一种甜叶菊酚类提取物及其在降血脂制品中的应用的制作方法

本发明属植物提取物
技术领域：
，涉及一种甜叶菊酚类提取物及其在降血脂制品中的应用。
背景技术：
：甜叶菊（Steviarebaudiana）属菊科多年生草本植物，原产于南美巴拉圭和巴西，是目前已知甜度较高的糖料植物之一，已成为继蔗糖、甜菜糖之后的第三种天然糖源。目前，中国是世界最大的甜菊糖苷生产及供应国，占全球总量的80%以上。甜叶菊中除甜菊糖苷外还含有黄酮、绿原酸等多种成分，且这些成分具有重要的生物活性，如抗菌、降血压、降血脂等，在其发源地作为甜茶、药茶饮用已有一百多年的历史。甜菊糖苷生产现多采用热水浸提，提取液经絮凝、树脂纯化和干燥制得。甜叶菊酚类物质在甜菊糖苷生产过程中作为杂质存在，需在后续工艺中将其去除，不仅造成资源的浪费，还对环境造成了极大的污染。本专利中，申请人对甜叶菊黄酮和绿原酸等甜叶菊酚类提取物的降血脂活性进行了考察，发现其可显著改善脂质代谢紊乱的效果，减少小鼠肝脏脂肪沉积，减轻和预防脂肪肝形成的功能，为其在制备降血脂制品中的应用提供科学依据，亦为甜叶菊综合应用开发奠定了基础。技术实现要素：为提高甜叶菊综合利用价值，本发明提供了一种甜叶菊酚类提取物，本发明另一个目的在于提供甜叶菊酚类提取物的降血脂活性及其在制备降血脂制品中的应用。为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：一种甜叶菊酚类提取物，所述提取物是以黄酮和绿原酸为主要成分的多酚类化合物。本发明所述甜叶菊酚类提取物中包括黄酮含量为5.0-85.0wt%，绿原酸含量为10.0-90.0wt%。本发明所述甜叶菊酚类提取物中黄酮成分为槲皮素、槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-[4'''-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]、芹菜素、芹菜素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷中的任意一种或几种，苷元为槲皮素、山奈酚、芹菜素和木犀草素中的任意一种或几种。本发明该甜叶菊酚类提取物中绿原酸成分为咖啡酸、3-咖啡酰基奎尼酸、4-咖啡酰基奎尼酸、5-咖啡酰基奎尼酸、3,4-二咖啡酰基奎尼酸、3,5-二咖啡酰基奎尼酸、4,5-二咖啡酰基奎尼酸、5-阿魏酰基奎尼酸中的任意一种或几种。本发明所述甜叶菊酚类提取物制备方法如下：（1）取甜菊叶原料，加水提取，提取液过陶瓷膜；提取用水量为原料的10-30倍，提取温度为15-85℃，传统间歇提取三次或采用三级连续逆流提取，陶瓷膜选用膜管为5-100nm膜管；（2）陶瓷膜透过液上大孔吸附树脂1吸附，碱洗，乙醇解析，解析液浓缩回收乙醇后分别过脱盐、脱色、精脱树脂，干燥得甜菊糖苷产品；选用的吸附树脂为P20、ADS-4、69M、T28、DM30、001×6、001×8、201-H、SQ338、330中的任意一种或几种；碱洗液为NaOH、KOH、氨水中的一种或任意组合，质量浓度为0.2-2%的或pH8.5-9.5，碱洗液用量为1-3BV，速度为1-3BV/h；（3）下注水和调酸后碱洗液混合，上吸附树脂2，水洗，乙醇水溶液解析，浓缩回收溶剂，干燥得甜叶菊酚类提取物；所用吸附树脂2为LX-200B、LX-2007、SD-300、LSA-21、HZ841中的一种或任意组合；下注水和调酸后碱洗液上柱流速1-3BV/h，调酸用盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、柠檬酸中的一种或几种，酸性溶液为摩尔浓度为0.1-18mol/L，调pH至0.5-6.5；水洗用量1-3BV，水洗流速1-3BV/h，解析用乙醇浓度为10-85%，用量为1-5BV，洗脱流速为1-3BV/h；浓缩采用薄膜浓缩、减压浓缩中的一种或组合；干燥采用喷雾干燥、脱味锅真空干燥、回转罐真空干燥、烘箱干燥中的一种或组合。本发明的另一目的在于提供上述的甜叶菊酚类提取物在制备降血脂的药物或食品中的应用。本发明所述的一种甜叶菊酚类提取物在制备改善脂质代谢紊乱的药物或食品中的应用。本发明所述的一种甜叶菊酚类提取物在制备减轻和预防脂肪肝形成的药物或食品中的应用。本发明所述药物或食品是以甜叶菊酚类提取物为活性成分制备而成的口服剂、注射剂或外用制剂。本发明的设计思路是：本发明从甜叶菊中提取得到的甜叶菊酚类提取物在制备降血脂制品中的应用，该甜叶菊酚类提取物包括黄酮含量为5.0-85.0wt%，绿原酸含量为10.0-90.0wt%。本发明证实，该甜叶菊酚类提取物能够显著降低小鼠血液中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量，改善脂质代谢紊乱，并可显著减少小鼠干燥脂肪沉积，减轻和预防脂肪肝的形成，具有良好的降血脂功效。本发明甜叶菊酚类提取物中黄酮和绿原酸的检测方法参考专利201510339325.7中提供的黄酮和绿原酸的检测方法。采用上述技术方案所产生的有益效果是：本发明提供的甜叶菊酚类提取物具有原料来源丰富、易于产业化、无毒副作用等优点，作为降血脂制品开发前景广阔。附图说明图1为实施例2中NC组小鼠肝组织油红"O"染色片；图2为实施例2中MC组小鼠肝组织油红"O"染色片；图3为实施例2中甜叶菊多酚提取物高剂量组小鼠肝组织油红"O"染色片。注：NC，正常对照组；MC，模型对照组。具体实施方式实施例1本实施例采用高脂饮食建立小鼠高血脂模型。经甜叶菊分类提取物饲喂小鼠10周后，小鼠血脂指的影响。实验方案1）常规饲料成分碳水化合物：59%，蛋白质：21.1%，纤维：4.9%，脂肪：4.2%，灰分：8%，磷：1%，钙：1.8%。）高脂饲料成分碳水化合物48%，蛋白质21.1%，脂肪4.2%，纤维4.7%，灰分8%，磷1%，钙1.8%，猪油10%，胆酸盐0.2%，胆固醇1%。）动物分组及造模方法先将ICR小鼠饲养一周，喂饲正常饲料，自由采水、采食。1周后按体重随机分成7组，即正常对照组，模型对照组，阳性对照组，甜叶菊多酚提取物低、高剂量组，茶多酚组、银杏黄酮组。除正常对照组喂饲普通饲料外，其余各组均喂饲高脂饲料，各组动物自由采水、采食。试验周期为10周。低、高剂量的灌胃量依次为：5g/kgb.w.和20g/kgb.w.，茶多酚和银杏黄酮的灌胃剂量为：20g/kgb.w.。）降脂试验动物实验开始后，按上述说明的剂量进行灌胃，正常对照组和模型对照组采用蒸馏水进行灌胃。连续10周，试验期间随体重调整给药量。第5，10周，各组小鼠禁食不禁水12h，测定血清中血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、直接低密度脂蛋白（LDL-C）和直接高密度脂蛋白（HDL-C）含量；在实验结束时，动物给药后禁食12-14h，不限饮水，摘眼球采血，解剖小鼠，取其肝、脾、肾，称其重量后，其中一部分肝进行组织切片观察5）血清血脂的测定小鼠禁食（不禁水）12h，于眼球后静脉丛采血，于3500rpm离心20min，分离血清，TG、TC、LDL-C和HDL-C含量。以上指标采用日本东芝医疗系统株式会社TBA-40全自动生化分析仪测定，具体操作按试剂盒说明进行。）甜叶菊酚类提取物的制备称取100kg甜菊叶，加1.5m3水，65℃提取，重复提取三次，合并提取液，过5nm陶瓷膜。透过液上201-H吸附树脂，1BV水洗，水洗流速1BV/h，1.5BV0.4%NaOH水溶液洗，流速1BV/h，乙醇解析，解析液浓缩回收乙醇后分别过脱盐、脱色、精脱树脂，干燥得甜菊糖苷产品。碱洗液用1mol/L的盐酸水溶液调pH至3.5，和下注水混合，上吸附树脂SD-300，上柱流速1.5BV/h。2BV水洗，水洗流速1.5BV/h。2BV50%乙醇水溶液解析，解析流速1BV/h。减压浓缩，回收乙醇溶剂，脱味锅真空干燥得甜叶菊多酚提取物2.0kg。检测甜叶菊酚类提取物总黄酮和总绿原酸含量分别为20%和75%，黄酮类成分为槲皮素、槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷、芹菜素、芹菜素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷；绿原酸成分为咖啡酸、3-咖啡酰基奎尼酸、4-咖啡酰基奎尼酸、5-咖啡酰基奎尼酸、3,4-二咖啡酰基奎尼酸、3,5-二咖啡酰基奎尼酸、4,5-二咖啡酰基奎尼酸、5-阿魏酰基奎尼酸。）统计分析每个实验至少重复3次，其中细胞实验重复6次，结果用平均值±SD表示。数据统计用SPSS13.0统计软件进行处理，P<0.05具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异。）实验结果采用高脂饮食建立小鼠高血脂模型。经甜叶菊多酚提取物饲喂小鼠10周后，小鼠血脂指标见表1。模型对照组饮食诱导10周后，小鼠血清LDL-C、TC、TG水平高于正常对照组且有极显著差异。甜叶菊多酚提取物各剂量、茶多酚高剂量、银杏黄酮高剂量均能够显著降低模型组小鼠血液中的LDL-C、TC和TG含量，小鼠血清血脂四项指标与模型对照组比较具有显著差异。这说明甜叶菊多酚提取物、茶多酚、银杏黄酮均具有改善脂质代谢紊乱的效果。其中，甜叶菊多酚提取物的降血脂效果最为显著，与模型组相比，LDL-C、TC和TG含量分别降低了37.0%、27.8%、23.2%。甜叶菊多酚提取物的降血脂效果明显优于茶多酚，并与银杏黄酮相当。表1.干预10周后小鼠的血脂谱LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）NC0.39±0.05**3.57±0.47**3.78±0.53**1.08±0.12*MC0.73±0.125.27±0.365.82±0.311.38±0.25甜叶菊多酚提取物H0.46±0.04**3.86±0.34**4.20±0.39**1.06±0.19**甜叶菊多酚提取物L0.55±0.07**4.60±0.37**4.95±0.36**1.08±0.21**茶多酚H0.44±0.06**3.84±0.47**4.00±0.49**1.00±0.26**银杏黄酮H0.46±0.06**4.37±0.55**4.65±0.56**0.94±0.16**注：NC，正常对照组；MC，模型对照组；H，高剂量；L，低剂量。与MC比较，*P<0.05，**P<0.01。实施例2本实施例提供了甜叶菊酚类提取物对高血脂小鼠肝组织病理形态学的影响。实验方案小鼠的饲喂及造模方法同实施例1。1）小鼠肝脏组织学观察小鼠杀死后取其右肝前页于10%中性福尔马林溶液中固定，冷冻液包埋，冷冻切片，油红“O”染色，光学显微镜下观察组织形态变化，以确定脂肪在肝组织中堆积程度。2）甜叶菊酚类提取物的制备称取100kg甜菊叶，加3.0m3水，60℃三级连续逆流提取，提取液过50nm陶瓷膜。透过液上T28吸附树脂，1.5BV水洗，水洗流速1BV/h，1.5BVpH=9.0的氨水溶液洗，流速1BV/h，乙醇解析，解析液浓缩回收乙醇后分别过脱盐、脱色、精脱树脂，干燥得甜菊糖苷产品。碱洗液用18mol/L的硫酸溶液调pH至5.0，和下注水混合，上吸附树脂HZ841，上柱流速1.0BV/h。3BV水洗，水洗流速2.0BV/h。2BV65%乙醇水溶液解析，解析流速1.5BV/h。减压浓缩，回收乙醇溶剂，喷雾干燥得甜叶菊多酚提取物3.0kg。检测甜叶菊酚类提取物总黄酮和总绿原酸含量分别为15%和60%，黄酮类成分为槲皮素、槲皮苷、芹菜素、芹菜素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷；绿原酸成分为咖啡酸、3-咖啡酰基奎尼酸、4-咖啡酰基奎尼酸、5-咖啡酰基奎尼酸、3,4-二咖啡酰基奎尼酸、3,5-二咖啡酰基奎尼酸、4,5-二咖啡酰基奎尼酸、5-阿魏酰基奎尼酸。3）统计分析每个实验至少重复3次，其中细胞实验重复6次，结果用平均值±SD表示。数据统计用SPSS13.0统计软件进行处理，P<0.05具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异。4）实验结果经过10周试验，制备小鼠肝脏切片进行油红O染色，观察肝组织脂肪沉积情况（图1）。正常对照组肝细胞内仅可见个别大小不一的脂肪空泡，呈阴性。模型对照组小鼠肝细胞内可见弥漫性小的红染脂肪空泡，说明在肝组织中脂肪沉积程度严重，重度脂肪肝。甜叶菊多酚提取物高剂量组小鼠肝细胞红染脂肪空泡明显减少，轻度脂肪肝。该研究结果表明甜叶菊多酚提取物具有显著减少小鼠肝脏脂肪沉积，减轻和预防脂肪肝形成的功能。当前第1页1 2 3