碳纳米材料SWCNT及其衍生物用于抑制肿瘤干细胞及制备治疗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种无机纳米材料用于肿瘤治疗，特别涉及一种SWCNT及其衍生物在破坏肿瘤微环境、抑制TGFβ信号通路、抑制肿瘤干细胞、降低肿瘤血管密度与肿瘤细胞增殖能力、增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性以及肿瘤治疗中的应用。

背景技术：

肿瘤干细胞(CSC)是肿瘤组织内一群具有干细胞样特征的肿瘤细胞，在肿瘤的发生、发展以及恶性转移中发挥着至关重要的作用。CSC对化疗药物具有高度的耐受性，能够躲避化疗药物的杀伤。目前，临床上常规的肿瘤治疗方法化疗，只能清除普通的肿瘤细胞，却不能有效杀伤肿瘤中的CSC，这是导致肿瘤复发和治疗失败的关键原因。因此，迫切需要设计新的治疗策略来特异性靶向并清除CSC，进而达到最终理想的治疗效果。与传统的化疗药物相比，纳米材料独特的理化性质使其具有更好的生物相容性、溶解性、靶向性、穿过血脑屏障和细胞膜的能力、更强的可塑性以及光热性能等，在靶向与杀伤CSC中具有很好的应用前景。

现今，纳米材料常被用于药物载体来靶向治疗CSC，比如靶向CSC标志物(CD44、CD90、CD133等)或者靶向与CSC性能相关的信号通路(TGFβ、Wnt/β-catenin、Notch等)来抑制CSC的自我更新和多向分化。然而，在肿瘤的发展过程中，CSC群体数量并不是一成不变的，在特定肿瘤微环境的影响下，普通的肿瘤细胞能逐渐获得干性去分化成CSC，进而加速肿瘤的恶性进展，使更多的肿瘤细胞获得化疗耐受性，从而逃脱传统化疗对其的杀伤。因此，破坏肿瘤细胞的微环境、抑制普通肿瘤细胞获得干性可能成为更有效的治疗肿瘤的方法。目前，国内外已有实验室开展相关研究，比如Gd@C82(OH)22纳米材料能抑制上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)，从而抑制乳腺上皮癌细胞获得CSC特征，有效减少CSC数量并抑制肿瘤生长。

研究发现，在多种肿瘤中TGFβ1表达水平异常高，TGFβ1信号通路对肿瘤微环境的形成和肿瘤的发生发展至关重要。已有大量研究表明，TGFβ1是一种强有力的EMT诱发剂，能够促使上皮来源的肿瘤细胞获得CSC特性，并与肿瘤细胞的恶性转变密切相关。骨肉瘤来源于间充质干细胞或骨祖细胞，是一种恶性程度很高的原发性骨肿瘤。在骨肉瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞不断侵犯周围的骨基质，同时将骨基质中大量的TGFβ1释放出来，逐步形成骨肉瘤的微环境。最近的研究发现，TGFβ1也能诱导骨肉瘤细胞去分化、使普通的骨肉瘤细胞转变成骨肉瘤干细胞，即CSC细胞，从而加速骨肉瘤的恶性进展。骨肉瘤患者极易发生肺转移，转移后的患者预后极差且存活率低。目前，临床上尚没有靶向药物抑制骨肉瘤的恶性进展。因此，TGFβ1可作为治疗靶点用于骨肉瘤微环境的调控和骨肉瘤干细胞的靶向治疗。

单壁碳纳米管(SWCNT)在生物医药领域有着很好的应用前景，比如疾病的诊断与治疗、生物传感器等。在肿瘤治疗中，SWCNT被广泛用作药物载体，用于靶向和药物输送，然而其本身对癌细胞的影响以及在癌症发展中的作用还不是很清楚。在本发明中，我们以骨肉瘤为例说明SWCNT及其衍生物能在体外特异性抑制普通肿瘤细胞去分化形成CSC，减少肿瘤组织中CSC的数量和肿瘤微血管密度，进而抑制肿瘤的生长。同时SWCNT及其衍生物能显著抑制TGFβ1信号通路，进而破坏肿瘤微环境，从而达到抑制CSC的形成和治疗肿瘤的目的。目前，国内外还没有其他关于SWCNT及其衍生物本身能特异性靶向抑制CSC和TGFβ1信号通路的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种碳纳米材料SWCNT及其衍生物用于抑制肿瘤干细胞及制备治疗肿瘤药物中的应用，所要解决的技术问题是合成稳定的水相悬浮的碳纳米材料SWCNT及其衍生物。与传统的癌症治疗药物相比，该材料能抑制CSC的形成，降低肿瘤组织中CSC的数量、肿瘤血管密度和肿瘤细胞增殖能力等，抑制TGFβ信号通路，破坏肿瘤微环境，抑制肿瘤生长。该纳米材料可用作CSC抑制剂用于肿瘤的治疗，提高肿瘤的治疗效果。

本发明是通过以下的技术方案来实现的。

本发明提供一种SWCNT及其衍生物在特异性抑制肿瘤干细胞(CSC)方面的应用。

另外，本发明还提供一种SWCNT及其衍生物在抑制TGFβ信号通路及破坏肿瘤微环境中的应用。

本发明还提供一种SWCNT及其衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明实施例的应用，所述衍生物包含SWCNT-Raw与SWCNT-COOH。

本发明实施例的应用，所述SWCNT-Raw及SWCNT-COOH的合成方法为：

1)将SWCNT-Raw和SWCNT-COOH分别溶于超纯水中，用探头式超声仪超声至材料充分分散，然后视情况加入终浓度为1-6M的盐酸；

2)在超声清洗仪中继续超声至材料充分分散，通过离心分离出溶液中的纳米材料沉淀，然后用超纯水多次清洗沉淀，最后用少量超纯水重悬，利用超声清洗仪超声法将其分散于水中，最终获得稳定悬浮于水中的纳米材料，且浓度约为100-150μg/mL。

本发明实施例的应用，包括：

1)抑制CSC形成的方法，发现SWCNT及其衍生物能显著抑制CSC的形成；

2)SWCNT及其衍生物能显著提高肿瘤微环境内肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，促进化疗药物对其的杀伤；

3)SWCNT及其衍生物能显著降低肿瘤组织内的CSC数量、肿瘤微血管密度和肿瘤细胞的增殖能力等，并抑制肿瘤的生长；

4)SWCNT及其衍生物能显著抑制TGFβ信号通路及下游相关的基因的表达，进而破坏CSC赖以存在的肿瘤微环境。

借由上述技术方案，本发明具有如下优点：

1)本发明中所用的碳纳米材料制备条件和步骤简单，易于操作，具有产业化合成的前景；

2)本发明中所制备的碳纳米材料具有较高的生物相容性，且能特异性抑制CSC的形成；

3)本发明中所制备的碳纳米材料能显著抑制肿瘤组织内CSC，降低肿瘤血管密度和肿瘤细胞增殖能力等，抑制肿瘤生长；

4)本发明中所制备的碳纳米材料能有效抑制TGFβ信号通路，破坏肿瘤微环境，可有望作为特异性靶向抑制CSC和TGFβ信号通路的试剂，用于肿瘤治疗。

附图说明

图1是水相SWCNT及其衍生物水溶液(A)和TEM表征(B)。

图2是纳米材料对人成纤维细胞(A)和普通肿瘤细胞(B)的CCK8结果。

图3是纳米材料进入肿瘤细胞生物电镜图片，绿色箭头所指的为细胞内的纳米材料。

图4是纳米材料抑制肿瘤细胞去分化形成CSC球囊(A)和CSC标志物蛋白表达(B)，降低细胞克隆形成能力(C)和脂肪诱导分化能力(D)，不影响化疗药物对普通肿瘤细胞的杀伤(E)，增加化疗药物对微环境中药物耐受性肿瘤细胞的杀伤(F)。

图5是低氧和酸性条件下纳米材料对肿瘤细胞去分化的形成CSC球囊的影响。

图6是纳米材料对其他肿瘤细胞系去分化形成CSC球囊的影响。

图7是纳米材料给药时间和次数(A)，对肿瘤组织内肿瘤细胞增殖(Ki-67表达水平)和肿瘤血管密度(CD31)的影响(B)，以及降低组织内CSC能力(D)。

图8是纳米材料对肿瘤细胞中TGFβ信号通路中TGFβ受体TGFβRI和下游smad2磷酸化水平(A)以及下游与CSC性能相关基因的表达的影响(B)，纳米材料对肿瘤组织中TGFβRI和下游smad2磷酸化水平(C)以及下游基因的表达的影响(D)。

具体实施方式

以下通过具体较佳实施例结合附图对本发明的应用作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。

本发明的一种碳纳米材料SWCNT及其衍生物包含水相SWCNT-Raw和SWCNT-COOH，MWCNT为对照材料，SWCNT-Raw，SWCNT-COOH以及MWCNT的合成方法为：

1)将5-10mg SWCNT-Raw，SWCNT-COOH和MWCNT分别溶于超纯水10-20mL中，用探头式超声仪超声分散后，加入终浓度为1-6M的盐酸；

2)在超声清洗仪中继续超声分散后，通过离心分离出溶液中的纳米材料沉淀，然后用超纯水多次清洗沉淀，最后用超纯水重悬，利用超声清洗仪超声法将其分散于水中，最终获得稳定悬浮于水中的纳米材料，且浓度约为100-150μg/mL。

使用透射电子显微镜(TEM)方法表征本发明中制备的纳米颗粒；细胞CCK8实验检测材料的生物学相容性；通过细胞自我更新、细胞免疫荧光、脂肪细胞诱导分化、化疗药物敏感性等方法检测该纳米材料抑制肿瘤细胞去分化形成CSC能力；利用小鼠肿瘤模型、肿瘤组织免疫组化、肿瘤组织免疫荧光等方法分析该纳米材料抑制肿瘤组织中CSC和对肿瘤的治疗效果；通过RT-PCR、Western blot等试验研究该纳米材料对TGFβ1信号通路的抑制作用。

具体检测结果分别如下：

1)合成纳米材料的TEM表征

合成的悬浮于水中的纳米材料的TEM图片(图1)表明，分散于水中的SWCNT-Raw与SWCNT-COOH纳米颗粒长度为1-3μm，外径尺寸为1-2nm。

2)生物相容性分析

CCK8实验结果表明，0-10μg/mL的SWCNT-Raw及SWCNT-COOH处理的人成纤维细胞和普通肿瘤细胞均保持较高的存活率(图2)，说明该纳米材料具有很好的生物相容性。

3)纳米材料进细胞分析

细胞生物电镜实验结果表明，SWCNT-Raw及SWCNT-COOH能进入肿瘤细胞内(图3)。

4)肿瘤细胞去分化形成CSC检测

利用TGFβ1诱导无血清培养的肿瘤细胞(MNNG/HOS)去分化形成CSC，诱导过程中贴壁细胞会逐渐转变并形成CSC球囊。SWCNT(SWCNT-Raw和SWCNT-COOH)能显著抑制CSC球囊的形成并抑制CSC标志物的表达，且SWCNT处理的细胞自我更新能力(克隆形成能力)、分化为脂肪细胞的能力以及化疗药物敏感性与普通肿瘤细胞相似(图4)，表明SWCNT有效抑制了TGFβ1诱导的肿瘤细胞去分化形成CSC过程。

在低氧或者酸性微环境中，SWCNT仍然能抑制TGFβ1诱导的肿瘤细胞去分化形成CSC过程(图5)。在其他肿瘤细胞系(Saos-2和MG63)中，SWCNT有同样的抑制效果(图6)。对照材料MWCNT则对去分化过程没有影响。

5)体内肿瘤模型实验检测

将MNNG/HOS细胞肌肉注射至小鼠腿部，待肿瘤直径大小在1cm左右，将SWCNT直接注射到肿瘤组织内，处理31天后，将肿瘤组织取出并进行相关检测。SWCNT能显著抑制肿瘤的生长，并降低组织内肿瘤细胞的增殖、肿瘤微血管密度和CSC群体数量(图7)。

6)TGFβ1信号通路分析

体外细胞培养和TGFβ1诱导CSC实验结果显示，SWCNT能显著抑制TGFβ1信号通路过程和下游基因的表达水平(图8)。体内肿瘤模型实验结果说明SWCNT能抑制肿瘤组织中TGFβ1信号通路过程和下游基因的表达水平(图8)。

实施例1

将SWCNT-Raw，SWCNT-COOH和MWCNT 5-10mg分别溶于超纯水中，用探头式超声仪超声分散后，加入终浓度为1-6M的盐酸。在超声清洗仪中继续超声分散后，通过离心分离出溶液中的纳米材料沉淀，然后用超纯水多次清洗沉淀，最后用少量超纯水重悬，利用超声清洗仪超声法将其分散于水中，最终获得稳定悬浮于水中的纳米材料，且浓度约为100-150μg/mL。

将骨肉瘤细胞MNNG/HOS培养在无血清培养基中，当细胞处于对数生长期时，分别加入5-10μg/mL SWCNT-Raw、SWCNT-COOH以及MWCNT孵育24小时，收集细胞并将细胞置于2％戊二醛中放置过夜。随后，细胞经1％的四氧化三锇后固定1小时，梯度酒精脱水后制备超薄电镜切片。超薄切片经乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，置于透射电镜下观察。如图3所示，SWCNT-Raw、SWCNT-COOH以及MWCNT均可在MNNG/HOS细胞质中被发现(绿色箭头所示)，这说明三种纳米材料都可以很好的被肿瘤细胞所吸收。

实施例2

根据已有的研究报道，普通的骨肉瘤细胞能在TGFβ1的作用下发生去分化，形成CSC。我们以骨肉瘤细胞MNNG/HOS为例，说明SWCNT及其衍生物对骨肉瘤细胞去分化及CSC形成的抑制作用。将MNNG/HOS培养在含有4ng/mLTGFβ1的无血清培养基中，同时分别添加不同浓度的SWCNT-Raw、SWCNT-COOH以及MWCNT进行处理。如图4A所示，5天后，SWCNT-Raw和SWCNT-COOH能够显著抑制球囊样CSC的形成，并且这种抑制作用随着SWCNT纳米材料浓度的升高而增强。而作为对照材料的MWCNT则没能显示出对骨肉瘤细胞去分化以及CSC形成的抑制作用。如图4B所示，与对照组(Control)相比，SWCNT-COOH能够显著抑制MNNG/HOS细胞表达骨肉瘤CSC的标志基因c-Kit、stro-1、TRA-1-60、SSEA1和SSEA4。如图4C所示，TGFβ1处理后MNNG/HOS细胞的克隆形成能力显著强于处理前的普通MNNG/HOS细胞(Adherent)，但是加入SWCNT-COOH后，TGFβ1对MNNG/HOS细胞克隆形成能力的提升作用被显著抑制。同时，也显著抑制了TGFβ1处理后的MNNG/HOS细胞分化成脂肪细胞的能力(图4D)。这些结果说明，SWCNT及其衍生物SWCNT-COOH能够有效抑制TGFβ1作用的MNNG/HOS细胞获得CSC特性，比如CSC表面标志基因的表达、自我更新能力以及多向分化能力。

将SWCNT-Raw、SWCNT-COOH或者相同体积的超纯水(对照)分别与不同剂量的化疗药物阿霉素(adriamycin)共同处理贴壁培养的MNNG/HOS细胞24小时后，利用CCK8试剂分析活细胞的数量。结果如图4E所示，SWCNT及其衍生材料并不影响普通MNNG/HOS细胞对化疗药物的敏感性。随后，将SWCNT-Raw与TGFβ1、SWCNT-COOH与TGFβ1、TGFβ1或者相同体积的超纯水(对照)处理无血清培养的MNNG/HOS细胞，5d后TGFβ1能促使细胞去分化形成CSC，同时在各组加入不同剂量的化疗药物。处理24小时后，利用CCK8试剂分析活细胞的数量。结果如图4F所示，与对照组(Control)相比，TGFβ1使MNNG/HOS细胞去分化形成CSC后，大大提升了细胞对化疗药物阿霉素的耐受性，而SWCNT及其衍生物显著降低了TGFβ1诱导的MNNG/HOS细胞的化疗耐受性。这些结果说明，SWCNT及其衍生材料能够破坏骨肉瘤细胞的微环境，从而提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，增强治疗效果。

实施例3

将MNNG/HOS细胞培养在含有TGFβ1的pH 6.4无血清培养基中模拟肿瘤内酸性的微环境；将MNNG/HOS细胞培养在含有TGFβ1的PH7.4无血清培养基中的同时培养在3％O₂的低氧培养箱中，模拟肿瘤内低氧的微环境；在培养基中分别加入SWCNT-Raw、SWCNT-COOH进行处理，对照组(Control)中加入相同体积的超纯水。3天或5天后，如图5所示，与对照组(Control)相比，SWCNT及其衍生物在酸性和低氧两种条件下均能够显著抑制MNNG/HOS细胞去分化形成球囊状CSC。这说明，SWCNT的对肿瘤细胞去分化和肿瘤干细胞的形成的抑制作用不仅仅限于正常条件下，也适用于肿瘤内酸性和低氧的极端微环境。

实施例4

将骨肉瘤细胞株Saos-2、MG-63分别培养在含有TGFβ1的无血清培养基中，同时在实验组中分别添加SWCNT-Raw、SWCNT-COOH进行处理，对照组(Control)中加入相同体积的超纯水。5天后，如图6所示，与对照组(Control)相比，SWCNT及其衍生物在能够显著抑制Saos-2与MG-63细胞去分化形成球囊状CSC。这说明，SWCNT及其衍生材料能够抑制多种骨肉瘤细胞去分化，对骨肉瘤细胞去分化形成CSC的抑制作用具有普遍适用性。

实施例5

将4×10⁶MNNG/HOS细胞接种在4～5周大小的BALB/c裸鼠腿部肌肉中，使其成瘤。待肿瘤最大直径达1.0cm左右时，按照图7A所示的时间轴，将6μg SWCNT-COOH、MWCNT与超纯水(Control)分别直接注射至肿瘤内。每隔一天对小鼠进行称重，并测量小鼠肿瘤的体积。结果如图7B所示，SWCNT-COOH组小鼠肿瘤的体积增长明显小于MWCNT组和超纯水对照组(图8C)，而MWCNT组与对照组无显著性差异。这说明SWCNT-COOH能够特异性抑制小鼠体内骨肉瘤的生长。

随后，我们对小鼠肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析，结果如图7C所示，SWCNT-COOH处理组肿瘤组织内坏死区周围CD31⁺血管(绿色箭头)密度显著低于MWCNT组和超纯水对照组，同时显著降低了细胞增殖标志基因Ki67的表达。更为重要的是，SWCNT-COOH处理组肿瘤组织内坏死区周围CSC表面标志基因c-Kit、stro-1、TRA-1-60、SSEA1和SSEA4的表达显著降低(图7D)，这说明SWCNT-COOH显著降低了肿瘤组织干细胞池内CSC的数量。

实施例6

为了进一步阐明SWCNT及其衍生物对骨肉瘤微环境中TGFβ1信号通路的影响，我们将MNNG/HOS细胞培养在无血清培养基中，并进行以下处理：

1)添加相同体积超纯水，2)添加TGFβ1和相同体积超纯水，3)添加TGFβ1和SWCNT-COOH，4)添加TGFβ1和SWCNT-Raw，5)添加TGFβ1和MWCNT，24小时后，收集细胞采用western blot的实验方法检测TGFβ1受体TGFβR1以及下游效应分子Smad2的磷酸化活性。

如图8A所示，SWCNT及其衍生物SWCNT-COOH显著降低了TGFβR1和Smad2的磷酸化活性。此外，我们进一步分析了TGFβ1信号通路下游与细胞转化和干细胞特性密切相关的基因Hey1、Snail1和Sanil2的表达。qRT-PCR结果显示(图8B)，SWCNT及其衍生物SWCNT-COOH显著降低了MNNG/HOS细胞中TGFβ1诱导的Hey1、Snail1和Sanil2的表达。随后，我们进一步分析了SWCNT在体内对TGFβ1信号通路活性的影响。将SWCNT-COOH、MWCNT以及超纯水处理后的小鼠肿瘤组织进行Western blot检测，结果发现与对照组相比，SWCNT-COOH显著降低了肿瘤组织中TGFβR1和Smad2的磷酸化活性(图8C)，且TGFβ1信号通路下游与细胞转化和干细胞特性密切相关的基因Hey1、Snail1和Sanil2的表达也显著降低(图8D)。而对照材料MWCNT则不会影响TGFβ1受体及其下游效应分子、靶基因的表达。这说明，SWCNT-COOH能特异性地破坏骨肉瘤细胞的微环境，抑制肿瘤细胞中TGFβ1信号通路的活性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。