一种人乳铁蛋白的制剂化制备方法与流程

一种人乳铁蛋白的制剂化制备方法，属于医药技术领域。

背景技术：

人乳铁蛋白(rhLF)是一种多功能蛋白，属于转铁蛋白家族，具有促进铁吸收、抗菌、抗病毒、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化作用等生理功能。因此被广泛用于婴幼儿奶粉，营养保健食品，化妆品，饲料添加剂，食品保鲜剂，辅助药物治疗等方面。

无锡科捷诺生物科技有限责任公司首次利用体细胞克隆技术获得转人乳铁蛋白基因克隆牛，其中人乳铁蛋白转基因克隆牛表达量高达 3g/L，获得了国际上最大的、遗传稳定的转基因奶牛繁育群体。以转基因牛奶为原料，经过预处理、层析分离、病毒灭活与去除、超滤浓缩与缓冲液置换、无菌过滤、冷冻干燥或喷雾干燥等工艺步骤，制备出纯度大于90%的重组人乳铁蛋白。

近期研究发现人乳铁蛋白经口服给药以后，大部分乳铁蛋白被胃液的胃蛋白酶消化，导致这些活性物质低吸收和不稳定，尤其以口服给药方式生物利用度更低，因其在肠道pH环境中不稳定，易被酶水解，生物半衰期短，口服后活性成分容易降解，不能完整的到达肠道有效吸收部位发挥其生理活性功能。稳定性差、易被降解、不易吸收和生物利用度低，这也是蛋白、多肽类口服给药的共性缺点。作为将来替代牛乳铁蛋白的一个很安全且制备简单、成本低的多功能蛋白------重组人乳铁蛋白，如何提高其稳定性和生物利用度亟待需要解决，因此构建一种行之有效的乳铁蛋白载体势在必行。

利用天然高分子载体-多孔淀粉又称微孔淀粉，是一种新型变性淀粉，指经酶解处理而使颗粒呈现多孔状的淀粉，与天然淀粉相比具有较大的比表面积、比孔容及良好的吸水、吸油性能，并且成本低，无毒害，可自然降解。多孔淀粉与天然淀粉相比主要有以下特点：(1)较大比孔容；(2)较大比表面积；(3)堆积密度、颗粒密度较低：(4)良好吸水、吸油能力：(5)在干燥状态下有良好机械强度；(6)分散在水及其它溶剂中能保持明显结构完整性：(7)加工过程不使用化学试剂，安全、无毒，使用剂量不受限制。多孔淀粉因多孔产生很大的比表面积，因此多孔淀粉主要用作吸附功能性物质的载体。

采用多孔淀粉包埋重组人乳铁蛋白，开发一种新的剂型---人乳铁蛋白微囊，能够使口服人乳铁蛋白在胃内不被消化破坏，到达肠道部位释放发挥其生物学活性，一方面解决了口服制剂给药量大和给药频繁的缺点，同时也保留了蛋白类产品的生物学活性，提高其生物利用度。同时能够克服药物稳定性问题，此外，该包封的微粒给药系统达到肠道缓控释放药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种人乳铁蛋白的制剂化制备方法，以多孔淀粉作为载体，对人乳铁蛋白进行吸附包埋。

本发明的技术方案：一种人乳铁蛋白的制剂化制备方法，其特征在于配制浓度为40-65 mg/mL的人乳铁蛋白溶液，按多孔淀粉︰人乳铁蛋白溶液的w︰v为 1︰10的比例加入0.4-0.8g多孔淀粉，用磁力搅拌器在室温下搅拌10 h，之后静置5h， 5000rpm下离心10-20min，沉淀进行冷冻干燥，即得以多孔淀粉为载体的制剂化人乳铁蛋白。

优选的制备方法为：配制浓度为60 mg/mL的人乳铁蛋白溶液，按多孔淀粉︰人乳铁蛋白溶液的w︰v为 1︰10的比例加入0.4g多孔淀粉，用磁力搅拌器在室温下搅拌10 h，之后静置5h，5000rpm离心10min，沉淀进行冷冻干燥，即得以多孔淀粉为载体的制剂化人乳铁蛋白。

本发明的有益效果：开发一种可口服的乳铁蛋白新制剂，避免口服蛋白质类药物在胃液中被水解破坏，使到达肠道发挥作用。

附图说明

图1不同人乳铁蛋白初始浓度时多孔淀粉的载量。

图2 多孔淀粉包载的人乳铁蛋白在肠液中的释放曲线。

具体实施方式

实施例1多孔淀粉的制备

多孔淀粉的制备工艺流程为：以玉米淀粉为原料，经调浆、加酶酶解、离心、洗涤、沉淀常压干燥、粉碎过筛，得多孔淀粉。准确称量15 g玉米淀粉加入到100 mL的三角瓶中，加入50 mL pH 5.8的0.2 mol/L Na₂HPO₄-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液，加入两滴甲苯(防止淀粉粘壁)，45℃下预热10 min，加入α-淀粉酶︰糖化酶体积比为1︰3的混合酶，酶用量为淀粉量的1.0%，45℃恒温均匀搅拌反应15h，酶解液在4000 rpm离心并洗涤3次，弃去上清液，沉淀在40℃下常压干燥，粉碎过筛即得。制备的多孔淀粉吸油率达到79.3%，得率为51.2%，多孔淀粉吸油率是原淀粉的2.9倍，且淀粉颗粒保持完整，打孔均匀。

实施例2多孔淀粉包载人乳铁蛋白的饱和吸附曲线

人乳铁蛋白溶液的浓度是影响多孔淀粉吸附量的关键因素。要获得人乳铁蛋白的最高载量，需要计算出其在多孔淀粉中的饱和吸附浓度。

表1 多孔淀粉包载人乳铁蛋白初步优化

从上表可以看出浓度为20，40，60 mg/mL的人乳铁蛋白液中的人乳铁蛋白被多孔淀粉吸附，并且随着浓度的升高吸附量逐渐的增大。从80mg/mL开始，吸附量为一个负数，说明，从80mg/mL开始，人乳铁蛋白由于高浓度导致大分子之间的缠绕、聚集使分子尺寸增大，较难进入多孔淀粉的蜂窝状孔洞中，多孔淀粉吸水的能力远远强于淀粉吸附人乳铁蛋白的能力，导致上清液中的人乳铁蛋白浓度反而增大。因此，选择人乳铁蛋白溶液的浓度为45、55、65、70 mg/mL进行进一步优化，筛选出载量最大的人乳铁蛋白初始吸附浓度。

表2多孔淀粉包载人乳铁蛋白进一步优化

根据上述数据，作出人乳铁蛋白初始浓度与多孔淀粉载量的关系图（图1），获得人乳铁蛋白饱和吸附浓度为60mg/mL。在此条件下，多孔淀粉对人乳铁蛋白的最高包载量为227.3 mg/g。

实施例3制剂化人乳铁蛋白的消化特性研究

模拟消化缓冲液的制备

SGF（胃液）：10mL 2g/L NaCl，7mL浓HCl；

SIF（小肠液）：（需现配现用）CaCl₂溶液：取3.663g固体CaCl₂配成200mL溶液。

胃液模拟消化实验：取10mL胃液模拟消化缓冲液（SGF），加入10mg胃蛋白酶后加入消化体系中，调节pH至2.0，加入1g被消化样品（多孔淀粉包埋的人乳铁蛋白），反应1h。分别于0，10，20，30，40，60min时取样，测定其中人乳铁蛋白含量，如表3所示。

肠液模拟消化实验：调节pH到7，加入13.2mL 6mg/mL的胰酶溶液，加入20μL的淀粉糖化酶（AMG）以及1mL的CaCl₂溶液（SIF）调节pH至7，加入1g被消化样品（多孔淀粉包埋的人乳铁蛋白），反应2h，分别于0，10，30，50，80，120min取样，测定其中人乳铁蛋白含量，如表4所示。

多孔淀粉包载的人乳铁蛋白在模拟胃肠液中的释放及消化特性

由表3可以看出，在模拟胃液中，被多孔淀粉包埋的人乳铁蛋白在0-50min内基本没有释放，1个小时内释放较少。而未被包埋的人乳铁蛋白在模拟胃液中，在前10min就已释放大部分，且被水解（未列出结果）。说明多孔淀粉能保护人乳铁蛋白在胃液中不被降解。

表3 模拟胃液中人乳铁蛋白在不同时间的释放浓度

由表4和图2，在模拟肠液中，被多孔淀粉包埋的人乳铁蛋白能够被释放，并在120min内基本释放完全。在模拟胃液中，作为壁材的多孔淀粉不会被胃蛋白酶所水解，因此人乳铁蛋白能被较好的保护而不被蛋白酶所降解。到了模拟肠液里，在胰酶和糖化酶的作用下，多孔淀粉被逐步水解，人乳铁蛋白被释放出来，之后又被蛋白酶所水解。说明多孔淀粉能在肠液中完成人乳铁蛋白的有效释放。

表4模拟肠液中人乳铁蛋白在不同时间的释放浓度

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