个核苷酸及3'-非转译区(3'NTR)的43个核苷酸。与欧洲PRRSV参考病毒分离株莱利斯塔(LV)(GenBank登录号M96262)相比，无法确定5'NTR的44个核苷酸及3'NTR的83个核苷酸，因为那些区域用于引物退火区域。两种病毒株的定序反应产生清晰的核苷酸序列，无任何摆动或有关混合序列的任何其他迹象。转译成氨基酸后，可获得无任何可疑氨基酸的清晰氨基酸序列，供94881MSV与LV及与亲本株94881第5代的序列比较。在94881MSV与莱利斯塔病毒之间对核苷酸序列进行比对及比较，且展示在核苷酸及氨基酸层面上存在实质性差异。亦在94881MSV与其亲本株第5代之间进行比对。与LV的序列比较得出8种不同病毒基因中的核苷酸同源性为85.40％至95.09％，且两种病毒株之间的氨基酸一致性为86.39％至97.27％。相比于LV，可鉴别出94881MSV的ORF1a中有两处缺失。一处138个核苷酸的缺失位于LV的位置2154至2292，且导致缺失46个氨基酸。在位置2686至2688，缺失另一三重体，导致缺失氨基酸苯丙氨酸。LV与两种94881株之间的所有核苷酸同源性及氨基酸一致性的所有排列均展示于表4.1中。表4.1：94881种原病毒与欧洲参考病毒莱利斯塔病毒的核苷酸及氨基酸序列比较的排列NTR：非转译区*＝莱利斯塔病毒与94881MSV之间仅比较177个核苷酸。位于上游的剩余44个核苷酸尚未确定。**＝分离株94881MSV展示ORF1a中有两处缺失，分别为一处138个核苷酸及一处3个核苷酸。参考病毒LV的完整核苷酸及氨基酸序列用于同源性及一致性计算，缺失评定为偏差。LV的相应病毒基因的长度为7191个核苷酸，且相应聚合蛋白的长度为2396个氨基酸，基因同源性及氨基酸一致性的计算分别指7191个核苷酸及2396个氨基酸的数目。***＝莱利斯塔病毒与94881MSV之间仅比较44个核苷酸。位于下游的剩余83个核苷酸尚未确定。94881种原病毒及94881亲本株第5代的全长核苷酸序列的序列比较表明两者之间有总计26个核苷酸交换。核苷酸交换分布如下：15个在ORF1a中，4个在ORF1b中，2个在ORF2中，ORF3中无，1个在ORF4中，3个在ORF5中，1个在ORF6中且ORF7中无。这些核苷酸交换产生总共14个氨基酸交换，其分布如下：8个在聚合蛋白1a中，1个在聚合蛋白1b中，1个在糖蛋白2中，糖蛋白3中无，1个在糖蛋白4中，2个在糖蛋白5中及1个在基质蛋白中。与莱利斯塔病毒相比，两种病毒株均显示ORF1a中有相同缺失。所有核苷酸交换及所得氨基酸交换(包括在病毒基因及相应蛋白中的位置)的排列详细展示于表4.2中。实施例5-保藏病毒及MSV的培养如上所述，亲本(低代数)94881保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号ECACC11012501下，94881种原病毒(MSV)保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号ECACC11012502下。本实施例中提供亲本病毒及MSV的生长及培养条件。亲本94881：其为PRRSV1型基因型病毒，因此其为欧洲基因型PRRSV。该病毒具有猪宿主。保藏在11012501下的亲本病毒以5.81Log10TCID50/mL的效价保藏。病毒繁殖的宿主细胞为MA104细胞。这些细胞在具有3.7g/L碳酸氢钠且含有6％经照射的胎牛血清的最低必需培养基(MEM)中于37±1℃培养。细胞涂铺于T-烧瓶(75cm2)中，涂铺密度为2×104个至2×105个细胞/cm2，且传代前培养3至7天直至100％汇合。为使病毒生长，将病毒以0.001-0.01的MOI添加至T-烧瓶中的细胞中。受感染的细胞通常在细胞涂铺后1-3天达到约80-100％的汇合度。感染后，受感染的细胞在37±1℃培养3-10天，并接着收获病毒。当单层细胞在感染后3-10天显示约80-100％细胞损伤效应(CPE)时进行收获。收获受感染的MA104组织培养物(用过的培养基+来自具有80-100％CPE的培养物的PRRSV)的上清液，该上清液含有已繁殖的病毒。此上清液在使用前可储存在-70℃/-80℃若干个月。通过Spearman及Kaerber计算评定病毒的TCID50以确定样品的log10TCID50/mL。疫苗(高代数)94881种原病毒(MSV)：其为PRRSV1型基因型病毒，因此其为欧洲基因型PRRSV。该病毒具有猪宿主。保藏于11012502下的MSV以6.43Log10TCID50/mL的效价保藏。MSV繁殖所用的宿主细胞为MA104细胞。这些细胞在具有1.4g/L碳酸氢钠且含有10％经照射的胎牛血清的最低必需培养基(MEM)中于36±2℃培养。细胞涂铺于T-烧瓶(75-150cm2)或850cm2滚瓶中，涂铺密度为1×104个至1×105个细胞/cm2，且传代前培养3至7天直至100％汇合。为使病毒生长，将病毒以0.001-0.01的MOI添加至T-烧瓶或滚瓶中的细胞中。受感染的细胞通常在细胞涂铺后1-3天达到约80-100％的汇合度。感染后，受感染的细胞在36±2℃培养3-14天，并接着收获病毒。当单层细胞在感染后3-14天显示约80-100％细胞损伤效应(CPE)时进行收获。收获感染的MA104组织培养物(用过的培养基+来自具有80-100％CPE的培养物的PRRSV)的上清液，该上清液含有已繁殖的病毒。此上清液在使用前可储存在2-8℃5-10天，-70℃若干个月。通过Reed及Muench计算评定MSV的TCID50以确定样品的log10TCID50/mL。表4.2：94881种原病毒与94881亲本株的核苷酸及氨基酸序列比较的排列实施例6：PRRS94881MLV小母猪MID研究概述此项疫苗接种-攻毒研究的目标为评估猪生殖与呼吸综合征疫苗欧洲来源分离株94881的经修饰活病毒代码19T1.U_(PRRS94881MLV)在小母猪中的最小免疫剂量(MID)。在繁育前约28天(第0天；D0)，将两种不同效价水准给予PRRS血清阴性小母猪，在妊娠约90天(D118)，用PRRSv的异源性欧洲型分离株攻毒小母猪，且评估小母猪中活产仔猪的总共或活产仔猪及20日龄断乳仔猪的百分比以确定MID。在第118天(D118)攻毒时，攻毒对照组由8只怀孕小母猪组成(第1组，安慰剂)，低效价组由8只怀孕小母猪组成(第2组，每剂1×102.43TCID50)，高效价组由8只怀孕小母猪组成(第3组，每剂1×103.90TCID50)，且阴性对照组由5只怀孕小母猪组成(第4组，安慰剂，未受攻毒)。与攻毒对照组相比，低效价组与高效价组均引起产仔时每窝活仔猪的百分比较高(P≤0.0455)及断乳时每窝活仔猪的百分比及数目较高(P≤0.0203)。关于支持性功效参数，与攻毒对照组相比，高剂量组引起产仔时每只小母猪的健康仔猪的百分比及数目较高(P≤0.0211)，虚弱及干瘪胎猪的百分比及数目较低(P≤0.0090)，qPCR阳性小母猪的百分比较低及D125、DOF0及DOF+13攻毒后小母猪中的病毒负荷较低(P≤0.0155)，每只小母猪qPCR阳性仔猪的百分比较低及DOF0仔猪病毒负荷较低(P≤0.0030)，每只小母猪具有临床疾病的仔猪的百分比较低(P<0.0001)，及DOF+20仔猪体重及ADWG较高(P<0.0013)。与攻毒对照组相比，低剂量组引起产仔时每只小母猪的健康仔猪的百分比较高(P＝0.0138)，干瘪胎猪的百分比及数目较低(P≤0.0190)，qPCR阳性小母猪的百分比较低及D125、D132、DOF0及DOF+13攻毒后小母猪中的病毒负荷较低(P≤0.0290)，DOF0每只小母猪qPCR阳性仔猪的百分比较低(P＝0.0381)，每只小母猪具有临床疾病的仔猪的百分比较低(P<0.0001)，及DOF+20仔猪体重及ADWG较高(P<0.0028)。总之，达到研究目标且来自此研究的数据确定小母猪中PRRS94881MLV的MID为1×102.43TCID50/2mL。此外，此研究确定小母猪中的免疫力持续时间(DOI)为约4个月。研究的目标/目的此疫苗接种-攻毒研究的目标为评估猪生殖与呼吸综合征疫苗欧洲来源分离株94881的经修饰活病毒代码19T1.U_(PRRS94881MLV)的最小免疫剂量(MID)，其以两种不同效价水准(第2组，低效价；第3组，高效价)在繁育前给予PRRS血清阴性小母猪，以使在妊娠约90天时用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSv)的异源性欧洲型分离株攻毒小母猪后，活产仔猪及21日龄断乳仔猪的百分比较高。满足此目标的主要准则为一或两个疫苗组必须证明与攻毒对照组(第1组)相比，活产仔猪及20日龄(DOF+20)断乳仔猪的百分比或数目相应较高。在疫苗组与攻毒对照组之间分析的其他参数包括疫苗接种后小母猪临床评定、小母猪PRRS血清学、小母猪病毒血症、小母猪临床观察、仔猪病毒血症、每窝总仔猪、每窝健康活仔猪、每窝虚弱活仔猪、每窝干尸、每窝死胎、每窝挤压/死亡仔猪、仔猪临床观察及仔猪平均日增重(ADWG)。这些参数作为支持性参数分析且不用作满足研究目标的主要参数。事件时程表6.1小母猪的事件时程*DOF＝产仔日表6.2仔猪的事件时程研究设计表6.3研究设计盲法准则研究调查者及被指定者对分配至第1-4组的小母猪不知情。为维持研究调查者及被指定者不知情，由非数据收集者在D0向所分配小母猪给予IVP及CP。实验室工作人员在进行其各别任务时对每只小母猪接受的处理不知情。材料研究性兽医产品(IVP)及对照产品(CP)表6.4研究性兽医产品(IVP)表6.6：对照产品(CP)攻毒材料表6.7攻毒材料额外处理D8至D21，将MatrixTM(6.8mL；Alternogest；Intervet/ScheringPloughAnimalHealth)给予各小母猪饲料中以使动情周期同步。在分娩时给予催产素(VetTek)以帮助小母猪产仔，而非引发产仔。产仔时，所有活仔猪经肌内在右大腿接受1.0mL铁注射液(Phoenix或Durvet)，以防止出生后不久发生缺铁性贫血。另外，所有活仔猪均接受庆大霉素(gentamicin)(SparHawkLaboratoriesInc)作为出生后不久的腹泻预防措施。所有处理均记录在生物与医药处理记录表格(Biological&PharmaceuticalTreatmentRecordform)上。处理给药合理性判断各IVP以2.0mL剂量给予所分配的小母猪以评估PRRS94881MLV的MID。2.0mL剂量的CP给予分配至第1组及第4组的小母猪。给药方案在D0，通过非研究数据收集者，使用无菌3.0mLLuer-lock注射器及无菌18g×1英寸(2.54cm)针将各IVP或CP经肌内给予各相应小母猪的右颈区。给药方案展示于下表6.8中。表6.8给药方案组数目处理剂量/途径研究天数128CP2.0mLIMD0228IVP第1号(低效价剂量)2.0mLIMD0328IVP第2号(高效价剂量)2.0mLIMD0410CP2.0mLIMD0研究工作人员的方法及防范措施给予IVP、CP及攻毒材料的工作人员遵循安全性守则且穿上如针对特别研究场所概述的个人防护装置。动物信息研究动物的详情表6.9动物信息入选/排除准则所有参加此研究的小母猪均为PRRSELISA阴性的未生育小母猪，且在疫苗接种时如观察结果所确定为健康的。入选后小母猪的移除五(5)只第1组小母猪(第5、15、34、35及52号)、两(2)只第2组小母猪(第77及94号)、三(3)只第3组小母猪(第2、25及30号)及一(1)只第4组小母猪(第20号)未显示动情期，且因此不生育。这些小母猪在D47自研究移除。两(2)只第1组小母猪(第109及110号)、九(9)只第2组小母猪(第56、59、60、69、73、75、76、78及103号)、四(4)只第3组小母猪(第22、28、51及53号)及一(1)只第4组小母猪(第21号)在D89因跛行、未怀孕或生育延迟而自研究移除。研究方案说明，若第1-3组每组超过16只怀孕小母猪在攻毒之前仍在研究中，则随机选择额外的小母猪自研究中移除；因此第1-3组每组留下16只怀孕小母猪。基于统计学家随机化，或由非研究人员选择，将五(5)只第1组小母猪(第3、8、39、90及101号)、一(1)只第2组小母猪(第70号)及五(5)只第3组小母猪(第42、80、86、91及105号)于D104自研究移除，将第1-3组的组规模减少至16只小母猪。由于空间限制，研究调查者要求第4组的规模自八(8)只减少至五(5)只。统计学家随机选择三(3)只小母猪(第10、24及29号)自研究中移除，于D109移除。动物管理及圈养动物圈养D-1至研究结束，低IVP效价小母猪圈养在VRI-Cambridge的BuildingCB中的房间1及2中，且高IVP效价小母猪圈养在房间3及4中。D-1至D85，分配至攻毒对照组及阴性对照组的小母猪圈养在VRI-Risdal的单个房间中。在D85，攻毒对照组及阴性对照组中剩余小母猪移至VRI-Cambridge。研究的其余时间，十六(16)只攻毒对照小母猪圈养在BuildingCB房间5-8中，且八(8)只阴性对照小母猪圈养在BuildingCA房间12中。自D85起，各房间布局一致，其中有两列，每列4个产仔笼。每笼容纳一只小母猪及其子代。每笼尺寸为约5英尺×7英尺，将其自地面抬高，侧面为金属杆面板且地板为塑胶网。相邻笼之间无近距离的接触。每笼的地板每日冲洗至少一次，以移除排泄物及废物。每个房间具有独立的加热及通风，防止房间之间空气交叉污染。在用于此研究之前，每个房间均进行清洁及消毒。动物服务人员在进入每个房间之前淋浴且穿上干净衣服。此研究中需要隔离处理组，因为科学界熟知PRRSv容易经由各种机制(包括气溶胶化)在猪之间传播。其包括无毒性活PRRS疫苗，因为这些生物产品包括模拟毒性野生型PRRS的特征而无引起疾病能力的减毒病毒粒子。适当方法宜确保维持生物安全性，且疫苗接种动物未意外地与未接种疫苗的PRRSv未处理阴性对照动物交叉污染。实验室中的每个房间均具有风扇及加热器以促进充分的空气循环及加热。每个房间的通风系统独立而相同，因此房间之间空气不共享。固体饲料储存于袋中，无害虫。水可自位于动物实验室的井随意获取。小母猪进食适于其体型、年龄及情况的商业上制备的未加入药物的妊娠或哺乳期食物(HeartofIowaCooperative，Roland，IA)。如研究调查者所确定，在开始研究之前，小母猪处于良好健康及营养状态中。研究期间，观察到两只小母猪轻度跛行且观察到一只小母猪左颈区肿胀。研究调查者认为所有这些情况均为密闭圈养的小母猪组中通常存在的非特异性情况。研究调查者确定在此研究期间任何动物均不需要伴随处理。所有分配至第1-3组的小母猪及其小猪在实施安乐死后通过商业焚化进行处置。分配至第4组的小母猪在实施安乐死后通过炼油(rendering)进行处置。第4组仔猪未实施安乐死及处置，而是分配给另一BIVI计划。无来自参加此研究的动物的食品进入人类食物链。功效评定为评定PRRS94881MLV的MID，在D118攻毒低效价组(第2组)及高效价组(第3组)，且评估攻毒后的生殖效能及断乳仔猪。满足此目标的主要准则为：必须证明与攻毒对照组(第1组)相比，一或两个疫苗组的活产仔猪及20日龄(DOF+20)断乳仔猪的百分比或数目在统计学上较高。在疫苗组与攻毒对照组之间为证明功效而分析的其他参数包括疫苗接种后小母猪临床评定、小母猪PRRS血清学、小母猪病毒血症、攻毒后小母猪临床观察、产仔时仔猪病毒血症、每窝仔猪总共、每窝健康活仔猪、每窝虚弱活仔猪、每窝干尸、每窝死胎、每窝挤压/死亡仔猪、仔猪临床观察及仔猪ADWG。有效测试的准则任何分析中均不包括阴性对照组(第4组)。研究中包括阴性对照组以证明小母猪的源头在其他三组受攻毒时为PRRS阴性。此外，阴性对照组必须保持PRRS阴性，直至研究结束，以排除可能引入野外PRRSv或来自攻毒组的意外交叉污染。购买前及D0血清样品均要求PRRS抗体阴性。直至攻毒之日自第1及4组收集的血清样品必须不含PRRS抗体，且直至研究结束自第4组收集的血清样品必须不含PRRS抗体，以使研究有效。主要结果参数统计学评估的主要功效变量为每只小母猪的出生时活仔猪(平均数目或百分比)及DOF+20每窝活仔猪(平均数目及百分比)。9.2.1每只小母猪的出生时活仔猪的百分比研究期间记录每只小母猪的产仔数据。每只小母猪的产仔日(DOF)定义为第一只仔猪出生之日。在产仔时，每只仔猪归类为下表6.10中所列出的五个类别之一。出生时活仔猪定义为出生时观察评级为健康活仔猪、虚弱活仔猪或挤压/死亡仔猪(因挤压引起的死亡在如下所述的尸检时证实)的任何仔猪。通过研究调查者或被指定者进行观察且记录在每窝产仔进展记录表格上。表6.10产仔结果类别DOF+20时的每窝活仔猪如下表6.11中概述，DOF+1至DOF+20，观察仔猪的疾病临床征象。通过研究调查者或被指定者进行观察且记录在临床观察记录表格上。表6.11临床观察评分系统每日总临床观察评分通过统计学家使用SAS程序将呼吸、行为及咳嗽评分求和来确定。DOF+20时的临床评分为0至8的任何仔猪评定为DOF+20存活。支持性参数在疫苗组与攻毒对照组之间分析的其他参数包括疫苗接种后小母猪临床评定、小母猪PRRS血清学、小母猪病毒血症、小母猪临床观察、仔猪病毒血症、每窝总仔猪、每窝健康活仔猪、每窝虚弱活仔猪、每窝干尸、每窝死胎、每窝挤压/死亡仔猪、仔猪临床观察及仔猪平均日增重(ADWG)。小母猪每日评定通过研究调查者或被指定者，在疫苗接种后，在D-1至D21，每日观察所有小母猪一次，且在D22至115，一周观察至少三次，以进行每日评定。观察结果记录在每日评定记录表格上。小母猪PRRS血清学在购买之前及在D0、D7、D14、D21、D56、D84、D118、D125、D132、DOF0、DOF+7、DOF+13及DOF+20，自小母猪收集静脉全血。在产仔/流产结束后即刻自产仔/流产(DOF0)的小母猪收集血液，或至产仔/流产后8小时收集。简言之，自每只小母猪收集约10mL血液至适当尺寸的血清分离管(SST)中。样品收集记录在样品收集记录表格上。让SST中的血液在室温下凝结。工作日收集的血液样品于收集当天传递至BIVI-Ames。周末收集的血液样品于收集当天由VRI工作人员处理。VRI的血清样品保存在2-8℃。在BIVI-Ames或VRI，血液样品短暂离心且收获血清，分离且转移至适当管中。每个管标记上小母猪的ID号、研究号、收集日期、研究天数及样品类型。VRI的血清样品在最早适宜的时间传递至BIVI-Ames。每次装运包括完整的样品传递记录表格。在BIVI-Ames，一组血清样品保存在2-8℃且其他组的血清样品保存在-70±10℃。通过BIVI-Ames测试该组保存在2-8℃的小母猪血清样品的PRRS抗体。结果报导为阴性(ELISAS/P比率<0.4)或阳性(ELISAS/P比率≥0.4)。攻毒后小母猪临床观察在D116至DOF+20，观察小母猪的疾病临床征象。通过研究调查者或被指定者进行观察。基于上表6.11中概述的临床观察评分系统，每天观察小母猪的呼吸、行为及咳嗽。仔猪PRRS病毒血症在DOF0、DOF+7、DOF+13及DOF+20，或当发现仔猪死亡时，自仔猪收集静脉全血。优选自新生仔猪收集初乳前血液，但不是强制的。若无法收集初乳前血液，可收集产仔12小时以内的围产期血液。非第一次吸奶之前收集的样品标记为“围产期”且与初乳前样品分开。简言之，自每只活仔猪收集约2.0至2.5mL血液至适当尺寸的血清分离管(SST)中。在临实施安乐死前于DOF+20自每只仔猪收集最少5.0mL血液。自每个干尸或死胎收集血液，或若血液无法自死胎收集，则收集胸部或腹部流体。样品收集记录在样品收集记录表格上。仔猪平均日增重通过研究调查者或被指定者，于DOF0及DOF+20或发现仔猪死亡当天对个别仔猪称重。DOF0的个别体重记录在每窝产仔进展记录表格上，且DOF0后的体重记录在体重记录表格上。肺组织中的PRRS病毒定量测定在分娩时死亡或在DOF+20之前垂死的所有仔猪均由研究调查者进行尸检。尸检结果及诊断记录在尸检报告表格上。自每只尸检仔猪收集两个肺样品。一个样品置放于单独容器中，且另一样品置放于填充有足够体积的10％甲醛(formalin)的适当容器中。样品收集记录在尸检报告表格上。及甲醛容器适当标记有动物编号、研究编号、取样日期、研究天数、样品类型及样品来自左侧、右侧抑或两侧。中的样品储存在-70±10℃且10％甲醛中的样品储存在室温下，直至传递至BIVI-Ames。每个样品的传递均包括完成的试样传递记录表格。在BIVI-Ames，中的样品储存在-70±10℃，直至自BIVI-Ames装运至德国，且在BIVI-Ames，甲醛固定的样品储存在室温下。研究结束后，中的冷冻组织样品如上所述装运及测试。甲醛固定的组织样品在收集一周内提交给ISUVDL以包埋于石蜡块中。石蜡块中的组织返回至BIVI，且目前由BIVI-Ames保存在室温下供未来可能测试。研究赞助人及监测者在研究报告完成后将决定这些样品保留抑或弃去。不良事件此研究期间未报导有归因于IVP的不良事件。关于不良事件的更多信息，请参见12.6部分疫苗接种后小母猪评定。统计学方法实验单元在此研究中处理组必须圈养在各别房间以避免活PRRSv疫苗传播至未接种疫苗组。因此，房间为实验单元。然而，出于此分析的目的，忽略由混杂“房间”及“处理”影响所产生的可能偏离，且小母猪及其相应同窝仔畜作为实验单元进行分析。随机化在D0之前，将来自107只测试合格小母猪组的九十四(94)只PRRS血清阴性小母猪分配至四组之一。第1-3组各由28只小母猪组成。第4组由10只小母猪组成。对于第1组，在装运之前，第45号及第55号因健康原因而被农场管理者排除，且分别替换为两只其他小母猪第15号及第18号。对于第3组，在装运之前，第44号因健康原因而被农场管理者排除，且替换为另一小母猪第25号。由于攻毒时的空间限制，第1-3组限于每组16只小母猪，且第5组限于5-8只小母猪。对于第1-3组，在D85，每组随机选择16只小母猪保留在研究中。因为D85时第4组由8只小母猪组成，所以此组不通过随机化进一步减少。之后，研究调查者要求第4组自8只小母猪减少至5只小母猪。对于第4组，在D109，随机选择5只小母猪保留在研究中。所有随机化程序均由生物统计学家进行。分析统计分析及数据概述由Dr.rer.hort.MartinVanselow，Biometrie&Statistik，ZumSiemenshop21，30539Hannover，Germany，+49(0)511606777650，m.vanselow@t-online.de进行。统计分析的主要目标为比较两个PRRS94881MLV疫苗组(第2组及第3组)与未接种疫苗的攻毒对照组(第1组)。所有数据均输入SAS中以进行管理及评估。数据自研究赞助人以经验证的SAS数据集形式接受。排除日期前，分析的各别参数考虑自研究退出的情况。所有数据均基于变量类型加以描述性概述(数目、最小值、最大值、平均值、中值、标准偏差、四分位数间距或频率分布、置信区间)。统计分析使用SAS软件版本8.2(SAS，2001，Cary，NorthCarolina，USA:SASInstituteInc.)进行。研究的统计学评估的变量：主要变量产仔/流产时(DOF+0)活仔猪的比例20日龄(DOF+20)活仔猪的比例支持性变量疫苗接种后小母猪临床评估小母猪PRRS血清学小母猪病毒血症小母猪临床观察仔猪病毒血症生殖效能仔猪临床观察仔猪平均日增重(ADWG)待测试的假设及作出的设想：自统计测试排除未攻毒的阴性对照组(第4组)。将低效价组及高效价组(分别为第2组及第3组)与攻毒对照组(第1组)进行比较。组间的所有测试均设计为关于差异的双侧检验。在所有测试的情况下，仅在P≤0.05时，差异视为统计上显著。若与攻毒对照组相比，一或两个疫苗组的活产仔猪的百分比或数目及DOF+20断乳仔猪的百分比或数目显著较高，则证明有效。关于数据操纵及评估的详情：疫苗接种后小母猪的临床评定产生在研究第1天与第21天之间及研究第1天与第113天之间具有至少一个阳性发现结果的动物的频率表。通过费希尔精确检验(Fisher'sexacttest)测试攻毒对照组与疫苗组之间的差异。攻毒后小母猪的临床观察产生在研究第116天与DOF+20之间具有至少一个阳性发现结果的动物的频率表。通过费希尔精确检验测试攻毒对照组与疫苗组之间的差异。小母猪的血清学产生研究第7、14、21、56、84、118、125、132天(产仔前)及DOF+0、DOF+7、DOF+13及DOF+20时“阳性”ELISA结果的频率表。通过费希尔精确检验测试攻毒对照组与疫苗组之间的差异。小母猪的病毒血症分别评估每个研究日(产仔前研究第7、14、21、56、84、118、125、132及DOF+0、DOF+7、DOF+13及DOF+20)的病毒血症数据。为定性评估qPCR数据，分析结果‘未检测’(‘n.d.’)及‘阴性’归类为‘阴性’，且分析结果‘阳性’及测量值归类为‘阳性’。为定量评估，‘未检测’(‘n.d.’)及‘阴性’替换为0.0的log10GE/mL值，且‘阳性’替换为3.0。定量PCR数据(PRRS病毒负荷[log10GE/mL])用于在攻毒对照组(第1组)与处理组2及3之间使用魏氏-曼-惠特尼检验(WilcoxonMann-Whitneytest)进行比较。产生‘阳性’qPCR结果的频率表。通过费希尔精确检验测试攻毒对照组与疫苗组之间的差异。生殖效能确定DOF+20时每只小母猪总共、活、健康、虚弱、死产、死亡及活仔猪的绝对频率且作为单一值用于组间比较。相对于产仔时的仔猪总共，计算每只小母猪活、健康、虚弱、死产及死亡仔猪的相对频率且作为单一值用于组间比较。相对于产仔时活仔猪的数目，减去死亡及挤压仔猪的数目，计算DOF+20时每窝活仔猪的百分比。通过魏氏-曼-惠特尼检验测试攻毒对照组与疫苗组之间的差异。仔猪的病毒血症分别评估每个研究日(DOF+0、DOF+7、DOF+13及DOF+20)的病毒血症数据。为定性评估qPCR数据，分析结果‘未检测’(‘n.d.’)及‘阴性’归类为‘阴性’，且分析结果‘阳性’及测量值归类为‘阳性’。计算每窝‘阳性’仔猪的百分比且作为单一值用于通过魏氏-曼-惠特尼检验进行的组间比较。为定量评估，‘未检测’(‘n.d.’)及‘阴性’替换为0.0的log10GE/mL值，且‘阳性’替换为3.0。计算每窝中值qPCR值且作为单一值用于通过魏氏-曼-惠特尼检验进行的组间比较。对于概要统计，使用个别qPCR数据。仅描述性评估肺样品中的病毒负荷。仔猪的体重及平均日增重计算DOF+0与DOF+20之间时间段的个别平均日增重(ADWG)。处理组之间的差异通过变异数分析(ANOVA)及后续t检验进行测试。所述组的最小平方平均值及具有95％置信区间的最小平方平均值之间的差异自ANOVA得出。以DOF+0的体重为共变量，重复DOF+20及ADWG的分析。描述性概述每只小母猪的仔猪体重数据。仔猪的临床观察计算在研究天数DOF+1与DOF+20之间每窝具有至少一个阳性发现结果的仔猪的百分比，且作为单一值用于通过魏氏-曼-惠特尼检验进行的组间比较。采取完全随机的设计结构分析数据。结果小母猪生殖效能攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的产仔时每窝活仔猪(健康+虚弱+挤压/死亡)的平均百分比分别为54.4％、75.1％、72.3％及93.0％。与攻毒对照组相比，低效价组及高效价组的产仔时每窝活仔猪的百分比显著较高(P≤0.0455)。攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的产仔时每窝活仔猪的平均数目分别为6.5、8.3、8.6及10.8。在组之间未检测到产仔时每窝活仔猪的数目的显著差异(P≥0.1039)。攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的每窝健康活仔猪的平均百分比分别为41.4％、65.8％、67.9％及93.0％。与攻毒对照组相比，低效价组及高效价组的产仔时每窝健康活仔猪的百分比显著较高(P≤0.0138)。攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的产仔时每窝健康活仔猪的平均数目分别为4.9、7.2、8.1及10.8。与攻毒对照组相比，高效价组的产仔时每窝健康活仔猪的数目显著较高(P＝0.0211)，而低效价组则未检测到差异(P＝0.0640)。攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的产仔时每窝虚弱活仔猪的平均百分比分别为7.4％、7.1％、0.4％及0.0％。攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的产仔时每窝虚弱活仔猪的平均数目分别为0.9、0.8、0.1及0.0。与攻毒对照组相比，高效价组的产仔时每窝虚弱活仔猪的百分比及数目显著较低(P≤0.0090)。相反，在低效价组与攻毒对照组之间未检测到产仔时虚弱活仔猪的百分比或数目的差异(P≥0.8569)。攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的产仔时每窝干尸的平均百分比分别为28.1％、14.1％、8.7％及0.0％。攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的产仔时每窝干尸的平均数目分别为3.1、1.6、0.9及0.0。与攻毒对照组相比，低效价组与高效价组的产仔时每窝干尸的百分比及数目均显著较低(P≤0.0190)。在两个疫苗效价组与攻毒对照组之间未检测到产仔时每窝死产或死亡/挤压仔猪的百分比或数目的显著差异(P≥0.1681)。组中DOF时的生殖效能结果(每窝仔猪百分比及每窝仔猪数目)的概述示于下表6.12及6.13中。表6.12：组中DOF时的生殖效能结果(每窝仔猪百分比)的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组表6.13：组中DOF时的生殖效能结果(每窝仔猪数目)的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组DOF+20存活仔猪这些评分突出断乳时(20日龄)活仔猪的数目。组中DOF+20时每窝活仔猪的百分比及数目的概述示于上表6.12及6.13中。攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的断乳时(DOF+20)每窝活仔猪的平均百分比分别为43.6％、73.8％、83.8％及100.0％。攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的断乳时每窝活仔猪的平均数目分别为2.9、6.2、6.9及10.8。与攻毒对照组相比，低效价组与高效价组的断乳时(DOF+20)每窝活仔猪的百分比及数目均显著较高(P≤0.0203)。小母猪qPCR病毒血症D0时，所有小母猪的PRRSvRNA均呈qPCR阴性。所有攻毒对照及阴性对照小母猪保持PRRSvRNA呈qPCR阴性，直至且包括攻毒之日(D118)。阴性对照组在研究的其余时间均保持qPCR阴性，其中小母猪第108号除外，其在DOF+7时为‘阳性’。通过qPCR测试，小母猪第108号在其他时间点PRRSvRNA呈阴性。疫苗接种后，在D7，分别50％及36％的低效价及高效价小母猪对PRRSvRNA呈qPCR阳性(P≤0.0007)。D14至D56，仅4％低效价小母猪保持qPCR阳性，而在此观察期期间，至多4％高效价小母猪间断地为qPCR阳性。D14至D56，在疫苗组与攻毒对照组之间未检测到对PRRSvRNA为qPCR阳性的小母猪的百分比的差异(P＝1.0000或未进行测试)。D84及D118(攻毒之日)时，所有疫苗接种的小母猪对PRRSvRNA均为qPCR阴性。攻毒后，在第125天、DOF0及DOF+13时，与攻毒对照组相比，低效价及高效价组中对PRRSvRNA为qPCR阳性的小母猪的百分比在统计学上较低(P≤0.0155)。D132时，低效价组中对PRRSvRNA为qPCR阳性的小母猪的百分比显著较低(P＝0.0290)；而在高效价组与攻毒对照组之间未检测到统计差异(P＝0.1556)。DOF+7及DOF+20时，在疫苗组与攻毒对照组之间未检测到对PRRSvRNA为qPCR阳性的小母猪的百分比的显著差异(P≥0.1719)。组中D7至DOF+20时对PRRSvRNA为qPCR阳性的小母猪的百分比的概述示于下表6.14及6.15中。表6.14：组中D7至D132时对PRRSvRNA为qPCR阳性的小母猪的百分比的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组；n.a.＝不适用，未进行测试表6.15：组中DOF0至DOF+20时对PRRSvRNA为qPCR阳性的小母猪的百分比的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组D7时，与攻毒对照组相比，两个疫苗组的中值病毒负荷均显著较高(P≤0.0007)。D14至D56，在疫苗组与攻毒对照组之间未检测到病毒负荷的差异(P＝1.0000)。D84及D118(攻毒之日)时，所有疫苗接种的小母猪的病毒负荷均为0。攻毒后，在D125、DOF0及DOF+13，与攻毒对照组相比，低效价组及高效价组的中值病毒负荷统计学较低(P≤0.0155)。D132时，低效价组的中值病毒负荷显著较低(P＝0.0230)；而在高效价组与攻毒对照组之间未检测到统计差异(分别为0.94及1.97log10GE/mL；P＝0.1144)。DOF+7及DOF+20时，在疫苗组与攻毒对照组之间未检测病毒负荷的显著差异(P≥0.1719)。组中D7至DOF+20时的平均小母猪qPCRGE/mL结果的概述示于下表6.16及6.17中。表6.16：组中D7至D132时的小母猪qPCR结果(log10GE/mL)的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组表6.17：组中DOF0至DOF+20时的小母猪qPCR结果(log10GE/mL)的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组攻毒后小母猪临床观察评分在D116至DOF+20，攻毒对照、低效价、高效价及阴性对照小母猪分别有25％、25％、38％及60％在D116至DOF+20中至少一天显示临床疾病。D116至DOF+20时，在疫苗组与攻毒对照组之间未检测到对临床疾病为阳性的小母猪的频率的显著差异(P≥0.7043)。组中D116至DOF+20中至少一天对临床疾病为阳性(临床观察评分>0)的小母猪的百分比的概述示于下表6.18中。表6.18：组中D116至DOF+20中至少一天对临床疾病为阳性(临床观察评分>0)的小母猪的百分比的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组小母猪PRRSELISA血清学所有小母猪在D0及D7时均为PRRS血清阴性。所有攻毒对照及阴性对照小母猪保持PRRS血清阴性直至且包括攻毒之日(D118)；而阴性对照组在研究其余时间保持PRRS血清阴性(DOF+20)。在D14，低效价及高效价小母猪分别有18％及21％为PRRS血清阳性。与攻毒对照组相比，高效价组D14时的PRRS血清阳性小母猪的百分比显著较高(P＝0.0232)，而低效价组则未检测到差异(P＝0.0515)。D56时，低效价组及高效价组的这些百分比分别达到组中65％及60％的高点(P<0.0001)。在攻毒之日(D118)，低效价及高效价小母猪分别有56％及50％为PRRS血清阳性(P≤0.0024)。D125时，攻毒对照、低效价及高效价小母猪分别有6％、88％及100％为PRRS血清阳性；且疫苗组与攻毒对照组之间的差异显著(P<0.0001)。D125后，所有剩余的攻毒对照、低效价及高效价小母猪在研究其余时间均为PRRS血清阳性(未进行测试)。组中D14至DOF+20时的PRRSELISA血清学结果的概述示于下表6.19及6.20中。表6.19：组中D14至第132天的小母猪PRRSELISA血清学结果的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组；n.a.＝不适用，未进行测试表6.20：组中DOF0至DOF+20时的小母猪PRRSELISA血清学结果的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组。**未对来自小母猪第106号的样品进行测试。n.a.＝不适用，未进行测试疫苗接种后小母猪评定在任一组中均未检测到D1至21的异常评定，且未进行测试。在D1至D113，分别有4％、4％、0％及10％的攻毒对照、低效价、高效价及阴性对照小母猪在D1至D113中至少一天显示异常评定。在D1至D113，在疫苗组与攻毒对照组之间未检测到异常评定的显著差异(P＝1.0000)。个别地，第109号(攻毒对照组)在D85显示右后腿跛行，第12号(低效价组)在D78至D89显示左颈区肿胀，且第21号(阴性对照组)在D81至D83显示跛行。组中在D1至D21及D1至D113中至少一天显示异常评定的小母猪的百分比，概示于下表6.21中。表6.21：组中D1至D113中至少一天的异常评定的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组仔猪临床观察评分攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组中每窝在DOF+1至DOF+20中至少一天对临床疾病为阳性(临床观察评分>0)的仔猪的平均百分比分别为91.6％、32.5％、33.4％及3.2％。与攻毒对照组相比，低效价及高效价组中每窝在DOF+1至DOF+20中至少一天对临床疾病为阳性的仔猪的百分比显著较低(p≤0.0001)。组中每窝DOF+1至DOF+20中至少一天对临床疾病为阳性(临床观察评分>0)的仔猪的百分比的概述示于下表6.22中。表6.22：组中每窝在DOF+1至DOF+20中至少一天对临床疾病为阳性(临床观察评分>0)的仔猪的百分比的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组仔猪血清/体液qPCR结果DOF0时，分别86.3％、58.1％、55.0％及0％的攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组每窝仔猪平均值对PRRSvRNA呈qPCR阳性。DOF0时，与攻毒对照组相比，低效价及高效价组中每窝对PRRSvRNA呈qPCR阳性的仔猪百分比在统计学上较低(P≤0.0381)。DOF+7时，与攻毒对照组相比，低效价及高效价组中每窝对PRRSvRNA呈qPCR阳性的仔猪百分比再次显著较低(P≤0.0293)。DOF+13时，仅低效价组的每窝qPCR阳性仔猪百分比显著较低(P＝0.0216)；而未检测到高效价组与攻毒对照组的每窝qPCR阳性仔猪百分比的显著差异(P＝0.0860)。DOF+20时，未检测到组间显著差异(P≥0.0614)。组中每只小母猪的血清/体液qPCRPRRSv阳性仔猪的百分比的概述示于下表6.23中。表6.23：组中每只小母猪的血清/体液qPCRPRRSv阳性仔猪的百分比的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组DOF0时，与攻毒对照组相比，高效价组的中值qPCR结果显著较低(P＝0.0030)；而在低效价组与攻毒对照组之间未检测到差异(P＝0.0620)。DOF+7、DOF+13及DOF+20时，与攻毒对照组相比，两个疫苗组的中值qPCR值均显著较低(p≤0.0122)。组中每只小母猪的仔猪血清/体液qPCRGE/mL结果的概述示于下表6.24中。表6.24：组中每只小母猪的仔猪血清/体液qPCR结果(log10GE/mL)的概述(组间差异的P值是基于中值qPCR值)*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组仔猪ADWGDOF0时，在组之间未检测到LS平均体重的差异(P≥0.2972)。DOF+20时，在将或不将DOF0体重因子化成为分析中的共变量的情况下，与攻毒对照组相比，两个疫苗组的最小平方平均体重均较高(P<0.0028)。攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的DOF0至DOF+20时的平均ADWG分别为0.1kg/天、0.2kg/天、0.2kg/天及0.2kg/天。在将或不将DOF0体重因子化成为分析中的共变量的情况下，与攻毒对照组相比，两个疫苗组的ADWG均显著较高(P<0.0028)。组中DOF0及DOF+20的仔猪体重及DOF0至DOF+20的ADWG(kg/天)的概述示于下表6.25及6.26中。表6.25：组中DOF0及DOF+20仔猪体重及DOF0至DOF+20ADWG(kg/天)的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组表6.26：组中LS平均体重及DOF0至DOF+20ADWG(kg/天)的概述-关于组间差异的测试结果(P值)*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组。**DOF+0时的体重用作共变量。仔猪尸检观察及诊断除8只胎猪外，产仔时列为死胎、干尸或挤压的胎猪在尸检时证实为分类正确。虽然两只攻毒对照胎猪列为死胎(40-S1、66-S1)，但尸检结果揭示肺膨胀，指示其在出生时为活的。虽然两只攻毒对照胎猪列为挤压(1-C1、79-C2)，但尸检结果显示两只胎猪的肺未膨胀，指示其未呼吸。虽然一只低效价胎猪列为死胎(85-S2)，但尸检结果揭示肺膨胀，指示该仔猪在出生时为活的。虽然三只高效价仔猪列为挤压(36-C1、36-C2、65-C1)，但尸检结果揭示两只胎猪的肺未膨胀，指示其未呼吸。由于产仔时未正确列出的胎猪数目较少，所以小母猪效能分析无变动。一只攻毒对照仔猪102-428在收集血液后死亡，此经尸检证实。仔猪肺qPCR结果在尸检的胎猪及死亡仔猪中，攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的平均肺qPCR结果分别为4.68、4.09、3.55及0.0log10GE/mL。不对这些数据进行统计分析。组中肺PRRSvqPCR结果(log10GE/mL)的概述示于下表6.27中。表6.27：组中仔猪肺PRRSvqPCR结果(log10GE/mL)的概述*第1组＝攻毒对照组；第2组＝低效价PRRS94881MLV组；第3组＝高效价PRRS94881MLV组；第4组＝阴性对照组讨论/结论为达成研究目标，D0时，将四组易感染PRRS的小母猪包括在研究设计中：接受对照产品的攻毒对照组(第1组)；接受1×102.43TCID50PRRS94881MLV的低效价疫苗组(IVP第1号，第2组)；接受1×103.90TCID50PRRS94881MLV的高效价疫苗组(IVP第2号，第3组)；及亦接受对照产品的阴性对照组(第4组)。各处理在配种前约28天(D0)经肌内以2.0mL剂量给予。为确定PRRS94881MLV的最小免疫剂量，两个疫苗效价组及攻毒对照组在D118(妊娠约90天)时用异源性欧洲型PRRSv分离株(分离株190136)攻毒，且攻毒后评估出生时(产仔之日，DOF)每窝活仔猪的百分比及数目以及21日龄(DOF+21)每窝活仔猪的百分比及数目。研究的验证(阴性对照组4)为确保源小母猪无PRRSv且研究期间在处理组及对照组中未发生外来PRRSv暴露或交叉污染，研究设计中包括阴性对照组(第4组)。阴性对照小母猪在整个研究中对PRRS抗体呈阴性。此外，此组小母猪及其子代在所有测试时间点亦对PRRSv病毒血症呈阴性(qPCR)，DOF+7时第108号除外。小母猪第108号在DOF+7时为“阳性”，而在所有其他时间点为qPCR阴性，且其仔猪亦对PRRSvRNA呈阴性。认为此结果为由样品污染引起而非PRRSv感染引起的误差。这些结果证明阴性对照组在研究期间保持免遭PRRS感染，且验证此试验的结果有效。PRRSv生殖攻毒模型的验证(攻毒对照组1)需要一种涉及诱发足够且可再现PRRS临床疾病的毒性欧洲来源PRRSv株的攻毒模型以在实验室环境下充分评估PRRS疫苗功效。用欧洲型PRRS分离株190136接种(1×106.30TCID50/6mL)后，攻毒对照组显示每窝仅54.4％出生时活仔猪(阴性对照组为93.0％)、每窝分别17.5％及28.1％的死胎及干尸(阴性对照组分别为7.0％及0.0％)、每窝91.6％在DOF+1至DOF+20中至少一天显示临床疾病的仔猪(阴性对照组为每窝3.2％仔猪)、每窝20日龄活仔猪的平均值为2.9只(阴性对照组的平均值为10.8)及每窝86.3％出生时病毒血症仔猪(阴性对照组为0％)。这些结果突出表明，在小母猪及其子代的未接种疫苗的攻毒对照组中诱发严重的PRRS特异性临床疾病，因此验证此攻毒模型为足以评估PRRS疫苗功效及更特别是PRRS94881MLV的MID的临床实验工具。确定小母猪中PRRS94881MLV的最小免疫剂量(低效价及高效价疫苗剂量；第2-3组)小母猪中PRRS94881MLV的MID的确定是基于接受最低效价疫苗的疫苗接种组，与攻毒对照组相比，在攻毒后出生时该疫苗接种组每窝活仔猪的百分比或数目较高及20日龄每窝活仔猪的百分比或数目较高。产仔时每窝活仔猪(百分比或数目)被选为确定PRRS94881MLV的MID的两个关键准则之一。第一关键准则是基于怀孕小母猪及母猪中的PRRSv感染通常导致死胎及干尸且产仔时活仔猪的数目较低的事实。出生时每窝活仔猪定义为产仔时健康活仔猪、虚弱活仔猪及挤压-死亡仔猪的总和。列为挤压或死亡的仔猪包括在“活”类别内，因为尸检研究结果证实这些仔猪在出生时为活的且此后不久因外伤而死亡。低效价组及高效价组均显示与攻毒对照组相比，产仔时每窝活仔猪的百分比显著较高(P≤0.0455)，因此符合疫苗功效的这一准则。虽然在低效价及高效价疫苗组与攻毒对照组之间未检测到产仔时每窝活仔猪的平均数目的显著差异(P≥0.1857)，但低效价及高效价组显示相对于攻毒对照组(每窝平均6.5只仔猪)，产仔时每窝活仔猪的平均数目显著较高(分别为每窝平均8.3只及8.6只仔猪)，因此进一步证明及支持攻毒后在这些动物中观察到有益的疫苗治疗作用。20日龄每窝活仔猪(百分比或数目)为确定PRRS94881MLV的MID的第二准则，因为小母猪PRRS免疫力将影响仔猪的子宫内感染及病毒自小母猪至活仔猪的流动。子宫内感染PRRS且出生时存活的仔猪或产仔后经由自小母猪流出而感染上毒性PRRS的仔猪，通常在断乳之前由PRRS引起死亡。在此研究中，攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组分别显示每窝43.6％、73.8％、83.8％及100％的20日龄活仔猪(P≤0.0203)。同样，攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组每窝20日龄活仔猪的平均数目分别为2.9、6.2、6.9及10.8只(P≤0.0063)。两个疫苗组的断乳时活仔猪的百分比及数目均较高(P≤0.0203)，因此符合研究目标的这一准则。产仔数据的进一步分析揭示支持PRRSv攻毒后疫苗功效的更多信息，尤其是关于高效价组。与攻毒对照组相比，高效价组显示出生时健康仔猪的百分比及平均数目在统计学上较高(P≤0.0211)；同时显示虚弱及干瘪胎猪的百分比及平均数目显著较低(P≤0.0090)。这些数据证明高疫苗剂量针对毒性及异源性PRRSv攻毒株诱导了保护性免疫力。低效价组亦显示产仔时疫苗功效，如每窝健康活仔猪的百分比较高(P＝0.0138)及干瘪胎猪的百分比及平均数目显著较低(P≤0.0190)所证明。相反，在组之间未检测到产仔时死产或挤压/死亡胎猪的百分比或数目的差异(P≥0.1681)。攻毒后7天(D125)，与攻毒对照组相比，通过qPCR测试，低效价组及高效价组中对PRRSvRNA呈阳性的小母猪的百分比显著较低，并且两组的病毒负荷显著较低(P≤0.0001)。这些数据进一步证明两种疫苗剂量在小母猪中诱导足以在攻毒后显著降低病毒复制的免疫力。同样，低效价及高效价组在DOF0及DOF+13时qPCR阳性小母猪的百分比显著较低，并且在这些研究天数时两组的病毒负荷均较低(P≤0.0155)。低效价组在D132时qPCR阳性小母猪的百分比显著较低且病毒负荷较低(P≤0.0290)；而在高效价组与攻毒对照组之间未检测到相同参数的统计学差异(P≥0.1144)。在DOF+7及DOF+20时，在疫苗组与攻毒对照组之间未检测到qPCR阳性小母猪的百分比或病毒负荷的统计学差异(P≥0.1719)。通常PRRSv不在小母猪及母猪中诱发除流产以外的临床疾病。在此研究中，分别有25％、25％、38％及60％的攻毒对照、低效价、高效价及阴性对照小母猪在攻毒后至少一天显示临床疾病(得到临床观察评分>0)。在疫苗组与攻毒对照组之间未检测到D116至DOF+20中至少一天具有临床疾病的小母猪的百分比的显著差异(P≥0.7043)。显示某种形式的临床疾病的小母猪，是在临产时显示而非在攻毒后即刻显示。显示临床疾病的阴性对照小母猪的百分比很高(60％)，并且此研究中所有组的临床疾病均主要在接近产仔时才注意到，上述事实证明临床疾病并非PRRS疾病的结果，而是与分娩有关的生理变化的结果。研究中的所有小母猪在D0时均为PRRSELISA血清阴性，因此证实测试动物符合进入研究的入选准则。同样，所有小母猪在D7时均为PRRSELISA血清阴性。疫苗接种的小母猪在D14时开始显示PRRSELISA血清阳性结果，且低及高剂量组显示在D56时其最高血清转化率分别为65％及60％(P<0.0001)。相反，攻毒对照组保持PRRSELISA血清阴性，直至攻毒后7天(D125)。自D132至研究结束，所有低效价、高效价及攻毒对照小母猪均为PRRSELISA血清阳性。两个疫苗组的疫苗接种后病毒血症阳性小母猪的百分比在D7时达到最高值，如低效价及高效价组分别为50％及36％所证明(P≤0.0007)。低效价组及高效价组的病毒血症在D14时分别迅速下降至4％(28只中1只，第64号)及0％(28只中0只)(P＝1.0000或未进行测试)。D21时，低效价组(28只中1只，第56号)及高效价组(28只中1只，第91号)中病毒血症保持在4％。D56时，26只低效价小母猪中1只(4％，第89号)及25只高效价小母猪中1只(4％，第66号)为病毒血症阳性。所有小母猪在D84及D118时均为病毒血症阴性。在两个疫苗效价组与攻毒对照组之间，未检测到每组疫苗接种后D1至D113中至少一天具有异常临床评定的小母猪百分比的显著差异(P＝1.0000)。个别地，仅三只小母猪显示在此时间范围期间显示任何异常评定。两只小母猪显示跛行(一只攻毒对照小母猪及一只阴性对照小母猪)且一只低效价小母猪显示左颈区肿胀。因为疫苗给予右颈区，所以未注意到与此疫苗相关的不良事件。DOF时的仔猪PRRS病毒血症结果令人进一步了解到小母猪中防止仔猪交叉胎盘感染的保护水准。DOF时，对于每只小母猪，低效价组及高效价组中分别平均有58.1％及55.0％的仔猪为qPCR阳性。相反，攻毒对照组中平均每只小母猪有86.3％的仔猪在血清/体液中呈qPCR阳性，此显著高于两个疫苗组(P≤0.0381)。当检查DOF0时的仔猪病毒负荷时，与攻毒对照仔猪相比，高效价仔猪的病毒负荷显著较低(P＝0.0030)；而在低效价与攻毒对照仔猪之间未检测到病毒负荷的差异(P＝0.0620)。对于每只小母猪，病毒血症呈阳性的仔猪的百分比显著减少(P≤0.05)，这表明在用任一剂量的欧洲型PRRS94881MLV免疫接种的情况下毒性PRRSv自疫苗接种小母猪至后代的垂直传播减少。此外，高效价组DOF时每只小母猪的中值qPCR仔猪值为3.00log10GE/mL；而攻毒对照组的每只小母猪血清/体液中的中值qPCR仔猪值为6.40log10GE/mL(P＝0.0030)。在低剂量组与攻毒对照组之间未检测到DOF时仔猪病毒负荷的显著差异(P＝0.0620)。此数据进一步证明高剂量PRRS94881MLV给予小母猪及母猪时的功效。低效价及高效价组显示每窝DOF+1至DOF+20中至少一天具有临床疾病(临床观察评分>0)的仔猪平均值分别为32.5％及33.4％。这些结果显著低于攻毒对照组，攻毒对照组显示每窝相同参数的仔猪平均值为91.6％(P≤0.0001)，进一步证明两种剂量的疫苗功效。在组之间未检测到DOF0时仔猪平均体重的显著差异(P≥0.2972)；而两个疫苗组的DOF+20体重及DOF0至DOF+20的ADWG显著较高(P≤0.0028)。再次，这些结果证明两种剂量PRRS94881MLV的功效。尸检结果证实产仔时几乎所有胎猪的分类均正确。由于与产仔时正确分类的胎猪的整体数目相比，列为挤压而实际上为死胎及列为死胎而实际上产仔时挤压的胎猪的数目极少，所以在分析小母猪效能数据之前其不变动。一只攻毒对照仔猪在血液收集后死亡。因为与攻毒对照组中庞大整体数目的仔猪相比，此情况仅涉及一只仔猪，所以不自分析移除此仔猪。分别自攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的141、79、75及4只死亡胎猪/仔猪收集肺样品。确定攻毒对照组、低效价组、高效价组及阴性对照组的平均qPCR肺值分别为4.68、4.10、3.55及0.00log10GE/mL。不对这些数据进行分析，因为未对在20日龄时存活的仔猪进行尸检，但这些结果突出表明，当小母猪用毒性PRRSv攻毒时，用PRRS94881MLV进行疫苗接种的小母猪使仔猪肺中的病毒负荷降低。总之，此研究的结果证明与攻毒对照组相比，两个疫苗组的产仔时每窝活仔猪的百分比显著较高(P≤0.0455)及断乳时每窝仔猪的百分比及数目较高(P≤0.0203)。因此达到研究目标，并且来自此研究的数据确定小母猪中PRRS94881MLV的MID为1×102.43TCID50/2mL。这些结果在疫苗接种后118天获得，此外，其确定小母猪中免疫力的持续时间(DOI)为约4个月。当检查支持性数据时，高剂量的PRRS94881MLV(1×103.90TCID50/2mL)引起产仔时每只小母猪的健康仔猪的百分比及数目较高(P≤0.0211)，虚弱及干瘪胎猪的百分比及数目较低(P≤0.0090)，D125、DOF0及DOF+13时qPCR阳性小母猪的百分比较低及攻毒后小母猪中的病毒负荷较低(P≤0.0155)，DOF0时每只小母猪qPCR阳性仔猪的百分比较低及仔猪病毒负荷较低(P≤0.0030)，每只小母猪具有临床疾病的仔猪的百分比较低(P<0.0001)，及DOF+20时的仔猪体重及ADWG较高(P<0.0013)。低剂量组引起产仔时每只小母猪的健康仔猪的百分比较高(P＝0.0138)，干瘪胎猪的百分比及数目较低(P≤0.0190)，qPCR阳性小母猪的百分比较低及D125、D132、DOF0及DOF+13时攻毒后小母猪中的病毒负荷较低(P≤0.0290)，DOF0时每只小母猪qPCR阳性仔猪的百分比较低(P＝0.0381)，每只小母猪具有临床疾病的仔猪的百分比较低(P<0.0001)，及DOF+20时的仔猪体重及ADWG较高(P<0.0028)。实施例7：评估易感染仔猪中在疫苗接种后两周用异源性欧洲型PRRS分离株攻毒后的PRRS94881MLV免疫力产生此疫苗接种-攻毒研究的目标为评定在候选疫苗猪生殖与呼吸综合征欧洲来源分离株94881的经修饰活病毒(PRRS94881MLV)给予14±3日龄易感染仔猪后两周的免疫力产生(OOI)。满足疫苗接种后2周的OOI的主要功效准则为疫苗接种组(第1组)是否证明与未接种疫苗的攻毒对照组(第2组)相比攻毒后肺损伤有显著差异(p≤0.05)。次要参数包括疫苗接种后临床评定、攻毒后临床观察、直肠温度、平均日增重、血清样品中PRRS抗体及病毒血症的评定，以及尸检时收集的肺样品中PRRS病毒的定量。仔猪随机分配至第1组(含有1×103.82TCID50/mL的PRRS94881MLV-疫苗且受攻毒；n＝20)、第2组(安慰剂疫苗且受攻毒；n＝20)或第3组(安慰剂疫苗且未受攻毒；n＝10)。仔猪圈养在地板升高的塑胶围栏中(n＝5只/围栏)。各处理组圈养在不同房间以避免PRRSv经由机械途径，包括气溶胶化传播。所有分配给此研究的动物均完成该研究。此研究期间未报导有不良事件。PRRS94881MLV接种猪及攻毒对照的D24平均肺损伤评分分别为27.4％及54.8％。PRRS94881MLV接种猪的平均肺损伤评分显著低于攻毒对照(p＝0.0002)，且因此符合主要功效变量且OOI确定为单次疫苗接种后2周。D14、D17及D21时，PRRS94881MLV接种猪PRRS-抗体效价阳性的比例显著高于攻毒对照(p≤0.0012)。攻毒后PRRS94881MLV接种猪D17-D24时的病毒血症平均AUC显著低于攻毒对照(分别为50.72及54.61log10GE/mL；p＝0.0039)。与攻毒对照猪的45％的昏睡征象相比，PRRS94881MLV接种猪显示攻毒后无昏睡征象(0％)(p＝0.0012)。在研究的攻毒后阶段期间(SD14-SD24)，PRRS94881MLV接种猪的增重高于攻毒对照(分别为0.3及0.1kg；p＝0.0003)。疫苗接种动物中攻毒后肺损伤、临床征象、血液及肺中病毒复制的显著(p≤0.05)减少以及生长效能的改良，证明了当在疫苗接种后2周进行攻毒时疫苗对毒性PRRSv的功效。因此，证明用PRRS94881MLV接种后至少2周产生免疫力。研究的目标/目的此疫苗接种-攻毒研究的目标为评定在候选疫苗猪生殖与呼吸综合征欧洲来源分离株94881的经修饰活病毒(PRRS94881MLV)给予14±3日龄易感染仔猪后两周的免疫力产生(OOI)。满足疫苗接种后2周的OOI的主要功效准则为：与未接种疫苗的攻毒对照组(第2组)相比，疫苗接种组(第1组)是否证明攻毒后减少的肺损伤有显著差异(p≤0.05)。在疫苗组与攻毒对照组之间分析的次要功效参数包括疫苗接种后临床评定、PRRS血清学、攻毒后PRRS病毒血症、攻毒后临床观察、平均日增重(ADWG)、直肠温度及肺PRRSv定量。研究中包括未接种疫苗或攻毒的阴性对照组(第3组)以证明在整个试验期期间源畜群无PRRSv感染且在此试验期间未破坏生物安全性。事件时程表7.1：事件时程研究设计表7.2：研究设计盲法准则研究调查者及被指定者在研究的整个存活期期间对分配的处理组不知情。为维持此不知情，由未参与猪评定(亦即临床评定、临床观察或尸检)的人员在D0执行随机化且按分配来给予IVP及CP处理。BIVI实验室工作人员在进行其各别任务时对每只猪接受的处理不知情。材料研究性兽医产品(IVP)及对照产品(CP)表7.3：IVP表7.4：CP攻毒材料表7.5：攻毒材料处理给药合理性判断IVP以1.0mL剂量给予所分配的猪以评估疫苗接种后2周PRRS94881MLV的OOI。CP作为安慰剂疫苗以1.0mL剂量给予第2组及第3组。给药方案D0时，通过非研究数据收集者，使用无菌3.0mLLuer-lock注射器及无菌20g×1英寸(2.54cm)或18g×3/4英寸(1.91cm)针将IVP或CP经肌内给予所分配的猪的右颈区。给药方案展示于下表7.6中。表7.6：给药方案组数目处理剂量/途径研究天数120IVP1.0mLIMD0220CP1.0mLIMD0310CP1.0mLIMD0动物信息研究动物的详情表7.7：动物信息入选/排除准则所有参加此研究的仔猪均为PRRSELISA阴性，且在疫苗接种时如观察结果所确定为健康的。入选后的移除准则不自研究移除猪。动物管理及圈养动物圈养在整个研究期间仔猪圈养在VeterinaryResources，Inc.(VRI)(Cambridge，IA)。第1组、第2组及第3组圈养在相同但独立的房间以确保生物安全性。仔猪圈养在每个房间内的多个围栏(5只仔猪/围栏)中。第1组圈养在房间5中的4个围栏中，第2组圈养在房间6中的4个围栏中，且第3组圈养在房间4中的2个围栏中。围栏由升高台上的塑胶桶及塑胶条缝地板组成。每个围栏含有塑胶6孔喂料器及喷管饮水器。每个隔离室均与其他隔离室一样构筑，且均符合生物危害水准2(BL2)，经hepafilter过滤，在恒温器调节的温度控制下机械通风。此研究中需要隔离处理组，因为科学界熟知PRRSv容易经由各种机制(包括气溶胶化)在猪之间传播。其包括无毒性活PRRS疫苗，因为这些生物产品包括减毒病毒粒子，该粒子模拟毒性野生型PRRS的特征而无引起疾病能力。适当方法宜确保维持生物安全性且疫苗接种动物未意外地与未接种疫苗的PRRSv未处理阴性对照动物交叉污染。通过测试实验室工作人员采取适当措施，以在每个房间用于研究之前充分清洁及消毒。实验室中的每个房间均具有风扇及加热器以促进充分的空气循环及加热。每个房间的通风系统独立而相同，因此房间之间空气不共享。固体饲料储存于袋中，无害虫。水随意获取。根据该地区的可接受畜牧业惯例，仔猪随意进食适于其体型、年龄及情况的加入药物硫姆林(tiamulin)(35克/吨)及氯四环素(chlortetracycline)(400克/吨)的商业食物(LeanMetricsInfant，PurinaMills，St.Louis，MO)。如研究调查者所确定，在开始研究之前，小母猪处于良好健康及营养状态中。在研究期间，观察到所选动物身体状况有轻度下降，毛发外观粗糙，关节肿胀及有不同程度的跛行。研究调查者认为所有这些情况均为密闭圈养的猪组中通常存在的非特异性情况。亦在攻毒后所选猪中注意到咳嗽、打喷嚏、呼吸迅速、呼吸困难及轻度至中度昏睡，且认为其为与肺炎相关的典型临床征象，不过病因学上不具特异性。研究调查者确定在此研究期间任何动物均不需要伴随处理(concomitanttreatment)。所有分配给此研究的猪均在D24时实施安乐死及尸检后通过商业焚化处置。无来自参加此研究的动物的食品进入人类食物链。功效评定为评定疫苗接种后2周PRRS94881MLV的OOI，第1组及第2组在D14受到攻毒且评估攻毒后肺损伤。若第1组(最小免疫剂量的PRRS94881MLV)证明与攻毒对照组(第2组)相比，攻毒后肺损伤显著降低(p≤0.05)，则实现疫苗接种后2周的OOI。在疫苗组与攻毒对照组之间分析的次要功效参数包括疫苗接种后临床评定、攻毒后临床观察、直肠温度、体重及平均日增重(ADWG)、血清样品中PRRS抗体及病毒血症的评定及尸检时收集的肺样品中PRRS病毒的定量。研究中包括未受攻毒的阴性对照组(第3组)以证明在整个研究期间源畜群无PRRS感染且维持生物安全性。测试有效的准则购买前及D0血清样品均要求为PRRS抗体阴性。直至攻毒之日，自第2组及第3组收集的血清样品必须无PRRS抗体，且直至研究结束，自第3组收集的血清样品必须无PRRS抗体，以使研究有效。主要结果参数统计学评估的主要功效变量为研究D24时的总肺损伤评分。总肺损伤评分：在收集及记录数据及样品后第24天，所有研究的猪根据VRISOPPRC1027(附录1，附件8)实施安乐死。每只猪均根据VRISOPPRC1028尸检。由被指定人员暴露胸腔且移出心肺。研究调查者检查每组肺，描述注意到的任何宏观病理学，且确定各肺叶的病理百分比。观察结果及数据记录在尸检报告记录表格上。通过使用EP规则，测定每只猪的总肺损伤评分。支持性参数在第1组与第2组之间分析的其他参数包括疫苗接种后临床评定、PRRS血清学、疫苗接种后病毒血症、攻毒后临床观察、ADWG、直肠温度及攻毒后肺病毒定量。这些参数作为支持性参数分析且不用作满足研究目标的主要参数。临床评定通过研究调查者或被指定者在表7.1中概述之日观察所有猪的疫苗接种后临床评定。观察结果记录在临床评定记录表格上。PRRS血清学在表3中概述之日收集静脉全血。简言之，自每只仔猪收集约2-5mL血液至适当尺寸的血清分离管(SST)中。样品收集记录在样品收集记录表格上。让SST中的血液在室温下凝结。血液样品于收集当天传递至BIVI-Ames且完成样品传递记录表格。血液样品通过BIVI-Ames短暂离心，且收获血清，分离且转移至适当管中。每个管标记上小母猪的ID号、研究编号、收集日期、研究天数及样品类型。在BIVI-Ames，一组血清样品保存在2-8℃且其他组的血清样品保存在-70±10℃。通过BIVI-Ames测试在第0、7、14、17、21及24天收集且保存在2-8℃的血清样品的PRRS抗体。结果报导为阴性(ELISAS/P比率<0.4)或阳性(ELISAS/P比率≥0.4)。PRRS病毒血症其他组的血清样品在第0、7、14、17、21及24天收集且在BIVI-Ames保存在-70±10℃，直至研究的存活期结束。装运包括完成的样品传递记录表格。bioScreen通过qPCR测试血清样品的PRRSvRNA。结果报导为基因组当量/毫升(logGE/mL)。攻毒后临床观察在表7.1中概述之日观察仔猪的疾病临床征象。通过研究调查者或被指定者进行观察且记录在临床观察记录表格上。基于下表7.8中概述的临床观察评分系统，每天观察仔猪的呼吸、行为及咳嗽。表7.8：临床观察评分系统平均日增重(ADWG)在表3中概述之日收集个别体重。研究调查者或被指定者在校准天平上称重每只猪。结果以kg报导于体重记录表格上。测定D0至D14及D14至D24的平均日增重。直肠温度直肠温度通过研究调查者或被指定者在表6.1中概述之日收集。直肠温度以℃记录在临床观察记录表格上。肺组织中的PRRS病毒定量对于各组肺，保留来自左及右顶叶、左及右心叶、左及右隔叶及中叶的两个样品。每个肺样品为约1英寸(2.54cm)×1英寸(2.54cm)。对于一组肺样品，所有来自左侧的三个样品组合在一个容器中；而所有三个来自右侧的样品及中间肺叶样品组合在另一容器中。每一容器填充足够量的10％甲醛溶液。对于其他组的肺样品，所有来自左侧的三个肺样品组合在一个中；而所有三个来自右侧的样品及中间肺叶样品组合在另一中。所有容器及均适当标记有动物编号、研究编号、收集日期、研究天数、样品类型及样品来自左侧抑或右侧。中的肺样品储存于干冰上，直至运送至BIVI-Ames，而甲醛中的样品储存在室温下。样品收集记录在尸检报告记录表格上。甲醛固定的肺组织样品及肺样品转移至BIVI-Ames。每次装运均包括完成的样品传递记录表格。装运包括完成的样品传递记录表格。bioScreen通过qPCR测试肺样品的PRRSvRNA(附录1，附件7)。左肺组织进行均质化且测试。右肺组织及中间肺叶样品进行均质化且测试。对于左及右肺样品，结果报导为基因组当量/毫升(logGE/mL)。不良事件此研究期间未报导有不良事件。统计学方法实验单元此研究中处理组必须圈养在各别房间以避免PRRSv传播至未接种疫苗组。因此，房间为实验单元。然而，出于此分析的目的，忽略由混杂“房间”及“处理”影响所产生的可能偏离，且仔猪用作实验单元。随机化五十(50)只仔猪按体重分区(n＝5只仔猪/区块)。使用Excel中的随机数函数对每只猪分配一个随机数。在每个体重区块内，猪以分配的随机数升序排列。接着以此数字次序分配处理组给猪：两个最低随机数分配给第1组，随后2个数字分配给第2组且最高数字分配给第3组。第1组及第2组各含有20只猪且第3组含有10只猪。分析统计分析及数据概述由Dr.rer.hort.MartinVanselow，Biometrie&Statistik，ZumSiemenshop21，30539Hannover，Germany，+49(0)511606777650，m.vanselow@t-online.de进行。采取完全随机设计结构分析数据。统计分析使用SAS软件版本8.2(SAS，Cary，USA/NorthCarolina，SASInstituteInc.)进行。所有关于差异的测试均设计为α＝5％的双侧检验。总肺损伤评分：根据猪地方流行性肺炎疫苗(钝化)所起草的专论中推荐的加权公式计算的肺受累百分比，测量尸检之日(D24)的总肺损伤评分。此公式考虑七个肺叶各自的相对重量。所评定的具有典型损伤的肺叶区域百分比乘以每个肺叶的各别因子，得到总的加权肺损伤评分。各别肺叶的因子呈现于表7.9中。表7.9：计算肺损伤评分的因子肺叶因子左顶叶0.05左心叶0.06左隔叶0.29右顶叶0.11心叶0.10右隔叶0.34右副叶/中叶0.05使用魏氏-曼-惠特尼检验比较处理组的差异。疫苗接种后临床评估产生在D1与D12之间具有至少一个阳性发现结果的动物的频率表。处理组之间的差异通过费希尔精确检验测试。PRRS血清学产生阳性ELISA结果的频率表。处理组之间的差异通过费希尔精确检验测试。PRRS病毒血症分别评估研究每一天的病毒血症数据。另外，分析D14与D24之间(AUCD14-D24)及D17与D24之间(AUCD17-D24)病毒负荷个别反应的曲线下面积。通过魏氏-曼-惠特尼检验，在处理组之间比较定量PCR数据(PRRS病毒负荷[log10GE/mL])。在计算之前，分析结果‘未检测’替换为0.0的log10GE/mL值，且‘阳性’替换为3.0。使用魏氏-曼-惠特尼检验测试处理组的差异。攻毒后临床观察产生在D15与D24之间具有至少一个阳性发现结果的动物的频率表。处理组之间的差异通过费希尔精确检验测试。将D15至D24每只动物的呼吸、行为、咳嗽及所有三者加在一起(总)的最大评分及平均评分用于统计学评估。通过魏氏-曼-惠特尼检验测试处理组之间的差异。体重及平均日增重计算D0与D14之间及D14与D24之间的时间段的个别日增重。对于研究每一天及每个时间段，计算描述性统计学。处理组之间的差异使用变异数分析及后续t检验测试。由变异数分析计算所述组的最小平方平均值以及最小平方平均值之间的差异及其95％置信区间。直肠温度使用变异数分析及后续t检验测试处理组之间初始温度数据的差异。由变异数分析计算所述组的最小平方平均值以及最小平方平均值之间的差异及其95％置信区间。肺组织中的PRRS病毒定量通过魏氏-曼-惠特尼检验，在处理组之间比较来自D24时收集的肺的定量PCR数据(PRRS病毒负荷[log10GE/mL])。左肺及右肺qPCR结果的平均值(log10GE/mL)用于评估。在计算之前，分析结果‘未检测’替换为0.0的log10GE/mL值，且‘阳性’替换为3.0。产生阳性qPCR结果的频率表。处理组之间的差异通过费希尔精确检验测试。结果总肺损伤评分组中总肺损伤评分及相关p值的概述示于下表7.10中。表7.10：总肺损伤评分(％)1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。NI＝未包括在统计分析内。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照的平均仔猪D24总肺损伤评分分别为27.368％及54.841％。PRRS接种猪的损伤评分显著低于攻毒对照的平均损伤评分(p＝0.0002)。PRRS病毒血症在血清中检测到的PRRSvRNA的qPCR数据的概述示于下表7.11中。表7.11：按照天数在血清中检测到的PRRSvRNA的qPCR(log10GE/mL)1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。NI＝未包括在统计分析内。AUC＝曲线下面积；每天GE/mlD0时，在任何仔猪的血清中均未检测到PRRSvRNA。PRRS94881MLV接种猪在D7及D14时的平均值分别为3.17及3.30log10GE/mL。在此两天值显著高于攻毒对照(p<0.0001)，因为攻毒对照直至D17才检测到PRRSvRNA。该天，PRRS94881MLV接种仔猪及攻毒对照的平均值分别为6.78及8.00log10GE/mL。攻毒对照的D17值显著高于PRRS94881MLV接种仔猪(p<0.0001)。D21及D24时，与攻毒对照在D21及D24的平均值7.88及7.34log10GE/mL相比，PRRS94881MLV接种猪在相同日的平均值分别为7.51及7.26log10GE/mL。D21或24时，PRRS94881MLV接种猪之间无显著差异(p≥0.0565)。在此研究期间在来自任何阴性对照猪的血清中未检测到PRRSvRNA。在PRRS94881MLV接种猪与攻毒对照猪之间AUC14-24无差异(分别为65.84及66.61；p＝0.4945)。D17-D24PRRS94881MLV接种猪的AUC显著低于攻毒对照(分别为50.72及54.61；p＝0.0039)。肺组织中的PRRS病毒定量来自D24尸检时收集的肺组织的个别PRRSvqPCR结果呈现于附录1表30中。通过qPCR数据在肺组织中检测到的PRRSvRNA的概述示于下文呈现的表7.12中，且尸检时具有阳性qPCR的动物的频率的概述示于下表7.13中。表7.12：肺病毒隔离，尸检(D24)时的qPCR(平均log10GE/mL)1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。NA＝因为缺乏可变性而不适用。NI＝未包括在统计分析内。表7.13：自尸检(D24)时收集的肺组织可能有PRRSvRNAaPCR的动物的频率1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。NA＝因为缺乏可变性而不适用。NI＝未包括在统计分析内。在PRRS94881MLV接种组的所有仔猪及攻毒对照组的所有仔猪的肺组织中均检测到PRRSvRNA。这些组之间无差异。在任何阴性对照仔猪的肺样品中均未检测到PRRSvRNA。攻毒后临床观察攻毒后时期内(D15-D24)具有至少一个阳性临床评定评分的仔猪的频率展示于下表7.14中。表7.14：攻毒后(D15-D24)具有阳性临床观察结果的仔猪的频率1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。NI＝未包括在统计分析内。在PRRS94881MLV接种组(10％)及攻毒对照组(30％)中观察到异常呼吸，然而，这些值无显著差异(p＝0.2351)。仅仅在攻毒对照组中观察到异常行为(45％)，而在PRRS94881MLV接种组中未观察到(0％)。PRRS94881MLV接种组的异常行为发生率显著低于攻毒对照组(p＝0.0012)。在PRRS94881MLV接种组(30％)与攻毒对照组(55％)中均观察到咳嗽。这些值无显著差异(p＝0.2003)。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的总临床评分>0的仔猪的百分比分别为30％及65％。这些值无显著差异(p＝0.0562)。在攻毒后任何时候均未在阴性对照组中观察到临床征象。组中攻毒后时期(D15至D24)的最大临床观察评分的概述示于下表7.15中。表7.15：攻毒后(D15至D24)最大临床评分1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。NI＝未包括在统计分析内。给予攻毒后，在PRRS94881MLV接种组与攻毒对照组中均观察到异常呼吸，最大评分分别为1(喘息/呼吸迅速)及2(呼吸困难)。这些呼吸评分之间无显著差异(p＝0.1872)。两组的中值最大呼吸评分为0。在攻毒后时间内在PRRS94881MLV接种组中未观察到异常行为(最大评分＝0)。相比之下，攻毒对照组的最大行为评分为1(轻度至中度昏睡；p＝0.0012)，不过此组的中值评分为0。PRRS94881MLV接种组的最大评分显著低于攻毒对照组的评分(p＝0.0012)。两组的中值最大行为评分均为0。攻毒后在PRRS94881MLV接种组与攻毒对照组中均观察到咳嗽。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的最大评分分别为1(轻柔或间歇咳嗽)及2(剧烈或严重反复咳嗽)，且中值评分分别为0及1。这些组之间无显著差异(p＝0.1129)。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的中值最大咳嗽评分分别为0及1。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的最大总评分分别为1及4，且中值总评分分别为0及1。PRRS94881MLV接种组的最大评分显著低于攻毒对照组的评分(p＝0.0072)。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的中值总评分分别为0及1。在此研究期间在未受攻毒的阴性对照组中D15至D24未观察到临床征象。此组各参数的最大评分为0。组中攻毒后时期(D15至D24)的平均临床观察评分的概述示于下表7.16中。表7.16：D15至D24攻毒后平均临床评分1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。NI＝未包括在统计分析内。平均临床观察评分遵循类似于最大临床评分的模式，其中仅在PRRS94881MLV接种组与攻毒对照组之间观察到平均行为评分(p＝0.0012)及平均总评分(p＝0.0103)有显著差异。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的平均呼吸评分分别为0.02及0.07。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的平均行为评分分别为0.00及0.12。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的平均咳嗽评分分别为0.07及0.17。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的平均总评分分别为0.08及0.35。在此研究期间在未受攻毒的阴性对照组中在D15至D24未观察到临床征象。此组各参数的平均评分为0。体重及平均日增重D0、D14及D24时的体重以及D0至D14及D14至D24的ADWG的概述示于下表7.17中。表7.17：体重及平均日增重(kg及kg/d)1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组D0时的平均体重分别为4.1及4.2kg。D14时，PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的平均体重分别为7.6及7.4kg。D24时，PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的平均体重分别为10.3及8.9kg。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的疫苗接种期(D0至D14)的平均日增重分别为0.25及0.23kg/d。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的攻毒期(D14至D24)的ADWG分别为0.26及0.15kg/d。阴性对照组D0-D14及D14-D24的ADWG分别为0.23及0.34kg/d。阴性对照仔猪在D0、D14及D28时的平均体重分别为4.1、7.2及10.6kg。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的体重及ADWG的LS平均值及统计分析的概述示于下表7.18中。表7.18：LS平均体重及日增重(kg)1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒。PRRS94881MLV接种仔猪及攻毒对照组的第0天LS平均体重分别为4.14及4.17kg。差值为-0.03kg，无显著差异(p＝0.8743)。D14时，PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的LS平均体重分别为7.64及7.39kg。差值为0.25kg，亦无显著差异(p＝0.4297)。D24时，PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的LS平均体重分别为10.26及8.87。该天的差值为1.39kg，且疫苗接种组体重显著高于攻毒对照组(p＝0.0063)。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的疫苗接种期(D0至D14)的LS平均ADWG分别为0.25及0.23kg/d。这些值无显著差异(p＝0.1889)。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的攻毒后时期内(D14至D24)的LS平均ADWG分别为0.26及0.15。PRRS94881MLV接种组的ADWG显著高于攻毒对照组的ADWG(p＝0.0003)。直肠温度直肠温度的概述示于下表7.19及7.20中。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的直肠温度的LS平均值及统计分析的概述示于下表7.21及7.22中。表7.19：第13-22天的直肠温度(℃)1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。表7.20：第23-24天直肠温度(℃)1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。表7.21：第13-20天LS平均直肠温度(℃)1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。表7.22：第21-24天LS平均直肠温度(℃)1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。在攻毒前一天，PRRS94881MLV接种仔猪的平均及LS平均直肠温度为39.77℃，且在攻毒后在39.69℃(D15)至40.68℃(D16)的范围内。在攻毒前一天，攻毒对照的平均及LS平均直肠温度为39.39℃，且在攻毒后在39.77℃(D16)至40.61℃(D20)的范围内。在给予攻毒之前(D13及D14)及在攻毒后D16时，攻毒对照的最小平方平均直肠温度显著低于PPRS94881MLV接种仔猪(p<0.0001)。此研究中PRRS94881MLV接种猪与攻毒对照之间直肠温度无其他显著差异(p≥0.0528)。阴性对照组的平均及LS平均直肠温度在整个研究期间保持≤39.68℃。疫苗接种后临床评定D1至D12具有至少一个阳性评定的仔猪的百分比的概述示于下表7.23中。表7.23：D1-D12具有至少一个阳性临床评定的仔猪的百分比1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。NI＝未包括在统计分析内。在疫苗接种期D-1至D12期间PRRS94881MLV接种组或阴性对照组中无仔猪具有任何临床评定发现结果。观察到攻毒对照组中仔猪110在右前腿后面具有溃疡，始于D9。在PRRS94881MLV接种仔猪与攻毒对照之间此参数无显著差异(p＝1.0000)。PRRS血清学PRRS抗体效价阳性的仔猪的频率的概述示于下表7.24中。表7.24：按照天数PRRS抗体效价阳性的仔猪的频率1第1组＝MID的PRRS94881MLV疫苗，受攻毒；第2组＝经安慰剂处理，受攻毒；第3组＝经安慰剂处理，未受攻毒。NA＝不适用，未进行分析。NI＝未包括在统计分析内。所有处理组中的所有仔猪在D0及D7时均为PRRS抗体阴性。至D14时，85％PRRS94881MLV接种猪具有阳性PRRS抗体效价。D17时，此数值增至95％，且D21及D24时均为100％。攻毒对照组中无猪发展阳性PRRS抗体效价，直至D21(给予攻毒后7天)，此时55％猪具有阳性效价。至D24时，此值增至95％。D14、D17及D21时，PRRS94881MLV接种猪的PRRS抗体效价阳性的猪的比例显著高于攻毒对照组(p≤0.0012)。在此研究期间阴性对照组中无猪发展PRRS抗体效价。讨论/结论为达成研究目标，D0时，研究设计中包括三个组：接受1×103.82TCID50PRRS94881MLV的疫苗组(第1组)；接受对照产品的攻毒对照组(第2组)及亦接受对照产品的阴性对照组(第3组)。二十(20)只健康、PRRS易感染且血清阴性仔猪在约14日龄用1mlPRRS94881MLV经肌内接种。30只(20只仔猪-攻毒对照组及10只仔猪-阴性对照组)PRRS易感染且血清阴性仔猪在约14日龄用1ml对照产品经肌内接种。为确定是否在PRRS94881MLV的2周达成免疫力的产生，疫苗组及攻毒对照组在疫苗接种后14天用异源性欧洲型PRRSv分离株(分离株205817)攻毒且评估攻毒后肺损伤的相对降低。研究的验证(阴性对照组3)为确保源仔猪无PRRSv且研究期间在处理组及对照组中未发生外来PRRSv暴露或交叉污染，研究设计中包括阴性对照组(第3组)。在整个研究期间，阴性对照组中的仔猪为PRRSv阴性(病毒血症；qPCR)以及PRRS抗体阴性，因此验证此试验。攻毒模型的验证(攻毒对照组2)需要诱发足够PRRS临床疾病的攻毒模型来充分评估实验室环境下的PRRS疫苗免疫力的产生。通过早先描述的方法用欧洲型PRRS分离株205817接种后，攻毒对照组显示D19、D20、D23及D24时的平均直肠温度≥40.50℃(同日阴性对照组≤39.68℃)；与阴性对照组的D14至D24平均ADWG为0.34kg/天相比，平均ADWG为0.15kg/天，异常行为、咳嗽及中值肺损伤评分为55.2％(阴性对照组为0.00％)。这些结果突出表明，即使攻毒病毒效价略低于目标剂量，在攻毒对照组中亦能诱发严重的PRRS特异性临床疾病，因此验证此攻毒模型为足以评估PRRS疫苗功效及更特别是PRRS94881MLV的OOI的临床实验工具。确定PRRS94881MLV(第1组)的两周免疫力产生疫苗接种后2周的PRRS94881MLV的免疫力产生(OOI)的确定是基于疫苗组显示与攻毒对照组相比，攻毒后肺损伤显著(p≤0.05)降低。肺损伤被选为确定2周OOI的主要参数，因为在猪中的PRRS呼吸攻毒模型内评估新疫苗时，此参数提供功效的最临床相关且令人信服的证据。肺损伤发展为猪中PRRS呼吸疾病的标志之一。肺损伤通常伴有后续显现继发性PRRSv疾病特征，诸如临床征象、发热、ADWG的降低等。PRRS94881MLV接种组显示攻毒后总体肺损伤显著减少，如与显示中值总肺损伤评分为55.2％的攻毒对照组相比，中值总肺损伤评分为27.6％(p＝0.0002)所证明。因此，基于攻毒后肺损伤显著减少的主要参数，确定在1×103.82TCID50的剂量下PRRS94881MLV的2周OOI。此结果由略低于每一剂1×104.5TCID50的最小免疫剂量的疫苗剂量达成。攻毒后病毒血症被选为最重要的次要参数，因为其代表了在暴露后宿主动物内发生病毒复制的程度及持久性。病毒血症显著(p≤0.05)降低符合诱发足够免疫力以在宿主内限制PRRS发病机制的PRRS疫苗。在攻毒后3天(D17)，PRRS94881MLV接种组与攻毒对照组相比中值病毒血症(qPCR)显著减少(6.72GE/mL对8.18GE/mL；p≤0.0001)。为在组之间进一步评估攻毒后病毒血症，计算攻毒后特定持续时间内病毒负荷的量，表示为“曲线下面积”或AUC。PRRS94881MLV接种组D17至D24的中值AUC值为每天49.52GE/mL；而攻毒对照组的中值AUC值为每天54.35GE/mL。与攻毒对照组相比，疫苗组的D17至D24中值AUC值显著较低(p＝0.0039)。无论在攻毒后3天抑或在攻毒后过程中检查病毒血症，在用毒性异源性欧洲型PRRS株攻毒之前2周给予的PRRS94881MLV均在攻毒接种后显著(p≤0.05)降低病毒血症。结合攻毒后PRRS病毒血症减少，根据PRRS疫苗免疫力观点，肺组织中病毒负荷显著(p≤0.05)降低亦具有重大意义。肺组织中病毒负荷降低可能与宿主内病毒稳定性、复制及持久性降低相关且继而可使PRRSv至其他猪的流动减少。此研究中，来自PRRS94881MLV接种组的肺组织在攻毒后10天(D24)的中值肺qPCR结果为7.46log10GE/mL，而攻毒对照组的中值肺qPCR结果为7.88log10GE/mL。疫苗组与攻毒对照组之间的差异显著(p＝0.0101)，因此进一步支持2周的OOI。仔猪中攻毒后临床征象的严重程度及频率明显降低亦支持PRRS疫苗功效及PRRS94881MLV的2周OOI的确定。在攻毒后任一组中均未注意到足够严重程度及频率的异常呼吸且未检测到差异(p≥0.1394)。相反，咳嗽的严重程度及频率在组之间大致相等，且未检测到差异(p≥0.0835)。在组之间检测到攻毒后异常行为(昏睡)的严重程度及频率有差异。PRRS94881MLV接种及攻毒对照组中分别有20只中0只(0％)及20只中9只(45％)的仔猪在攻毒后至少一天显示异常行为(p＝0.0012)。同样，与攻毒对照组相比，PRRS94881MLV接种组显示攻毒后最大异常临床评分及平均异常临床较低(p＝0.0012)。当分析D15至D24的最大评分及平均评分时，组之间总临床评分(呼吸、行为及咳嗽评分的总和)有显著差异。由于异常行为评分对总评分有影响，所以与攻毒对照组相比，PRRS94881MLV接种组的最大总评分显著较低且平均总评分较低(p≤0.0103)。组之间异常行为的严重程度及频率的差异，进一步支持了疫苗接种后2周的OOI。攻毒前，PRRS94881MLV接种组与攻毒对照组相比，D13时(分别为39.77℃对39.39℃；p<0.0001)及D14时(分别为39.76℃对39.37℃；p<0.0001)平均直肠温度略高。虽然攻毒前在组之间检测到显著(p≤0.05)差异，但这些差异在生物学上不相关。攻毒后，在组之间检测到平均直肠温度有显著(p≤0.05)差异的唯一一天为D16(攻毒后2天)。D16时，疫苗接种及攻毒对照组的平均直肠温度分别为40.68℃及39.77℃，且组之间的差异显著(p<0.0001)。攻毒后4-5天平均直肠温度升高至40℃以上且保持在40℃以上，直至两组的研究结束。攻毒对照组中由PRRS引起的显著异常行为、病毒血症、肺损伤及肺组织中病毒负荷的存在导致组之间攻毒后ADWG的差异显著(p≤0.05)。在此研究中，疫苗接种及攻毒对照组的D14至D24平均ADWG分别为0.3kg/天及0.1kg/天，且组之间的差异显著(p＝0.0003)。组之间攻毒后ADWG的显著(p≤0.05)差异进一步支持疫苗接种后2周的OOI的确立。此研究中检查的疫苗接种后参数在D0时接种后，在仔猪中未观察到与PRRS94881MLV接种或对照产品相关的异常临床评定。一只攻毒对照仔猪显示右前腿后面有溃疡，始于D9，其似乎与给予对照产品无关联。所有仔猪在D0时均为PRRSELISA血清学阴性，因此证实所有仔猪在进入研究时符合PRRS阴性的入选准则。接受PRRS94881MLV的大部分仔猪在D14时发生PRRS血清转化，且所有PRRS接种仔猪在攻毒后7天(D21)前为血清阳性。相反，攻毒对照保持血清阴性直至攻毒后7天，此时此组开始显示PRRS血清转化。阴性对照组在整个研究期间保持PRRS血清阴性。在疫苗接种后7及14天，PRRS94881MLV接种组显示平均qPCR结果分别为3.17及3.30log10GE/mL。这些结果突出表明，在疫苗接种后2周内，1×103.82TCID50剂量的PRRS94881MLV诱发MLV充分复制，该复制通常是在疫苗接种后2周建立保护性免疫力所需要的。相反，D0至D14时攻毒对照组及阴性对照组为PRRSv病毒血症阴性。结论攻毒后肺损伤、临床征象、血液及肺中病毒复制的显著(p≤0.05)减少以及生长效能的改良，支持了在约14日龄仔猪中用单一剂量PRRS94881MLV以1×103.82TCID50/mL接种后2周OOI的确立。实施例8：两周龄易感染猪中在疫苗接种后26周用异源性欧洲型PRRS分离株攻毒后，评估PRRS94881MLV的免疫力持续时间此疫苗接种-攻毒研究的目标为评估在候选疫苗猪生殖与呼吸综合征欧洲来源分离株94881的经修饰活病毒(PRRS94881MLV)给予14±3日龄PRRS血清阴性猪后26周的免疫力持续时间(DOI)。满足疫苗接种后26周的DOI的主要功效准则为与攻毒对照组(第2组)相比，PRRS94881MLV接种组(第1组)中攻毒后肺损伤评分(总体或组织学)显著减少(p≤0.05)。在第0天(D0)，22只分配至疫苗接种组的猪经肌内接受1.0mLIMPRRS94881MLV(1×104.27TCID50)(第1组)，22只分配至攻毒对照组的猪接受1.0mLIM对照产品(无PRRS94881MLV的安慰剂匹配产品，第2组)，且12只分配至阴性对照组的猪亦接受1.0mLIM对照产品(第3组)。第1组及第2组在D179(攻毒后第0天{DPC0})用欧洲型PRRSV毒性株攻毒且攻毒后10天监测猪的临床征象、平均日增重及病毒血症。猪在D189(DPC10)进行尸检且测定总体及组织学肺损伤及肺病毒负荷。PRRS94881MLV接种猪及攻毒对照在D189(DPC10)时的中值总体肺损伤评分分别为0.1％及13.8％(p<0.0001)。PRRS94881MLV接种猪及攻毒对照在DPC10时的中值组织学肺损伤评分分别为6.0及19.5(p<0.0001)。与攻毒对照相比，PRRS94881MLV接种猪在攻毒后3、7及10天具有显著较低的血清病毒负荷(p≤0.0001)。PRRS94881MLV接种猪(分别为每天15.54及8.88log10GE/mL)在DPC0至DPC10及DPC3至DPC10的病毒血症攻毒后曲线下面积(AUC)分析亦显著低于攻毒对照组(分别为每天44.77及36.43log10GE/mL，p<0.0001)。PRRS94881MLV接种猪及攻毒对照的尸检时收集的肺组织的中值qPCR值分别为3.69及6.25log10GE/mL(p<0.0001)。攻毒后临床征象无显著差异(p≥0.4878)。与攻毒对照相比，PRRS94881MLV接种猪的总体及组织学肺损伤、尸检时收集的肺组织中的病毒负荷及攻毒后病毒血症的显著减少(p≤0.05)，支持了在疫苗接种后26周攻毒时疫苗对毒性PRRSv的功效。此研究的结果确定在2周龄用PRRS94881MLV接种的猪中接种后26周的免疫力持续时间。这些结果用1×104.27TCID50/mL的疫苗剂量达成，此疫苗剂量略低于此研究性兽医产品的最小免疫剂量(1×104.5TCID50/mL)。研究的目标/目的此疫苗接种-攻毒研究的目标为评估猪生殖与呼吸综合征欧洲来源分离株94881的经修饰活病毒代码19S1.U(PRRS94881MLV)给予14±3日龄的PRRS血清阴性猪以对抗异源性欧洲型PRRS分离株在疫苗接种后26周的毒性攻毒的免疫力持续时间(DOI)。满足疫苗接种后26周的DOI的主要功效准则为与攻毒对照组(第2组)相比，PRRS94881MLV接种组(第1组)中攻毒后肺损伤评分(总体或组织学)显著减少(p≤0.05)。次要功效参数包括疫苗接种后及攻毒后病毒血症、疫苗接种后临床评定、PRRS血清学、攻毒后临床观察、平均日增重(ADWG)、直肠温度及肺PRRSv定量。攻毒后病毒血症视为最重要的次要参数，因为其为客观且可定量的参数。接着认为直肠温度及临床观察在DOI界定过程中为支持性参数。最后，生长效能、血清学及肺中病毒检测用作在满足研究目标方面支持主要参数的支持性参数。事件时程表8.1：事件时程研究设计此为在56只在第0天(D0)14±3日龄的断乳PRRS血清阴性猪中进行的盲法疫苗接种-攻毒功效研究。研究的概述提供于表8.2中。表8.2：研究设计盲法准则研究调查者及被指定者在研究的整个存活期期间对分配的处理组不知情。为维持此不知情，BIVI监测者进行随机化，且由未参与猪评定(亦即临床评定、临床观察或尸检)的个体在D0时给予分配的IVP及CP处理。BIVI实验室工作人员在进行其各别任务时对每只猪接受的处理不知情。材料研究性兽医产品(IVP)及对照产品(CP)表8.3：IVP表8.4：CP攻毒材料表8.5：攻毒材料处理给药合理性判断IVP以1.0mL剂量给予所分配的猪以评估疫苗接种后26周的PRRS94881MLV的DOI。CP作为安慰剂疫苗以1.0mL剂量给予第2组及第3组。给药方案D0时，通过非研究数据收集者，使用无菌3.0mLLuer-lock注射器及无菌20g×1英寸(2.54cm)针将IVP或CP经肌内给予分配猪的右颈区。给药方案展示于下表8.6中。表8.6：给药方案组数目处理剂量/途径研究天数122IVP1.0mLIMD0222CP1.0mLIMD0312CP1.0mLIMD0伴随处理由于发现若干只猪在研究初期在细菌性感染后死亡，所以调查者及研究监测者一致同意向所有研究动物给予以下额外的伴随处理(部分15.10)：第20天：(维生素E/硒，Intervet/ScheringPloughAnimalHealth(USA))，0.1mL经肌内给予右大腿中第21天：(头孢噻呋(Ceftiofur)，PfizerAnimalHealth，USA)，0.5mL给予左大腿中第35天：(头孢噻呋，PfizerAnimalHealth，USA)，1.0mL给予右大腿中第42天：(头孢噻呋，PfizerAnimalHealth，USA)，1.0mL给予左大腿中第47天：(恩氟沙星(Enrofloxacin)，BayerAnimalHealth，USA)，1.5mL皮下给予左颈中给予维生素E/硒以预防桑椹心脏病，且给予抗生素处理以治疗/预防细菌性感染。动物信息动物研究的详情表8.7：动物信息入选/排除准则所有参加此研究的猪均为PRRSELISA阴性(ELISAS/P比率<0.4)且在疫苗接种时(D0)如通过观察结果确定为健康的。入选后的移除准则无猪自研究移除。在给予攻毒前发现三只猪死亡。关于此三只猪的进一步结果呈现于12.8部分中。动物管理及圈养在整个研究期间猪圈养在VeterinaryResources，Inc.(VRI)(Cambridge，IA)。猪圈养在每个房间内的多个围栏(11或12只猪/围栏)中，其中疫苗接种(第1组)及对照动物(第2组及第3组)圈养在相同但独立的房间中以确保生物安全性。PRRS94881MLV猪圈养在房间CB8中，直至D78，接着圈养在CC1中，直至D105，接着研究其余时间圈养在CC3中。在整个研究中，攻毒对照猪均圈养在房间CC2中。阴性对照猪圈养在房间CB6中，直至D73，接着研究其余时间圈养在CB7中。动物围栏用塑胶条缝地板升高，具有使用期适当的喂料器及喷管杯式饮水器。每个隔离室均与其他隔离室一样构筑，且均符合生物危害水准2(BL2)，经hepafilter过滤，在恒温器调节的温度控制下机械通风。此研究中需要隔离处理组，因为科学界熟知PRRSv容易经由各种机制(包括气溶胶化)在猪之间传播。其包括无毒性活PRRS疫苗，因为这些生物产品包括模拟毒性野生型PRRS的特征而无引起疾病能力的减毒病毒粒子。适当方法宜确保维持生物安全性且疫苗接种动物未意外地与未接种疫苗的PRRSv未处理阴性对照动物交叉污染。通过测试实验室工作人员采取适当措施，以在每个房间用于研究之前充分清洁及消毒。实验室中的每个房间均具有风扇及加热器以促进充分的空气循环及加热。每个房间的通风系统独立而相同，因此房间之间空气不共享。饲料储存于袋中，无害虫。饲料及水随意获得。自到达起，猪进食LeanMetrics婴儿期加药饲料(PurinaMillsLLC，St.Louis，MO)，至D5时，其换成LeanMetrics年长期加药饲料(PurinaMillsLLC，St.Louis，MO)。D64时，猪换成LeanMetricsComplete85饲料(PurinaMillsLLC，St.Louis，MO)，且D82时，其换成LeanMetricsCompleteCE85，T40(PurinaMillsLLC，St.Louis，MO)，研究其余时间其均进食此饲料。在整个研究期间，根据该地区可接受的畜牧业惯例，所提供的饲料适于猪的体型、年龄及情况。如研究调查者所确定，在开始研究之前，小母猪处于良好健康及营养状态中。在研究期间，观察到所选动物有其他情况，包括瘦弱、咳嗽、肿胀、毛皮粗糙、抑郁、脓肿及体况不良。研究调查者认为所有这些情况均为分群圈养生长/成熟猪的特征。认为这些情况为暂时或无关紧要的，且不加处理。有效性评定为评定疫苗接种后26周的PRRS94881MLV的DOI，PRRS94881MLV及攻毒对照组在D179(DPC0)受攻毒，且10天后(DPC10)评估攻毒后肺损伤。若PRRS94881MLV组与攻毒对照组相比，攻毒后肺损伤(总体或组织学)显著降低(p≤0.05)，则达成疫苗接种后26周的DOI。在疫苗组与攻毒对照组之间分析的次要功效参数包括疫苗接种后及攻毒后病毒血症、攻毒后临床观察、攻毒后直肠温度、疫苗接种后临床评定、平均日增重(ADWG)及PRRS血清学。攻毒后病毒血症视为最重要的次要参数，因为其为客观且可定量的参数。接着认为直肠温度及临床观察在DOI界定过程中为支持性参数。最后，生长效能、血清学及肺中病毒检测用作在满足研究目标方面支持主要参数的支持性参数。有效测试的准则要求所有猪在购买前筛检时及D0时均为PRRSELISA阴性(ELISAS/P比率<0.4)。要求直至攻毒时攻毒对照猪为PRRS抗体阴性，且要求阴性对照组在整个研究期间均为PRRS抗体阴性。主要结果参数主要功效结果变量为研究D189(DPC10)时的肺损伤(总体及组织学损伤)。总体肺损伤评分：D189时，在收集及记录样品及数据后，遵循VRISOPPRC1027(15.1部分)对所有剩余研究猪实施安乐死。每只猪根据VRISOPPRC1028(15.1部分)进行尸检。通过被指定者暴露每只猪的胸腔且移出心肺。研究调查者检查每组肺，描述任何宏观病理学，且确定各肺叶的病理百分比。观察结果及数据记录在尸检报告记录表格上。组织学肺损伤评分对于各组肺，保留来自左及右顶叶、左及右心叶、左及右隔叶及中叶的两个样品。每个肺样品为约1英寸(2.54cm)×1英寸(2.54cm)。对于一组肺样品，所有来自左侧的三个样品组合在一个容器中；而所有三个来自右侧的样品及中间肺叶样品组合在另一容器中。每一容器填充足够量的10％甲醛溶液。对于其他组的肺样品，所有来自左侧的三个肺样品组合在一个中；而所有三个来自右侧的样品及中间肺叶样品组合在另一中。所有容器及均适当标记有动物编号、研究编号、收集日期、研究天数、样品类型及样品来自左侧抑或右侧。甲醛中的肺样品储存在室温下，而中的肺样品储存在干冰上，直至运送至BIVI-Ames。样品收集记录在尸检报告记录表格上。甲醛固定的肺组织样品及肺样品转移至BIVI-Ames。每次装运均包括完成的样品传递记录表格。甲醛固定的肺组织样品由BIVI-Ames保存在室温下，直至由BIVI-Ames呈递至爱荷华州立大学兽医学诊断实验室(IowaStateUniversityVeterinaryDiagnosticLaboratory，ISUVDL)。肺样品通过ISUVDL工作人员根据ISUVDL程序在尸检一周内处置及处理。每只猪产生含有7个切片(所有7个肺叶各一片)的单一载片。每个H&E载片均用唯一标识代码鉴别。ISUVDL提供含有研究编号、标识代码及相关猪组织的电脑记录。每日一次，在读取研究载片的组织病理学之日，ISUVDL病理学家(K.Schwartz)首先读取EUPRRS阳性及阴性对照载片。之后，病理学家读取H&E染色肺载片的肺细胞过度生长及增生、单核细胞的隔膜浸润、坏死性碎片、发炎细胞的肺泡内积累及发炎细胞的血管周积累。结果记录在Excel电子表中。肺组织病理学评分系统展示于下表8.8中。表8.8：肺组织病理学评分系统完成所有载片的读取后，载片返回至主办代理人，且在完成最终报告后存档于BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.(St.Joseph，MO)。次要参数次要变量包括疫苗接种后及攻毒后病毒血症、攻毒后临床观察、攻毒后直肠温度、平均日增重(ADWG)、肺PRRSv定量、疫苗接种后临床评定及PRRS血清学。血清PRRSqPCR静脉全血在购买前及第0、7、14、21、28、56、84、112、140、168、179(DPC0)、182(DPC3)、186(DPC7)及189(DPC10)天收集。简言之，自每只猪收集约2-5mL血液至适当尺寸的血清分离管(SST)中。样品收集记录在样品收集记录表格上。让SST中的血液在室温下凝结。血液样品于收集当天传递至BIVI-Ames且完成样品传递记录表格。血液样品通过BIVI-Ames短暂离心，且收获血清，分离且转移至适当管中。每个管标记上猪的ID号、研究编号、收集日期、研究天数及样品类型。在BIVI-Ames，一组血清样品保存在2-8℃且其他组的血清样品保存在-70±10℃。攻毒后临床观察观察D178(DPC-1)至D189(DPC10)猪的疾病临床征象。通过研究调查者或被指定者进行观察且记录在临床观察记录表格上。基于下表8.9中概述的临床观察评分系统，每天观察猪的呼吸、行为及咳嗽。表8.9：临床观察评分系统直肠温度通过研究调查者或被指定者收集D178(DPC-1)至D189(DPC10)的直肠温度。直肠温度以单位℃记录在临床观察记录表格上。体重及平均日增重D0、D179(DPC0)及D188(DPC9)时，收集个别体重。研究调查者或被指定者在校准天平上称重每只猪。结果以单位kg记录在体重记录表格上。测定D179(DPC0)至D188(DPC9)的平均日增重。肺PRRSqPCR中的肺组织样品在BIVI-Ames保存在-70±10℃，直至装运至9.3.1部分中所列的地址。装运包括完成的样品传递记录表格。bioScreen通过qPCR测试肺样品的PRRSvRNA(15.1部分)。左肺组织进行均质化且测试。右肺组织及中间肺叶样品进行均质化且测试。对于左及右肺样品，结果报导为基因组当量/毫升(log10GE/mL)。通过统计学家，使用SAS程序，计算每只猪的右及左GE/mL值的几何平均效价。疫苗接种后临床评定通过研究调查者或被指定者观察所有猪的疫苗接种后临床评定。D-1至D21每日进行观察，接着D22至D177一周观察至少三次。观察结果记录在临床评定记录表格上。PRRS血清学由BIVI-Ames对在购买前及第0、7、14、21、28、56、84、112、140、168、179(DPC0)、182(DPC3)、186(DPC7)及189(DPC10)天收集的血清样品的PRRS抗体(15.1部分)进行测试。结果报导为阴性(ELISAS/P比率<0.4)或阳性(ELISAS/P比率≥0.4)。不良事件此研究中未注意到归因于PRRS94881MLV的不良事件。统计方法实验单元此研究中处理组必须圈养在各别房间以避免PRRSv传播至未接种疫苗组。因此，房间为实验单元。然而，出于分析的目的，忽略由混杂“房间”及“处理”影响所产生的可能偏离，且猪用作统计单位。随机化五十六(56)只猪随机分配至三组之一。由BIVI执行随机化。在装运时，挑出第140号及第143号(攻毒对照组)以及第168号(PRRS94881MLV组)。自符合入选准则的5只额外猪的组，随机选择第178号替换第140号，随机选择第177号替换143，且随机选择第179号替换第168号。分析统计分析及数据概述由Dr.rer.hort.MartinVanselow，Biometrie&Statistik，ZumSiemenshop21，30539Hannover，Germany，+49(0)511606777650，m.vanselow@t-online.de进行。采取完全随机设计结构分析数据。统计分析使用SAS软件版本8.2或更高版本(SAS，2001，Cary，USA/NorthCarolina，SASInstituteInc.)进行。PRRS94881MLV猪179及攻毒对照猪124及161在攻毒之前死亡且自攻毒后分析中排除。所有有关差异的测试均设计为α＝5％的双侧检验。统计学家的报告呈现于部分15.9中。总体肺损伤评分使用展示于下表8.10中的因子乘以特定肺叶的病理百分比，计算每只猪的总体肺损伤评分。使用SAS程序进行计算。表8.10：计算总体肺损伤评分的因子肺叶因子左顶叶0.05左心叶0.06左隔叶0.29右顶叶0.11心叶0.10右隔叶0.34右副叶/中叶0.05使用魏氏-曼-惠特尼检验比较处理组的差异。组织学肺损伤评分对每个叶及动物，累加肺样品的个别组织学评分。此总和评分除以每只动物检查的叶的数目。结果作为单一值用于处理组之间的比较。使用魏氏-曼-惠特尼检验测试处理组的差异。肺PRRSqPCR通过魏氏-曼-惠特尼检验，在处理组之间比较来自D189时收集的肺的定量PCR数据(PRRS病毒负荷[log10GE/mL])。将左肺及右肺qPCR结果的平均值(log10GE/mL)用于评估。在计算之前，分析结果‘未检测’替换为0.0的log10GE/mL值，且‘阳性’替换为3.0。产生阳性qPCR结果的频率表。处理组之间的差异通过费希尔精确检验进行测试。血清PRRSqPCR分别评估研究每一天的病毒血症数据。另外，分析D179与D189之间(AUC0-10)及D182与D189之间(AUC3-10)病毒负荷的个别反应曲线下面积。定量PCR数据(PRRS病毒负荷[log10GE/mL])用于通过魏氏-曼-惠特尼检验在处理组之间进行比较。在计算之前，分析结果‘未检测’替换为0.0的log10GE/mL值，且‘阳性’替换为3.0。使用魏氏-曼-惠特尼检验测试处理组的差异。产生阳性qPCR结果的频率表。处理组之间的差异通过费希尔精确检验进行测试。攻毒后临床观察产生在D180与D189之间具有至少一个阳性发现结果的动物的频率表。总评分为呼吸评分+行为评分+咳嗽评分的总和。使用SAS程序进行计算。处理组之间的差异通过费希尔精确检验进行测试。D180至D189每只动物的呼吸、行为、咳嗽及所有三者加在一起(总)的最大评分及平均评分用于统计学评估。通过魏氏-曼-惠特尼检验测试处理组之间的差异。体重及平均日增重计算D179至D188的时期内的个别日增重。对于研究每一天及该时期，计算描述性统计学。处理组之间的差异使用变异数分析及后续t检验进行测试。由变异数分析计算所述组的最小平方平均值及最小平方平均值之间差异及其95％置信区间。直肠温度处理组之间关于初始温度数据的差异使用变异数分析及后续t检验进行测试。由变异数分析计算所述组的最小平方平均值及最小平方平均值之间差异及其95％置信区间。疫苗接种后临床评定产生在D1与D21之间具有至少一个阳性发现结果的动物的频率表。处理组之间的差异通过费希尔精确检验进行测试。PRRS血清学产生每个时间点阳性ELISA结果的频率表。处理组之间的差异通过费希尔精确检验测试。结果总体肺损伤评分PRRS94881MLV接种组及攻毒对照D189(DPC10)时的中值总体肺损伤评分分别为0.1％及13.8％。PRRS接种猪的中值总体肺损伤评分显著低于攻毒对照的中值总体肺损伤评分(p<0.0001)。阴性对照组的中值总体肺损伤评分为0.0％。第123号(攻毒对照组)由于弥漫性胸膜炎及粘连而无法对D189时的肺损伤进行评分。尸检后，自此猪的肺组织中分离出奥斯陆莫拉菌(Moraxellaosloensis)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、猪葡萄球菌(Staphyloccoushyicus)及假单胞菌物种。组中总体肺损伤评分及相关p值的概述示于下表8.11中。表8.11：组中D189时总体肺损伤评分(％)的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。2第123号由于细菌性感染所引起的弥漫性胸膜炎及粘连而无法进行评分。3一只PRRS94881MLV猪及两只攻毒对照猪在攻毒前死亡且未包括在分析内。NI＝未包括在统计分析内组织学肺损伤评分PRRS94881MLV接种组及攻毒对照的中值组织学肺损伤评分分别为6.0及19.5。PRRS接种组的中值组织学肺损伤评分显著低于攻毒对照的中值组织学肺损伤评分(p<0.0001)。阴性对照组的中值组织学肺损伤评分为9.0。组中组织学肺损伤评分及相关p值的概述示于下表8.12中。表8.12：组中组织学肺损伤评分的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。2一只PRRS94881MLV猪及两只攻毒对照猪在攻毒前死亡且未包括在分析内。NI＝未包括在统计分析内肺PRRSqPCRPRRS94881MLV接种猪及攻毒对照的来自肺组织的中值qPCR肺值分别为3.69及6.25log10GE/mL。PRRS94881MLV接种猪的中值qPCR值显著低于攻毒对照的中值qPCR值(p<0.0001)。在任何阴性对照猪的肺样品中均未检测到PRRSvRNA。下表8.13中为组中肺qPCR值及测试结果(p值)的概述。表8.13：组中肺qPCR(平均log10GE/mL)值的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。2一只PRRS94881MLV猪及两只攻毒对照猪在攻毒前死亡且未包括在分析内。NI＝未包括在统计分析内分别在90％及100％的PRRS94881MLV接种猪及攻毒对照猪的肺组织中检测到PRRSvRNA。疫苗接种组与攻毒对照之间无统计学差异(p＝0.4878)。组中尸检时来自猪的PRRSqPCR阳性肺组织的频率的概述示于下表8.14中。表8.14：组中PRRSvqPCR阳性肺组织的频率1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。2一只PRRS94881MLV猪及两只攻毒对照猪在攻毒前死亡且未包括在分析内。NI＝未包括在统计分析内血清PRRSqPCRD0时，在任何猪的血清中均未检测到PRRSvRNA。疫苗接种后，PRRS94881MLV接种猪在D7、D14、D21、D28、D56、D84、D112、D140及D168时的平均值分别为3.00、0、0、3.00、0、0、0、0及0log10GE/mL。D7、D14、D21及D28时，值显著高于攻毒对照(p≤0.0013)，因为攻毒对照直至D182(DPC3)时才检测到PRRSvRNA。D179(DPC0)时，在任何猪的血清中均未检测到PRRSvRNA。与攻毒对照在D182(DPC3)、D186(DPC7)及D189(DPC10)时的中值分别为5.88、5.30及4.24log10GE/mL相比，攻毒后，PRRS94881MLV接种猪在同一天的中值分别为4.44、0及0log10GE/mL。在所有攻毒后之日，攻毒对照的中值均高于PRRS94881MLV组(p≤0.0001)。在此研究期间在来自任何阴性对照猪的血清中均未检测到PRRSvRNA。PRRS94881MLV接种猪在DPC0至DPC10及DPC3至DPC10的中值AUC值分别为每天15.54及8.88log10GE/mL。相比之下，攻毒对照在DPC0至DPC10及DPC3至DPC10的中值AUC值分别为每天44.77及36.43log10GE/mL。对于两个时期，PRRSMLV组的中值均显著低于攻毒对照的中值(p<0.0001)。血清PRRSqPCR数据的概述示于下表8.15及8.16中。表8.15：D0至D168血清PRRSqPCR结果(log10GE/mL)的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。NI＝未包括在统计分析内表8.16：D179至D189血清PRRSqPCR结果(log10GE/mL)的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。NI＝未包括在统计分析内。AUC＝曲线下面积；每天log10GE/mL疫苗接种后，PRRS94881MLV组在D7、D14、D21及D28时的qPCR阳性猪的比例显著高于攻毒对照组(p≤0.0013)。D56时，在组之间未检测到qPCR阳性猪的比例的显著差异(p＝0.1069)。D182(DPC3)时，PRRS94881MLV及攻毒对照组中的100％猪为qPCR阳性(未进行测试)。D186(DPC7)及D189(DPC10)时，PRRSMLV组的qPCR阳性猪的比例显著低于攻毒对照组(<0.0001)。组中qPCR阳性数据的比例的概述示于下表8.17及8.18中。表8.17：组中疫苗接种后血清qPCR阳性结果的比例的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。n.a.＝未进行测试；NI＝未包括在统计分析内表8.18：组中攻毒后血清qPCR阳性结果的比例的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。n.a.＝未进行测试；NI＝未包括在统计分析内攻毒后临床观察与一只攻毒对照猪(第149号)在D185(DPC6)时显示评分为“1”相比，攻毒后在任何PRRS94881MLV接种猪中均未观察到异常呼吸。在组之间未检测到显示攻毒后至少一天异常呼吸的猪的百分比的差异(p＝0.4878)。攻毒后，在任何PRRS94881MLV接种猪或攻毒对照猪中均未观察到异常行为及咳嗽。PRRS94881MLV接种组及攻毒对照组的攻毒后至少一天总临床评分>0的猪的百分比分别为0％及5％。这些值无显著差异(p＝0.4878)。D179至D189在阴性对照组中未观察到临床征象。组中在攻毒后时期内具有至少一个阳性临床观察评分的猪的频率的概述示于下表8.19中。表8.19：组中攻毒后具有至少一个阳性临床观察评分的猪的频率的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。2一只PRRS94881MLV猪及两只攻毒对照猪在攻毒前死亡且未包括在分析内。NI＝未包括在统计分析内；NA＝测试由于缺乏可变性而不适用组之间攻毒后最大呼吸评分或最大总评分无差异(p＝0.4878)。组中攻毒后时期(DPC1至DPC10)的最大临床观察评分的概述示于下表8.20中。表8.20：组中攻毒后最大临床评分的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。2一只PRRS94881MLV猪及两只攻毒对照猪在攻毒前死亡且未包括在分析内。NI＝未包括在统计分析内平均临床观察评分遵循类似于具有阳性临床评分的猪的百分比的模式。PRRS94881MLV接种组与攻毒对照组之间无显著差异(p≥0.4878)。组中攻毒后时期(DPC1至DPC10)的平均临床观察评分的概述示于下表8.21中。表8.21：组中攻毒后平均临床评分的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。2一只PRRS94881MLV猪及两只攻毒对照猪在攻毒前死亡且未包括在分析内。NI＝未包括在统计分析内体重及平均日增重组之间的差异不显著(p＝0.2389)。D179(DPC0)时，PRRS94881MLV组及攻毒对照组的平均体重及LS平均体重分别为134.6及128.2kg。差异不显著不同(p＝0.1090)。D188(DPC9)时，PRRS94881MLV组及攻毒对照组的平均体重及LS平均体重分别为138.3及130.3kg。D188时，疫苗接种组的体重显著高于攻毒对照组的体重(p＝0.0455)。PRRS94881MLV组及攻毒对照组的攻毒时期(DPC0至DPC9)的LS平均ADWG分别为0.4及0.2kg/d。这些值无显著差异(p＝0.1041)。阴性对照猪在D0、D179及D188时的平均体重分别为2.7、117.2及120.0kg。阴性对照组D179至D188的ADWG为0.5kg/d。组中D0、D179(DPC0)及D188(DPC9)时的平均体重及DPC0至DPC9的ADWG的概述示于下表8.22中。PRRS94881MLV组及攻毒对照组的体重及ADWG的LS平均值及统计分析的概述示于下表8.23中。表8.22：组中体重及平均日增重(kg及kg/d)的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。表8.23：组中LS平均体重及日增重(kg及kg/d)的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。直肠温度在攻毒之日(D179)PRRS94881MLV组的平均直肠温度为39.3℃，且攻毒后平均值在39.1℃(D189，DPC10)至39.8℃(D181，DPC2)的范围内。在攻毒之日攻毒对照组的平均直肠温度为39.1℃，且攻毒后平均值在39.1℃(D183，DPC4)至39.9℃(D182，DPC3)的范围内。相同时间段内，阴性对照组的平均直肠温度保持≤39.3℃。组中直肠温度的概述示于下表8.24中。表8.24：组中D179(DPC0)至D189(DPC10)的直肠温度(℃)的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。2一只PRRS94881MLV猪及两只攻毒对照猪在攻毒前死亡且未包括在分析内。与攻毒对照相比，PRRS94881MLV接种猪在DPC0(p＝0.0281)、DPC2(p＝0.0095)、DPC4(p＝0.0034)及DPC5(p<0.0001)时的最小平方平均直肠温度显著较高。与攻毒对照相比，PRRS94881MLV接种猪在DPC8(p＝0.0183)及DPC10(p＝0.0001)时的最小平方平均直肠温度显著较低。攻毒后剩余天数在组之间未检测到显著差异(p≥0.0642)。组中直肠温度的LS平均值及统计分析的概述示于下表8.25中。表8.25：组中D179(DPC0)至D189(DPC10)的LS平均直肠温度(℃)的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。21只PRRS94881MLV接种猪中3只(14％)及20只攻毒对照中5只(25％)在攻毒后至少一天直肠温度≥40.5℃。在组之间未检测到显示攻毒后至少一天直肠温度≥40.5℃的猪的比例的差异(p＝0.4537)。组中攻毒后至少一天发热(≥40.5℃)的猪的比例的概述示于下表8.26中。表8.26：组中攻毒后至少一天发热(≥40.5℃)的比例的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。2一只PRRS94881MLV猪及两只攻毒对照猪在攻毒前死亡且未包括在分析内。NI＝未包括在统计分析内疫苗接种后临床评定22只PRRS94881MLV猪中4只(18％)、22只攻毒对照猪中8只(36％)及12只阴性对照猪中2只显示D1至D21中至少一天的异常临床评定。组之间此参数无显著差异(p＝0.3102)。组中D1至D21中具有至少一个异常临床评定的猪的百分比的概述示于下表8.27中。表8.27：组中D1-D21具有至少一个异常临床评定的猪的百分比的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。NI＝未包括在统计分析内总体上，7只PRRS94881MLV猪在D1至D177中显示至少一天的异常临床评定。猪121显示D61至D146腹部隆起，D147至D167鞘膜肿胀，D168腹部隆起，D169-172鞘膜肿胀，及173至177腹部隆起。猪141在D4-D10消瘦，D4-D6抑郁，及D5毛皮粗糙。猪144显示在D26时咳嗽。猪146显示在D82时胸骨肿胀。猪147在D84-D86腿虚弱且D84时发颤。猪154在D4-D6消瘦。猪179在D2-D5消瘦，显示在D5时毛皮粗糙且发现在D6时死亡。攻毒对照组中13只猪显示D1至D177中至少一天有异常临床评定：猪124显示在D20时发颤及颤抖且发现在D21时死亡。猪134显示D46-D68鞘膜肿胀，D69-D143腹部隆起，D144时脐疝，且D145至D177腹部隆起。猪137显示D108-D143鞘膜肿胀。猪138显示D115-D143鞘膜肿胀。猪148显示D16-20跛行或腿肿胀及在D35时咳嗽。猪149在D5-D9及D12时消瘦，且显示D12-D15毛皮粗糙。猪150在D4-D9及D13时消瘦，显示D10-D12身体状况不良，且在D11时抑郁。猪161在D4-D9消瘦，显示D9时毛皮粗糙及中枢神经系统征象且发现在D10时死亡。猪167显示D117-D143鞘膜肿胀。猪170在D4-D7消瘦，且显示D7时抑郁。猪172显示D120-D143悬爪溃疡或肿胀。猪177显示在D19时抑郁且D156-D159颈上肿胀。猪178显示在D5、D17-20及D28-D36抑郁，D15-D47腿跛行及/或肿胀，D16-D18消瘦，且D39-D47腿僵硬。阴性对照组中6只猪显示D1至D177中至少一天有异常临床评定。猪120显示D5-7及D12时咳嗽。猪126在D2-18消瘦，显示D4-D5、D10及D17-D19时抑郁，D5时毛皮粗糙，且D18-D22呼吸吃力。猪132显示D49-D56脓肿。猪145显示D37-D43及D46至D74时鞘膜肿胀，且D75-D83及D85至D87时鞘膜溃疡。猪151显示D78-D83及D85时跛行及/或腿肿胀。猪155显示D69-D77脓肿。在攻毒之前发生三起死亡。猪179(PRRS94881MLV，D6)：尸检揭示最小损伤(瘦弱，身体状况不良)。实验室测试显示轻度巨噬细胞间质性肺炎。免疫组织化学为PRRS阴性。肠样品自溶，但未显示严重坏死或严重发炎的迹象。分离出平滑大肠杆菌(SmoothEscherichiacoli)及肠球菌属(Enterococcusspp)(15.9部分)。猪124(攻毒对照，D21)：尸检时未鉴别出总体损伤。实验室测试显示严重化脓性至脓肉芽肿性脑膜脑炎以及化脓性血管周炎。肺部及肝脏充血亦明显。诊断为猪链球菌相关性脑膜脑炎。猪161(攻毒对照，D10)：尸检揭示最小损伤(瘦弱，身体状况不良)。自肺组织分离出支气管败血性博德氏杆菌、α溶血性链球菌(Streptococcusalphahaemolytic)及耳葡萄球菌(Staphylococcusauricularis)。PRRS血清学所有猪在D0及D7时均为PRRSELISA阴性。至D14时，90％的PRRS94881MLV接种猪具有阳性PRRSELISA效价。在D21时，此数目增至95％，且在D28、D56、D84、D112、D140及D168时，此数目分别为100％、100％、100％、90％、100％及95％。在此研究的疫苗接种期期间，无攻毒对照猪发展PRRS抗体效价，且D14至D168，PRRS抗体效价阳性的PRRS94881MLV接种猪的百分比显著高于攻毒对照(p<0.0001)。在研究的攻毒期期间，DPC0、DPC3、DPC7及DPC10时具有阳性PRRSELISA效价的PRRS94881MLV接种猪的百分比分别为95％、95％、100％及100％。相比之下，攻毒对照猪未发展PRRS抗体效价，直至DPC7，此时30％具有效价。DPC10时，此增至80％。在研究的整个攻毒期，PRRS94881MLV接种猪的PRRS抗体效价阳性的动物的百分比较高(p≤0.0478)。D112时除两只猪以外，阴性对照组中猪在整个研究期间均为PRRSELISA血清阴性。第116号及第120号在D112时为PRRSELISA血清阳性。组中在攻毒之前PRRS抗体效价阳性的猪的百分比的概述示于下表8.28中。来自研究的攻毒部分的数据展示于下表8.29中。表8.27：按照天数，组中第0-168天PRRS抗体效价阳性的猪的频率的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。NI＝未包括在统计分析内；NA＝不适用，未进行分析表8.29：组中DPC0至DPC10按照天数PRRS抗体效价阳性的猪的频率的概述1第1组＝PRRS94881MLV疫苗；第2组＝攻毒对照组；第3组＝阴性对照组。NI＝未包括在统计分析内讨论/结论为达成研究目标，二十二(22)只健康、PRRS易感染且血清阴性猪在约14日龄用1mlPRRS94881MLV经肌内接种。三十四只(22只猪-攻毒对照组及12只猪-阴性对照组)PRRS易感染且血清阴性猪在约14日龄用1ml对照产品经肌内接种。研究及攻毒模型的验证在整个研究期间阴性对照组中的猪保持PRRSv(病毒血症；qPCR)阴性。阴性对照组中的两只猪(第116号及第120号)在D112时具有阳性ELISA效价，而此组的所有其他ELISA结果均为阴性。认为总体上在这些猪中或在此组中未检测到病毒血症；同样，所有其他血清样品均为ELISA阴性，认为此两只猪在D112时的结果可能由于不可赋值的实验室误差而为假阳性。因此，此为有效研究。与有效研究的建立无关，与0.0％的中值总体损伤评分形成对比，阴性对照组在D189时的中值组织学肺损伤评分为9.0。这些数据突出表明，长时间圈养在正常养猪条件下的猪发展微小肺损伤，所述肺损伤无关紧要且与特定病原体无关。在用欧洲型PRRS分离株205817通过早先描述的方法接种后，攻毒对照组显示DPC0至DPC9的平均ADWG为0.2kg/天(阴性对照组的平均ADWG为0.5kg/天)，中值总体肺损伤评分为13.8％(阴性对照组为0.0％)，中值组织学肺损伤评分为19.5(阴性对照组为9.0)及肺组织中检测到的PRRSvRNA的中值为6.25log10GE/mL(阴性对照组的中值为0.0log10GE/mL)。这些结果突出表明，在攻毒对照组中诱发了PRRS特异性临床疾病，因此验证此攻毒模型为足以评估PRRS疫苗功效及更特别是PRRS94881MLV的26周免疫力持续时间的临床实验工具。确定PRRS94881MLV的26周免疫力持续时间疫苗接种后26周的PRRS94881MLV的DOI的确定是基于疫苗组显示与攻毒对照组相比，攻毒后肺损伤(总体或组织学)显著减少(p≤0.05)。总体及组织学肺损伤被选为确定26周DOI的主要参数，因为在猪中PRRS呼吸攻毒模型内评估新疫苗时，此参数提供功效的最临床相关且令人信服的证据。肺损伤发展为猪中PRRS呼吸疾病的标志之一，且可认为其为继发性PRRSv疾病特征(诸如临床征象、发热、ADWG降低等)的所有后续表达的来源。与显示中值总体肺损伤评分为13.8％的攻毒对照组相比，中值总体肺损伤评分为0.1％(p<0.0001)，这表明PRRS94881MLV组显示攻毒后总体肺损伤显著减少。此外，与中值组织学肺损伤评分为19.5的攻毒对照组相比，PRRS94881MLV组的中值组织学肺损伤评分为6.0(p<0.0001)，这表明PRRS94881MLV组显示组织学肺损伤评分显著降低。因此，基于攻毒后肺损伤显著减少的主要参数，确定在1×104.27TCID50的剂量下PRRS94881MLV的DOI为26周。此结果由略低于目标最小免疫剂量1×104.5TCID50/mL的疫苗剂量达成。虽然一只攻毒对照猪(第123号)因为由细菌性感染引起的胸膜炎及粘连而无法对总体肺损伤进行评分，但可对组织学肺损伤进行评分。此猪自攻毒对照组的总体肺损伤评分分析中剔除不影响此研究的结果。攻毒后病毒血症被选为最重要的次要参数，因为其代表了在暴露后宿主动物内发生病毒复制的程度及持久性。病毒血症显著减少(p≤0.05)与诱发足够免疫力以在宿主内限制PRRS发病机制的PRRS疫苗相对应。在攻毒后3、7及10天，PRRS94881MLV接种组显示与攻毒对照组相比病毒血症(qPCR)显著减少(p<0.0001)。为在组之间进一步评估攻毒后病毒血症，计算攻毒后特定持续时间内病毒负荷的量，表示为“曲线下面积”或AUC。PRRS94881MLV接种组在DPC0至DPC10的中值AUC值为每天15.54log10GE/mL；而攻毒对照组的中值AUC值为每天44.77log10GE/mL(p<0.0001)。此外，PRRS94881MLV接种组在DPC3至DPC10的中值AUC值为每天8.88log10GE/mL；而攻毒对照组此时期的中值AUC值为每天36.43log10GE/mL(p<0.0001)。无论在攻毒后特定时间点抑或在攻毒后时间内检查病毒血症，在用毒性异源性欧洲型PRRS株攻毒之前26周给予的PRRS94881MLV在攻毒接种后均显著(p≤0.05)降低病毒血症。结合攻毒后PRRS病毒血症减少，根据PRRS疫苗免疫力观点，肺组织中病毒负荷的显著(p≤0.05)降低亦具有重大意义。肺组织中病毒负荷降低可能与宿主内病毒稳定性、复制及持久性降低相关，且继而可使PRRSv至其他猪的流动减少。在此研究中，来自PRRS94881MLV组的肺组织在攻毒后10天(DPC10)的中值肺qPCR结果为3.69log10GE/mL，而攻毒对照组的中值肺qPCR结果为6.25log10GE/mL。疫苗组与攻毒对照组之间的差异显著(p<0.0001)，因此进一步支持26周的免疫力持续时间。猪中攻毒后临床征象的严重程度及频率明显降低亦支持了PRRS疫苗功效及PRRS94881MLV的DOI为26周的确定。仅仅一只猪显示攻毒后临床征象：猪149(攻毒对照)在D185时具有“1”的呼吸评分(喘息/呼吸迅速)。PRRS94881MLV接种组中无猪在此研究的攻毒后阶段期间显示临床征象，且在疫苗接种与攻毒对照组之间无统计学差异(p＝0.4878或未进行测试)。在此研究中攻毒后临床征象评定DOI不够有力。攻毒后，发热在组之间发生变化。与攻毒对照猪相比，PRRS94881MLV接种猪显示在两天(DPC8及DPC10；p≤0.0183)的LS平均直肠温度显著较低，且在四天(DPC0、DPC2、DPC4及DPC5；p≤0.0281)的LS平均直肠温度较高。对于其他天数，攻毒后在组之间未检测到显著差异(p≥0.0642)。虽然攻毒后在组之间检测到统计学差异，但这些差异并不具有生物学意义，因为所有组的平均直肠温度保持≤39.9℃(攻毒对照组，D182)。在组之间未检测到攻毒后至少一天发热的猪的比例的差异(p＝0.4537)。攻毒对照组中由PRRS引起的显著病毒血症、肺损伤及病毒负荷的存在导致组之间DPC9时的体重差异显著(p≤0.05)。在此研究中，疫苗接种及攻毒对照组DPC9的LS平均体重分别为138.3kg及130.3kg(p＝0.0455)。疫苗接种及攻毒组在DPC0至DPC9的LS平均ADWG分别为0.4kg/天及0.2kg/天。此差异在统计学上不显著(p＝0.1041)。此研究中检查的疫苗接种后参数在此研究的疫苗接种期期间，发现三只猪死亡。发现猪179(PRRS94881MLV接种)在D6时死亡，与平滑大肠杆菌及肠球菌属感染有关。发现猪161(攻毒对照组)在D10时死亡，与支气管败血性博德氏杆菌、α溶血链球菌及耳葡萄球菌感染有关。发现猪124(攻毒对照组)在D21时死亡，与引起脑膜脑炎的猪链球菌感染有关。为控制及防止任何更多的死亡，猪用可注射维生素及抗生素大规模处理。治疗之后，未再发生死亡。因为两个处理组中均发生死亡，所以可假定IVP自身并不与感染有关。更可能的是，到达研究实验室的猪具有这些感染。这些猪的数据在可用时包括在内。来自这些猪的总体及组织学肺损伤评分自肺损伤分析中剔除，因为这些猪在给予攻毒之前死亡。在疫苗接种至攻毒的长时间内1只PRRS94881MLV猪及2只攻毒对照猪的损失不影响研究结果。在D0时接种后，在猪中未观察到与PRRS94881MLV接种或对照产品相关的异常临床评定。PRRS94881MLV接种组中7只猪在疫苗接种后具有异常评定；而13只攻毒对照猪具有异常评定。除去此三只因细菌性感染而死亡的猪，这些异常评定包括各时间点的消瘦、咳嗽、肿胀、毛皮粗糙、抑郁、脓肿及身体状况不良，其中无一者持续长时间。在作者看来，这些发现结果并不与任一实验产品的给予相关，而是在分群圈养情况下长时间生长/成熟猪中典型的发现结果。所有猪在D0时均为PRRSELISA血清学阴性，因此证实所有猪在进入研究时均符合PRRS血清阴性的入选准则。接受PRRS94881MLV的大部分猪(90％)在D14时发生PRRS血清转化，且所有PRRS接种猪在D28时为血清阳性。相反，攻毒对照猪保持血清阴性直至攻毒后7天，此时此组开始显示PRRS血清转化。如早先所报导，2只阴性对照猪在D112时为PRRSELISA血清阳性，认为此为偶然发现，可能是由于不可赋值的实验室误差。在疫苗接种后7、14、21及28天，PRRS94881MLV接种组分别显示3.00、0、0及3.00log10GE/mL的中值qPCR结果。这些结果突出表明，在疫苗接种后4周内，1×104.27TCID50剂量的PRRS94881MLV诱发MLV的充分复制，所述复制通常是在疫苗接种后4周建立保护性免疫力所需要的。相反，攻毒对照组为PRRS病毒血症阴性，直至攻毒后三天。结论与攻毒对照组相比，PRRS94881MLV组的尸检时总体及组织学肺损伤、尸检时肺组织中的病毒负荷及攻毒后病毒血症的显著减少(p≤0.05)证明了当在2周龄进行疫苗接种且在疫苗接种后26周攻毒时疫苗针对毒性PRRSv具有功效。因此，此研究的结果证明用PRRS94881MLV接种后26周的免疫力持续时间。这些结果用1×104.27TCID50/mL的疫苗剂量达成，此疫苗剂量略低于最小免疫剂量(1×104.5TCID50/mL)。PRRSV94881减毒株及亲本株的序列如下：SEQIDNO:1：94881的PRRS种原病毒的全长核苷酸序列SEQIDNO:2：由SEQIDNO:1中核苷酸178..7227之间的序列编码的94881MSV的ORF1aMSGMFSRCMCTPAARVFWNAGQVYCTRCLSARSLLSPELQDTDLGAVGLFHKPKDKLHWKVPIGIPQVECSPSGCCWLSTIFPLARMTSGNHNFLQRLVKVADVLYRDGCLTPRHLRELQVYERGCNWYPITGPVPGMAVYANSMHVSDQPFPGATHVLTNSPLPQRACRQPFCPFEEAHSSIYRWEKFVIFMDSSSDGRSRMMWTPESDDSTALEVLPPELEHQVKVLVRSFPAHHLVDLADWELTESPDNGFSFSTSHPCGYLVRDPAVSEGKCWLSCFLSQSAEVLSREAHLATAYGYQTKWGVPGKYIQRRLQVHGLRAVVDPDGPIHVEALSCPQSWIRHLTLNDDVTPGFVRLMSLRIVPNTEPTTHRIFRFGVHKWYGAAGKRARGKRAAKSEKDSASTLKVARPTSTSGIVTYSPPADGSCGWHALAAILNRMINNDFTSPLPRYNRPEDDWASDGDLAQAIQCLQLPAAIARNRACPNAKYLIKLNGVHWEVEVRPGMAPRSLSRECVVGVCSEGCVASPYPEDGLPKRALEALASAYRLPSDCVCDGIIDFLANPPPQEFWTLDKMLTSPSPEQSGFSSLYKLLLEILPQKCGSTEGEFIYTVERMLKDCPSSKQAMALLAKIKVPSSKAPSVTLNECFPTDVPVNSELISWEEPKDPGAAVVLCPSDAKESKETAPEEAQARNRKVLHPVVLTEELSEQQVQVVEGDQDMPLDLTWPTLTATATPVRGPVPDNLSSGIGAQPATVQELILARPAPRLVERCGTESNGSSSFLDLPDVQTSDQPLDLSLAAWPVRATASDPGWIHGRREPVFVKPRGVFSDGESALQFGELSEASSVVDDRTKEAPVVDAPIDLTTSNETLSGSDPFEFAKFRRPRFSAQALIDRGGPLADVHAKIKSRVYEQCLQACEPGSRATPATKKWLDKMWDRVDMKTWRCTSQFQAGHILESLKFLPDMIQDTPPPVPRKNRAGDSAGLKQLVAQWDRKSSVTPPTKPVGPVLDQAVPLPMDIQQGDAISADKPPHSQNPSSQVDVGGGWKSFMLSGTRFAGSVSQRLTTWVFEVLSHLPAFMLTLFSPRGSMAPGDWLFAGAVLLALLLCRSYPILGCLPLLGVFSGSVRCVRLGVFGSWMAFAVFLFSTPPDPVGSSCDHDSPECHAELLALEQRQLWEPVRSLVVGPSGLLCVILGKLLGGSRCLWFVLLRICMLADLAISLIYVVSQGRCHKCWGKCIRTAPAEVALNVFPFSRATRSSLVSLCDRFQAPKGVDPVHLATGWRGCWCGESPIHQSHQKPIAYANLDEKKISAQTVIAVPYDPSQAIKCLKVLQAGGAIVDQPTPEVVRVSEIPFSAPFFPKVPVNPDCRVVVDSDTFVAAVRCGYSTAQLVLGRGNFAKLNQTPLRNSVPTKTTGGASYTLAVAQVSVWTLVHFILGLWLTSPQVCGRGTSDPWCSNPFSYPTYGPGVVCSSRLCVSADGVTLPLFSAVAHLSGREVGIFILVLASLGALAHRLALKADMSMVFLAFCAYAWPMSSWLICFFPMLLRWVTLHPLTMLWVHSFLVFCLPAAGVLSLGITGLLWAVGRFTQVAGIITPYDIHQYTSGPRGAAAVATAPEGTYMAAVRRAALTGRTLIFTPSAVGSLLEGAFRTQKPCLNTVNVVGSSLGSGGVFTIDGRRVIVTATHVLNGNTARVTGDSYNRMHTFNTNGDYAWSHADDWQGVAPMVKIAKGYRGRAYWQTSTGVEPGIMGEGFAFCFTNCGDSGSPVISEAGDLIGVHTGSNKLGSGLVTTPEGETCSIKETRLSDLSRHFAGPSVPLGDIKLSPAIIPDVTTIPSDLASLLASVPVMEGGLSTVQLLCVFFLLWRMMGHAWTPIVAVGFFLLNEILPAVLVRAVFSFALFVLAWATPWSAQVLMIRLLTAALNRNRLSLAFYAFGGVVGLATEIGTFAGGWPELSQALSTYCFLPRFLAVTSYVPTIIIGGLHALGVILWLFKYRCLHNMLVGDGSFSSAFFLRYFAEGNLRKGVSQSCGMNNESLTAALACKLSQADLDFLSSLTNFKCFVSASNMKNAAGQYIEAAYARALRQELASLVQVDKMKGVLAKLEAFAETATPSLDTGDVIVLLGQHPHGSILDINVGGERKTVSVQETRCLGGSKFSVCTMVSNTPVDTLTGIPLQTPTPLFENGPRHRSEDDDLKVERMKKHCVSLGFHKINGKVYCKIWDKSNGDTFYTDDSRYTQDHAFQDRSTDYRDRDYEGVQTAPQQGFDPKSEAPVGTVVIGGITYNRHLVKGKEVLVPKPDNCLEAARLSLEQALAGMGQTCDLTATEVEKLKRIISQLQGLTTEQALNCSEQIDNO:3：由SEQIDNO:1中核苷酸7209...11600之间的序列编码的94881MSV的ORF1BTGFKLLAASGLTRCGRGGLVVTETAVKIVKYHSRTFTLGSLDLKVTSEVEVKKSTEQGHAVVANLCSGVVLMRPHPPSLVDVLLKPGLDTTPGIQPGHGAGNMGVNGSIWDFETAPTKVELELSKQIIQACEVRRGDAPNLQLPYKLYPVRGDPERRKGRLVNTRFGDLPYKTPQDTKSAIHAACCLHPNGVLVSDGKSTLGTTLQHGFELYVPTVPYSVMEYLDSRPDTPFMCTKHGTSKAAAEDLQKYDLSTQGFVLPGVLRLVRRFIFSHVGKAPPLFLPSTYPAKNSMAGVNGQRFPTKDVQSIPEIDEMCARAVKENWQTVTPCTLKKQYCSKPKTRTILGTNNFIALAHRSALSGVTQAFMKKAWKSPIALGKNKFKELHCTVAGRCLEADLASCDRSTPAIVRWFVANLLYELAGCEEYLPSYVLNCCHDLVATQDGAFTKRGGLSSGDPVTSVSNTVYSLIIYAQHMVLSALKMGHEIGLKFLEEQLKFEDLLEIQPMLVYSDDLVLYAERPTFPNYHWWVEHLDLMLGFKTDPKKTVITDKPSFLGCRIEAGRQLVPNRDRILAALAYHMKAQNASEYYASAAAILMDSCACIDHDPEWYEDLICGIARCARQDGYRFPGPAFFMSMWEKLKSHNEGKKCRHCGICDAKADYASACGLDLCLFHSHFHQHCPVTLSCGHHAGSKECSQCQSPVGAGKSPLDAVLKQIPYKPPRTIIMKVDNKTTTLDPGRYQSRRGLVAVKRGIAGNEVDLSDGDYQVVPLLPTCKDINMVKVACNVLLSKFIVGPPGSGKTTWLLNQVQDDDVIYTPTHQTMFDIVSALKVCRYSIPGASGLPFPPPARSGPWVRLIASGHVPGRVSYLDEAGYCNHLDILRLLSKTPLVCLGDLQQLHPVGFDSYCYVFDQMPQKQLTTIYRFGPNICAAIQPCYREKLESKARNTRVVFTTRPVAFGQVLTPYHKDRTGSAITIDSSQGATFDIVTLHLPSPKSLNKSRALVAITRARHGLFIYDPHDQLQEFFNLTPERTDCNLAFSRGDELVVLNVDNAVTTVAKALETGSPRFRVSDPRCKSLLAACSASLEGSCMPLPQVAHNLGFYFSPDSPAFAPLPKELAPHWPVVTHQNNRAWPDRLVASMRPIDARYSKPMVGAGYVVGPSIFLGTPGVVSYYLTLYIGGEPQALPETLVSTGRIATDCREYLDAAEEEAARELPHAFIGDVKGTTIGGCHHITSKYLPRSLPKDSVAVVGVSSPGRAAKAVCTLTDVYLPELRPYLQPETASKCWKLKLDFRDVRLMVWKGATAYFQLEGLTWSALPDYARFIQLPKDAVVYIDPCIGPATANRKVVRTTDWRADLAVTPYDYGAQVILTTAWFEDLGPQWKILGLQPFRRTFGFENTEDWAILARRMNDGKDYTDYNWHCVRERPHAIYGRARDHTYHFALGTELQVELGRPRLPPEQVPSEQIDNO:4：由SEQIDNO:1中核苷酸11611..12360之间的序列编码的94881MSV的ORF2MQWVYCGVKSVSCSWMPSLSSLLVWLTLSSFSPYCLGSLLQAGYWSSFSEWFAPRFSVRALPFTLPNYRRSYEGLLPNCRPDVPQFAVKHPLGILWHMRVSHLIDEMVSRRIYRTMEHSGQAAWKQVVSEATLTKLSRLDVVTHFQHLAAVEADSCRFLSSRLAMLKNLAVGNVSLEYNTTLDRVELIFPTPGTRPKLTDFRQWLISVHASIFSSVASSVTLFTVLWLRIPALRYVFGFHWPTATHHSNSEQIDNO:5：由SEQIDNO:1中核苷酸12219..13016之间的序列编码的94881MSV的ORF3MAYQRARFHLLLCGFVCYLVHSALASNSSSTLCFWFPLAHGNTSFELTINYTICKPCPTSQAAQQRLEPGRNVWCKIGHDRCEERDHDELSMSIPSGYDNLKLEGYYAWLAFLS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