一种显著提高丹参毛状根生物量和活性成分产量的方法及其用途与流程

本发明属于生物技术和医药技术领域，具体涉及一种显著提高丹参毛状根生物量和活性成分产量的方法，及其在生物医药领域的用途。

背景技术：

丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的作用，中医临床上广泛用于胸壁心痛、腕腹胁痛、月经不调、痛经经闭等症。其活性成分主要为水溶性的丹酚酸类化合物和脂溶性的丹参酮类化合物。前者主要包括丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C等，其中以丹酚酸B 为主要成分；后者主要包括二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA)等，其中以丹参酮ⅡA含量最高。目前以脂溶性丹参酮ⅡA为主要成分的制剂如冠心丹参滴丸、复方丹参片，和以水溶性丹酚酸B为主要成分的制剂如复方丹参滴丸、丹参注射液、丹参冻干粉、丹参酚酸盐等也已在临床上广泛应用。

应对目前丹参药材市场需求量大，而野生资源日益匮乏，栽培品种品质退化严重、药材质量差别大、生长周期长等种种困境，生物工程技术或植物组织培养技术为丹参活性成分的生产提供了一种潜力巨大的替代生产体系，其中利用发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 诱导丹参无菌苗获得转化毛状根的技术使工业化生产丹参药用有效活性成分成为可能。毛状根培养体系具有遗传稳定、生长速度快、产量高、生产条件简便易行等优势，较之植物细胞培养及其它生物技术更适合工业规模的生产。迄今为止，丹参毛状根的培养均采用葡萄糖、果糖和蔗糖为碳源进行培养，未见采用半乳糖或由其组成的系列寡糖如棉子糖、水苏糖为碳源进行培养的研究先例。

本发明基于申请者先前发现丹参药材中含有大量水苏糖的事实，得到水苏糖或其降解产物棉子糖、半乳糖应为丹参植物最适宜的代谢和存储碳源的推论，于是将常用Gamborg B5液体培养基中的碳源替换成半乳糖和棉籽糖，悬浮培养丹参毛状根，从而显著提高了丹参毛状根的生物量和活性成分的产量，为丹参毛状根的工业化生产和应用提供了新的高效途径。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种显著提高丹参毛状根生物量和活性成分产量的培养方法。

本发明的另一个目的，在于提供利用丹参毛状根生产药用活性成分，在丹参提取物、总酚酸提取物和总酮提取物，丹酚酸B、迷迭香酸、丹参酮IIa、丹参酮I等单体化合物，以及这些提取物或单体化合物在药物制剂方面的应用等。

本发明提供的显著提高丹参毛状根生物量和活性成分产量的培养方法，是采用半乳糖或棉子糖、水苏糖作为碳源，配制Gamborg B5液体培养液，用以培养丹参毛状根。该方法能显著提高毛状根生物量，以及根中丹酚酸B、迷迭香酸、总酚酸，和丹参酮I、总丹参酮的含量量。该方法操作简便、生长迅速，成本低廉，为利用丹参毛状根生产丹参活性成分提供了一个稳定、高效的方法。

本发明的具体操作步骤如下：

（1）丹参毛状根的诱导：应用发根农杆菌C58C1侵染丹参无菌外植体形成毛状根；待毛状根长到2厘米左右（一般为1.0 -5.0厘米）时切下，除菌后在6,7-V固体培养基上培养，经筛选获得丹参毛状根种株Sm031103；

（2）丹参毛状根的继代培养：将毛状根Sm031103在6,7-V固体培养基上，15-35℃（优选22℃）黑暗静置培养，3-4周后继代一次，保存种株；

（3）丹参毛状根的液体悬浮培养：挑取鲜嫩粗壮的毛状根种株，稀释1-1.5倍的Gamborg B5液体培养基，15-35℃（优选22℃），100-500 rpm（优选120rpm）黑暗水平振荡培养10-30天（优选14天）；取出毛状根，用纯净水洗净，即得。

其中，Gamborg B5液体培养基的配制：以半乳糖或棉籽糖、水苏糖替换原常用配方中的蔗糖、葡萄糖即可。半乳糖或棉籽糖、水苏糖的浓度为0.3 ~ 30.0克/100 毫升，其中优选为3 克/100 毫升。

本发明中，所述丹参毛状根，是用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)诱导唇形科鼠尾草属植物丹参（Salvia miltiorrhizaBge.）的无菌幼根或幼苗形成的毛状根。

本发明中，所述6,7-V固体培养基组成为(每升含)：(1) 大量元素((NH₄)₂SO₄ 100 mg; KNO₃ 800 mg; Na₂HPO₄•12H₂O 20 mg; MgSO₄•7H₂O 250 mg; CaCl₂•2H₂O 200 mg; NaH₂PO₄ 150 mg; KCl 200 mg)；(2)微量元素(NaMoO₄•2H₂O 0.25 mg; CoCl₂•6H₂O 0.25 mg; KI 0.05 mg; MnSO₄•4H₂O 4.0 mg; ZnSO₄•7H₂O 1.5 mg; H₃BO₃ 5.0 mg)；(3) Fe盐((EDTA)₂FeNa•3H₂O 21.1 mg)；(4) 有机成分(VB₁ 0.5 mg; VB₆ 0.5 mg; 烟酸 1.5 mg; 肌醇 100 mg)。所述Gamborg B5液体培养基组成为(每升含)：(1) 大量元素((NH₄)₂SO₄ 134 mg; KNO₃ 2500 mg; NaH₂PO₄•H₂O 150 mg; MgSO₄•7H₂O 250 mg; CaCl₂•2H₂O 150 mg)；(2) 微量元素(NaMoO₄•2H₂O 0.25 mg; CoCl₂•6H₂O 0.025 mg; KI 0.75 mg; MnSO₄•4H₂O 10 mg; ZnSO₄•7H₂O 2.0 mg; H₃BO₃ 3.0 mg)；(3) Fe盐(CuSO₄•5H₂O 0.025 mg; Na₂•EDTA 37.3 mg; FeSO₄•7H₂O 27.8 mg)；(4) 有机成分(VB₁10 mg; VB₆ 1.0 mg; 烟酸 1.0 mg; 肌醇 100 mg)。

上述培养基用浓度为1 mol/L的NaOH和HCl调节pH值至5.6-5.8后，加入3%半乳糖或棉子糖（固体培养基中还需加入7.5 g/L琼脂粉），121℃高压灭菌备用。

本发明中，丹参毛状根的主要活性成分与中药丹参基本一致，主要包括丹酚酸B、迷迭香酸等丹酚酸类成分，和丹参酮I、丹参酮IIa等丹参酮类成分。

本发明还包括，得到的丹参毛状根活性成分，用于制备丹参提取物、丹酚酸类提取物、丹参酮类提取物或各单体化合物，以及丹参制剂。

本发明还提供丹参总酚酸提取物的制备方法，其步骤为：将采用半乳糖或棉子糖为碳源培养的丹参毛状根，滤干培养液后，冻干后粉碎，用于提取。所述提取的方法为：将经过处理的丹参用体积浓度为30-90%(与水体积比)溶剂（如丙酮、乙醇或甲醇）提取2-3次，合并提取液，回收溶剂，过滤，滤液用 D101 大孔吸附树脂吸附，再用体积浓度为的 20-50%(与水体积比)乙醇或甲醇洗脱，收集 20-50%乙醇或甲醇洗脱液，再经浓缩、冻干，即得到高含量、高产量丹参总酚酸提取物。提取物中丹酚酸B的质量含量≥80%。

本发明还提供总丹参酮提取物的制备方法，其步骤为：将采用半乳糖或棉子糖为碳源培养的丹参毛状根，滤干培养液后，冻干后粉碎，用于提取。所述提取的方法为：用5-10倍样品量(重量比)的丙酮回流提取2-3次，每次各0.5-2.0小时（优选1.0小时），合并提取液，回收丙酮，浓缩液加2-10倍量（优选5倍量）去离子水稀释，抽滤澄清，滤液用 D101 大孔吸附树脂吸附，先用体积浓度为的 20-50%(与水体积比)乙醇或甲醇洗脱，收集 20-50%乙醇或甲醇洗脱液弃去，柱床再用体积浓度为40-95% (与水体积比)乙醇或甲醇洗脱，收集 40-95% 乙醇或甲醇洗脱部分，浓缩、冻干，即得丹参总酮提取物。提取物中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA 四种丹参酮的含量总和不低于75%。

上述获得的丹酚酸类提取物和丹参酮类提取物，可直接用于制备丹酚酸类和丹参酮类制剂，或可进一步用于生产丹酚酸B、迷迭香酸、丹参酮IIa和丹参酮I等单体化合物，可用作药物制剂原料或中间体。

附图说明

图1为不同碳源培养丹参毛状根生物量比较图。

图2为丹参毛状根中活性成分含量测定高效液相色谱图。其中，1- 9成分分别为丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A和丹酚酸C）。

图3为不同碳源培养丹参毛状根中主要活性成分含量对比图。其中，A：丹酚酸类；B：丹参酮类。

具体实施方式

以下以具体实施实例更具体地说明本发明内容：

实施例1.半乳糖培养丹参毛状根高效生产丹酚酸类成分的方法

实验材料：

丹参毛状根通过发根农杆菌诱导丹参种子培育而成。实验用丹参毛状根株系培养于新鲜的6,7-V固体培养基上，22℃静置培养，每隔3-4周继代一次，备用。

实验试剂：MS培养基(DuchefaBiochemie公司,产品编号：. M0222)；Gamborg’s B5培养基(DuchefaBiochemie公式,产品编号：G0210)。乙腈为色谱纯（上海百灵威化学技术有限公司）；甲醇为分析纯（上海凌峰化学试剂有限公司）；三氟乙酸（国药集团化学试剂有限公司）；水为去离子水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

方法和步骤：

（1）丹参毛状根的诱导：应用发根农杆菌C58C1侵染丹参无菌外植体形成毛状根。待毛状根长到2厘米左右切下，除菌后在6,7-V固体培养基上培养，经筛选获得丹参毛状根种株Sm031103。

（2）丹参毛状根的继代培养：将毛状根Sm031103在6,7-V固体培养基上，22℃黑暗静置培养，3-4周后继代一次，保存种株。

（3）丹参毛状根的液体悬浮培养：挑取鲜嫩粗壮的毛状根种株，稀释一倍的Gamborg B5液体培养基，22℃， 120rpm黑暗水平振荡培养14天。取出毛状根，用纯净水洗净，即得。

（4）Gamborg B5液体培养基的配制：以半乳糖或棉籽糖、水苏糖替换原常用配方中的蔗糖、葡萄糖即可。半乳糖或棉籽糖、水苏糖的浓度为0.3 ~ 30.0g/100 ml，其中优选为3 g/100 ml。

（5）以50 mL 1/2 Gamborg’s B5液体培养基添加3%葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖作为参照。22℃黑暗，120 rpm 震荡培养14天。

（6）样品处理：将毛状根从液体培养基中取出，用蒸馏水冲洗2~ 3次，去除残留培养基，然后用滤纸吸干水分后冻干。

（7）成分提取：冻干样品用研钵研磨成细粉，称取粉末0.1 g置于4 ml EP管中，超声提取2次，每次加入2.5 ml 70%甲醇，超声提取20 min，5000rpm离心10 min，合并上清液至5 ml容量瓶中，用70 %甲醇定容至刻度。提取液用0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。

（8）含量测定：采用高效液相色谱（HPLC）法。色谱条件：Agilent 1100系列高效液相色谱仪，配制G1314A DAD检测器、G1322A在线脱气机，7725i手动进样阀，5μL定量环，Chemstation (Rev.A.07.01)色谱工作站；色谱柱：Kinetex柱（100 mm×4.6 mm, 2.6 μm）；流动相A为0.1%三氟乙酸水，B为色谱纯乙腈，梯度洗脱0 -10 min，7% B - 22 % B；10 - 20 min，22% B - 33 % B；流速为1.0 mL/min^-1，检测波长为280 nm，进样量5 μL。

（9）实验结果：

培养液中各种碳源对丹参毛状根生物量的影响，见附图1。结果表明，相对于参照组葡萄糖，果糖、蔗糖等常用碳源对毛状根生物量无明显影响；当用半乳糖和棉籽糖为碳源时，丹参毛状根生物量有极显著增加，增加幅度 30%以上。

毛状根中成分分析高效液相色谱图如附图2，结果表明毛状根中可以检测到9种成分，并均得到有效分离。

毛状根中主要丹酚酸类的含量测定结果见附图3（A）。实验结果表明：半乳糖培养毛状根中丹酚酸B（SaB）为70.61±6.24毫克/克 (干重) ，比葡萄糖、果糖和蔗糖（含量分别为19.20±5.18、36.07±5.14和39.43±3.73毫克/克）培养的毛状根，增加了268.76%、95.76%和79.08%。迷迭香酸（RA）的含量为384.45±41.84毫克/克 (干重)，比葡萄糖、果糖和蔗糖（含量分别为197.19±56.7、234.02±98.9和248.89±91.94毫克/克）培养毛状根，分别增加了94.96%、64.28%和54.46%。总酚酸（TSA，9种酚酸含量之和）为458.99±48.41毫克/克 (干重)，比葡萄糖、果糖和蔗糖（含量分别为218.60±62.16、273.81±10.45和291.58±9.61毫克/克）培养毛状根，增加了一倍左右。

毛状根中主要丹参酮类的含量测定结果见附图3（B）。半乳糖和棉籽糖培养对毛状根中丹参酮I（TNI）的含量均有显著的促进作用，在葡萄糖组中该成分的含量仅为 0.01±0.00 毫克/克，而在半乳糖和棉籽糖中分别为0.18±0.06和0.33±0.08毫克/克，含量增加达到极显著水平（p<0.01）。总丹参酮（TNN）含量增长50%以上。

实施例 2.利用丹参毛状根生产丹参总酚酸提取物的制备方法

材料与方法：将丹参毛状根种株约2 克，接种于500 mL含半乳糖的Gamborg’s B5液体培养液中，22℃，黑暗条件下，120 rpm 震荡培养14天。同法同时培养10瓶。滤去培养液，用纯净水洗涤2~3次，合并，冻干，得580克干燥丹参毛状根。

将丹参毛状根粉碎，用 70% 乙醇6.0Kg提取二次，过滤，合并提取液，回收乙醇。浓缩的水提取液加 3倍原体积的去离子水进行稀释，过滤，澄清滤液通过内装1.0Kg D101大孔吸附树脂的树脂柱进行吸附。待全部吸附完成后，采用4倍柱床体积的去离子水冲洗一次，然后再用4倍柱体积30% 的乙醇进行洗脱。合并30%乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，冻干，即的丹参总酚酸提取物。

实验结果：获得丹参总酚酸提取物 70克, 折合成毛状根干重得率为12.0%。HPLC法测得提取物中丹酚酸B（SaB）含量为32%，迷迭香酸（RA）的含量为58%。并含量少量紫草酸、丹参素等。

实施例3.利用丹参毛状根生产丹参酮提取物的制备方法

材料与方法：将丹参毛状根种株约2 克，接种于500 mL含半乳糖的Gamborg’s B5液体培养液中，22℃，黑暗条件下，120 rpm 震荡培养14天。同法同时培养10瓶。滤去培养液，用纯净水洗涤2~3次，合并，冻干，得580克干燥丹参毛状根。

将丹参毛状根粉碎，用 70% 乙醇6.0Kg提取二次，过滤，合并提取液，回收乙醇。浓缩的水提取液加 3倍原体积的去离子水进行稀释，过滤，澄清滤液通过内装1.0Kg D101大孔吸附树脂的树脂柱进行吸附。待全部吸附完成后，采用4倍柱床体积的去离子水冲洗一次，然后再用4倍柱体积30% 的乙醇进行洗脱。然后再用4倍柱体积30% 的乙醇进行洗脱。合并30%乙醇洗脱液得丹酚酸部分。最后再采用4倍柱体积70%乙醇进行洗脱，合并 70% 乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，冻干，即得丹参总酮提取物。

实验结果：获得丹参总酮提取物 6.9克, 得率为1.2%。HPLC法测得提取物中丹参酮I（TNI） 含量为38.2%；隐丹参酮含量为2.8%；二氢丹参酮I含量为12%。