长链非编码LINC01420的siRNA的应用及抑制制剂的制作方法

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码LINC01420的siRNA的应用及抑制制剂。

背景技术：

人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(The Encyclopedia of DNA Elements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中lncRNA序列的比例也相应地增大，提示lncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着lncRNA不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现lncRNA广泛而活跃地参与到生命活动不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿与热点。

LncRNA可作为功能蛋白质的信号(signal)、诱导(guide)、诱饵(decoy)或支架(scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的是，lncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一起。因此，深入研究lncRNA的功能，揭示由lncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。

鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在鼻咽癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近我们发现lncRNA LINC01420(NCBI accession number:NR_015367)在鼻咽癌组织中表达上调，针对该lncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的辅助诊断。我们进一步增加样本，在110例有临床随访资料的鼻咽癌石蜡存档标本中，通过原位杂交(in situ hybridization)的方法检测了LINC01420的表达水平，发现LINC01420在鼻咽癌组织中表达上调，高表达LINC01420的鼻咽癌患者比低表达LINC01420的鼻咽癌患者预后差，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后判断。

我们通过设计并合成靶向LINC01420的siRNA序列，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统证实靶向干扰LINC01420的表达可明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供长链非编码LINC01420的siRNA的应用及抑制制剂。

长链非编码LINC01420的siRNA的应用，利用长链非编码LINC01420的siRNA构建抑制鼻咽癌侵袭与转移的制剂，该长链非编码RNA LINC01420的序列如SEQ NO:1所示。

长链非编码LINC01420的siRNA序列为以下三条中的一条或几条：

siRNA-1：5'-CAUCUCAGGUCUCUUGGCUUUGCCA-3'，

siRNA-2：5'-GCGUUGGGAUUAUCCGGAAGGAACU-3'

siRNA-3：5'-CCUCUGAGAUUUAAGGCCAUGCCCU-3'。

所述的抑制鼻咽癌侵袭与转移的制剂还包括阴性对照Scramble序列：5’-GACACGCGACUUGUACCAC-3’。

本发明公开了长链非编码LINC01420的siRNA的应用及抑制制剂。通过设计并合成靶向LINC01420的siRNA序列，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统和裸鼠转移瘤体内模型中均证实靶向干扰LINC01420的表达可明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力。本发明为鼻咽癌的治疗提供了新的途径。

附图说明

图1为荧光定量PCR检测发现LINC01420在鼻咽癌中表达上调情况；

实时荧光定量PCR技术验证lncRNA LINC01420在鼻咽癌(26例)和慢性炎症鼻咽上皮组织(10例)中的表达情况，LINC01420表达显著上调(P＝0.002)。

图2为原位杂交检测LINC01420在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；

LINC01420在正常鼻咽上皮(NPE)中表达水平较低，42例正常鼻咽上皮中仅有14例(33.3％)中检测到有LINC01420的低表达，在其余28例中检测不到；而在110例鼻咽癌组织中有60例鼻咽癌(54.5％)中检测到有LINC01420的高表达，其余的50例鼻咽癌组织中检测到LINC01420的低表达；P＝0.02。LINC01420在鼻咽癌(NPC)中的表达与患者复发及远处转移密切相关，LINC01420表达高的患者更容易复发，LINC01420表达高的肿瘤远处转移的能力更强。LINC01420在鼻咽癌(NPC)中的表达与患者的性别密切相关，LINC01420表达高的患者男性偏多。

图3为鼻咽癌组织中LINC01420高表达患者预后差，更易复发和转移；

鼻咽癌中LINC01420的高表达与鼻咽癌患者的不良预后相关，即LINC01420高表达的患者总的生存时间(Over-all survival，OS)要明显低于LINC01420低表达或不表达的患者。

图4为在鼻咽癌细胞中导入LINC01420的干扰siRNA序列，可显著抑制LINC01420在鼻咽癌细胞中的表达；

在鼻咽癌细胞系5-8F中导入靶向LINC01420的siRNA混合物后，实时荧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中LINC01420的表达情况，LINC01420的表达均受到明显的抑制。阴性对照(NC)为Scramble干扰siRNA序列。

图5为在鼻咽癌细胞中导入LINC01420的siRNA抑制LINC01420表达后，细胞侵袭能力降低；

细胞穿膜(transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F中转入靶向LINC01420的siRNA，抑制LINC01420的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著减少，表明细胞侵袭能力降低。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1，实时荧光定量PCR法检测发现LINC01420在鼻咽癌中表达上调

1.材料与方法：

收集10例慢性鼻咽上皮组织和26例鼻咽癌组织，抽提总RNA，1μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。LINC01420正向引物为5'-CACTCTACCCTCCGCACC-3'，如SEQ NO:2所示，和反向引物'-AGGAAGTGAAATCGTGCTGA-3'。如SEQ NO:3所示。

用于对照的GAPDH正向引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’如SEQ NO:4所示，和反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，如SEQ NO:5所示。

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。

2.结果

LINC01420在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在鼻咽癌组织中高表达P＝0.002(图1)

实施例2，原位杂交检测发现LINC01420在鼻咽癌中的表达与患者预后相关

1.材料方法

1.1设计并合成杂交探针

为了采用原位杂交方法检测LINC01420的表达情况，我们设计了针对原位杂交检测LINC01420表达的寡核苷酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核苷酸探针各3条。

用于原位杂交检测LINC01420表达的寡核苷酸探针：

LINC01420探针1：5’-ATTTAAAGAGGGTGGGATTTGGTCAGAAACTCAC-3’如SEQ NO:6所示，

LINC01420探针2：5’-CAGGACTTGGACCTTCAACACGAAAAATTCAGAAT-3’如SEQ NO:7所示，

LINC01420探针3：5’-CACTTGAGAAAACCACTGTAGGACAAGAACAACAT-3’如SEQ NO:8所示。

阳性对照探针(检测看家基因GAPDH)：

GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，如SEQ NO:9所示，

GAPDH探针2：5'-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'，如SEQ NO:10所示，

GAPDH探针3：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'，如SEQ NO:11所示。

采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列。

1.2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂

地高辛寡核苷酸加尾试剂(Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2^nd Generation，Roche公司)，抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-POD，Fab fragments，Roche公司)，增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统(TSA^TM Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司)，DAB染色试剂盒(北京中山公司)，20x柠檬酸钠缓冲溶液(saline sodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5％Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)，醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent，Roche公司)。

1.3其他主要试剂和材料

无水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液(pH7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L)；3％甲醇-双氧水溶液(80％甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M柠檬酸溶液和41ml 0.1M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液pH值)；0.1％胰蛋白酶；苏木素；1％盐酸酒精(1ml浓盐酸+99ml 70％酒精配置)；封片胶(PTS Cure Mount Ⅱ)；专用盖玻片(480×240mm²)定制于郑州玻璃仪器厂。Leica低熔点(58℃)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/L,pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制)，苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。

1.4标记探针

利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如下。

100pmol oligonucleotide+ddH₂O＝9μl(control:control oligonucleutide 5μl+ddH₂O 4μl)

混匀，稍离心。37℃水浴反应30min，加2μl EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。

1.5寡核苷酸探针标记后纯化

为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：

1)探针反应混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCL+75μl 100％冷乙醇(-20℃).

2)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

3)13.000×g 4℃离心15min。

4)弃上清，用50μl冰冷的70％(V/V)乙醇洗涤。

5)13.000xg 4℃，离心5min。

6)弃上清，真空4℃干燥。

7)用无菌双蒸水重溶探针。

1.6原位杂交检测存档石蜡切片中LINC01420的表达

石蜡切片杂交前处理

1)4℃保存的石蜡切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蜡。

2)二甲苯依次脱蜡3×5min。

3)梯级酒精洗涤，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1×5min→50％酒精1×5min→DEPC水洗涤2×3min→DEPC-PBS洗涤2×5min。

4)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤1min，中止反应。

6)切片入0.2N HCL，于37℃反应20-30min，增加组织的通透性。

7)切片用4％多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室温。

8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25％乙酸酐Buffer Ⅰ(0.1M三乙醇胺)，室温10min。

9)1M PBS洗涤2×5min。

预杂交和杂交

预杂交：-20℃保存的预杂交液，先置于37℃孵育60min，预杂交液的用量为50μl，石蜡膜履盖切片，37℃湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括：2XSSC，10％Dextran sulphate，1X Denhardt’s solution，50mM Phosphate Buffer(PH 7.0)，50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47％Deionized formamide)。

1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2×SSC中5min。

2)杂交反应：37℃杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250μl杂交液并用石蜡膜履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据：每一探针的浓度按其与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和100pmol 30个碱基的裸探针标记反应理论探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。

3)杂交后洗涤，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2×SSC(0.5％SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5％SDS)，2×15min。

杂交后显色检测反应

1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。

2)切片转至TNT缓冲液中，3×5min。

3)滴加TNB阻断缓冲液，300μl/TMAs，室温，30min。

4)吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1％Triton X-100+1％阻断剂)，室温4小时。

5)TNT Buffer(0.1M Tris-CL，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)洗涤，3x5min。

6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramid贮存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid工作液：1×稀释液，1:50稀释Biotinyl Tyramid贮存液)，室温10分钟。

7)TNT洗，3×5min。

8)切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300μl/TMAs，室温30min。

9)TNT洗，3×5min。

10)蒸溜水洗涤，1×1min。

11)DAB显色，显微镜下控制显色反应。

12)苏木素复染，

13)酒精梯级脱水，切片干燥。

14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片1min。

1.7结果判断及标准

应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。

再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行综合评分，判断标准为：(1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。(2)依据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数≤25％，记1分；c.25％＜阳性细胞数＜50％，记2分；d.阳性表达细胞数≥50％，记3分。

为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分(-)，认为阴性表达；②1分和2分者最终计为1分(+)，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分(++)，认为中等阳性表达；④6分到9分者最终计为3分(+++)，认为强阳性表达。

1.8分析和统计软件

应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用χ²test或Fisher exact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差异有统计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test；多变量分析采用Cox’s proportional hazards model；P＜0.05即差异有统计学意义。

2结果

2.1LINC01420在鼻咽癌中的表达比正常对照组织中的表达显著升高

LINC01420在54.5％的鼻咽癌组织中(60/110例)高表达，而仅在33.3％(42例慢性炎症上皮组织样本中的14例)的正常鼻咽上皮组织中有表达(图2A)，两者之间具有明显的统计学差异(P＝0.02，图2B)。LINC01420在鼻咽癌(NPC)中的表达与患者复发及远处转移密切相关，LINC01420表达高的患者更容易复发，LINC01420远处转移的能力更强(图2C)。LINC01420在鼻咽癌(NPC)中的表达与患者的性别密切相关，LINC01420表达高的患者男性偏多(图2D)。

2.2LINC01420高表达的鼻咽癌患者预后较差

我们对110例鼻咽癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对鼻咽癌组织中LINC01420的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现LINC01420高表达患者总的生存时间明显短于LINC01420低表达或不表达的患者(图3)。说明LINC01420是一个与鼻咽癌预后相关的分子标记，该lncRNA表达高，病人预后差。

实施例3，siRNA干扰LINC01420的表达

1.材料方法

1.1试剂及试剂盒

TRIZOL^TM Reagent(Invitrogen)；

逆转录试剂盒(#A3500，Promega)；

抗生素G418(Ameresc)。

1.2shRNA的设计

首先将LINC01420序列输入Invitrogen公司的Block-It RNAi designer软件，寻找该lncRNA的siRNA最佳靶点，挑选最佳的3条相应的靶点序列如下：

siRNA-1：5'-CAUCUCAGGUCUCUUGGCUUUGCCA-3'如SEQ NO:12所示，

siRNA-2：5'-GCGUUGGGAUUAUCCGGAAGGAACU-3'如SEQ NO:13所示，

siRNA-3：5'-CCUCUGAGAUUUAAGGCCAUGCCCU-3'如SEQ NO:14所示，

阴性对照Scramble序列：5’-GACACGCGACUUGUACCAC-3’如SEQ NO:15所示。

1.3细胞培养与转染

鼻咽癌细胞系5-8F购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。

将生长状态良好的鼻咽癌细胞系5-8F按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始siRNA的转染；转染过程如下：

在无菌EP管中加入3μl的Hipefect于100μl无血清培养基中混匀静置5min；

将三条siRNA混合加入100μl无血清培养基中；然后与上述包含Hipefect的100μl无血清培养基温和混匀，室温静置30分钟，使siRNA与脂质体形成复合体；

用D-Hank's液洗涤细胞3次；

将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；

将6孔板置于CO₂培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养48小时。

1.5实时定量PCR检测siRNA干扰lncRNA表达的效果：

将siRNA转染后的鼻咽癌细胞抽提总RNA，2μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。LINC01420引物为：5'-CACTCTACCCTCCGCACC-3'，反向引物：5'-AGGAAGTGAAATCGTGCTGA-3'。

用于对照的GAPDH引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。

2.结果

siRNA转染鼻咽癌细胞5-8F后，可显著下调鼻咽癌细胞中LINC01420的表达水平(图4)。

实施例4，LINC01420siRNA抑制鼻咽癌细胞中LINC01420的表达和鼻咽癌的侵袭转移

1.材料方法

1.1细胞培养与转染

将生长状态良好的鼻咽癌细胞5-8F按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始LINC01420siRNA转染。

1.2细胞穿膜实验

细胞穿膜((Transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小室(孔径8μm)及基质胶(Matrigel)购自美国BD公司，4％多聚甲醛固定液、结晶紫染液(0.1％g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按BD公司说明书进行基质胶膜水化。

在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和1×10⁵个转染了LINC01420siRNA和阴性对照的鼻咽癌细胞，在Transwell小室下层加入含20％胎牛血清的培养基。细胞继续培养36小时后，用4％多聚甲醛固定液固定，结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞。

2.结果

2.1在鼻咽癌细胞中导入LINC01420siRNA抑制LINC01420后，细胞侵袭能力降低

细胞穿膜(Transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F中转入靶向LINC01420siRNA，抑制LINC01420的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著减少，表明细胞侵袭能力降低(图5)。