本发明涉及一种治疗饮食停滞，胃脘胀闷，纳呆食少，失眠多梦，头晕心悸，神倦乏力等症的益生菌发酵型参术建中口服液及其制备方法，属于医药技术领域。
背景技术：
根据药品标准WS-5523(B-0523)-2002中给出的制备方法制备而成的参术建中口服液，是一种具有益气健脾，和中安神功能，适用于治疗饮食停滞，胃脘胀闷，纳呆食少，失眠多梦，头晕心悸，神倦乏力等症口服制剂。以下是WS-5523(B-0523)-2002 药品标准中给出的配方和工艺及简要说明：
处方：人参 50g 山楂（焦）50g 五味子20g 麦芽（炒）10g 白术（焦）10g。
制法：以上五味，将人参、山楂、麦芽、白术、五味子酌予碎断，加水煎煮二次，第一次加5倍量水，煎煮2小时，第二次加2倍量水，煎煮1小时，分次滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度为1.14-1.22（50℃），加3倍量乙醇，静置24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.16-1.24（50℃），再加4倍量乙醇，静置24小时，滤过，回收乙醇至相对密度为1.16-1.24（50℃），再加5倍量乙醇，静置24小时，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.16-1.24（50℃），备用。将山梨酸2g加乙醇适量溶解，滤过，备用。取蜂蜜200g加适量水溶解，加热至85～95℃保持30分钟，除蜜沫，滤过；加入到浓缩液中，混匀。在不断搅拌下徐徐加入山梨酸的乙醇溶液，再加水至1000ml，混匀，分装，即得。
功能主治：益气健脾，和中安神。适用于饮食停滞，胃脘胀闷，纳呆食少，失眠多梦，头晕心悸，神疲乏力等症。
用法用量：口服，一次10mL，一日2-3次。
参术建中口服液原工艺采用多次醇沉工艺，不但消耗大量乙醇，而且将处方中多糖、多肽等大分子类成分除掉，造成药材浪费。
多糖是中药中一类天然高分子化合物，是维持生命正常运转的基本物质，有调节免疫系统功能、抗胃肠溃疡功能、抗氧化以及抗衰老等作用，具有巨大开发潜力。多肽具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现行参术建中口服液采用醇沉工艺，将处方中多糖、多肽等大分子类成分除掉，造成药材浪费的缺陷，提供一种益生菌发酵型参术建中口服液及其制备方法。
本发明的另一个目的是将原工艺中蜂蜜改为三氯蔗糖，扩大了高血糖人群使用。
本发明的技术方案如下：
一种益生菌发酵型参术建中口服液，由益生菌发酵中药复方制得，所述中药复方的成分及含量为：每1000ml益生菌发酵型参术建中口服液中含：人参 50g 焦山楂50g 五味子20g 炒麦芽10g 焦白术10g。
所述的益生菌为双歧杆菌和乳杆菌。
所述益生菌发酵型参术建中口服液的制备方法步骤如下：
a. 取中药复方中的人参、炒麦芽、焦白术三味药，粉碎，过20～100目；
b. 加水浸泡0.5～1.0h，80～115℃加热20～60min，调pH值5.5～6.5，高温淀粉酶酶解（用量：中药质量的0.1～0.8%），酶解至碘试液不再变蓝；
c. 调整pH7.0并于110～121℃下灭菌30～60分钟，温度降至39℃左右时，接种预培养的体积百分比各约0.2～1.0%的一种或者两种双歧杆菌的菌液，常规培养约2～6小时，再接种预培养的体积百分比各约0.2～1.0%的两种或者三种乳杆菌的菌液，然后继续发酵12～42小时，当pH降至4.0以下时结束发酵；
d. 分离发酵液与残渣，残渣再用水加热提取一遍，合并发酵液与提取液，浓缩，得浓缩液备用；
e. 取焦山楂、五味子加水浸泡、加热提取两次，过滤，合并滤液，调pH3～6，果胶酶酶解（用量：中药质量的0.1～1.0%），过滤或离心，浓缩，得浓缩液备用；
f. 合并步骤d、步骤e得到的浓缩液，用ZTC澄清剂处理，加纯化水稀释，分装，灭菌，即得益生菌发酵型参术建中口服液。
制备方法步骤c中所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌；所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。
制备方法步骤c中所述的接种的方式也可为同时接种预培养的体积百分比各约0.2～1.0%的一种或者两种双歧杆菌的菌液和预培养的体积百分比各约0.2～1.0%的两种或者三种乳杆菌的菌液；所述发酵的时间为常规发酵16～48小时，当pH降至4.0以下时结束发酵。
为了改善口感，在步骤f用ZTC澄清剂处理之后，还添加有三氯蔗糖（100～300mg/L）。
菌种来源于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）（中国，武汉）或中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）（中国，北京）或者从正常人的粪便或肠粘膜组织中分离得到这些细菌菌株。
一般说来，本发明的发酵型参术建中口服液的口服给药剂量可根据原工艺制备的参术建中口服液药材含量折算，或根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人或动物的年龄、体重、一般健康状态，以及病人或动物对所用药物的敏感性、耐受性和给药方式等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。
中药在发酵中药过程中，微生物的生长代谢具有强大的分解转化能力，能将许多不能直接吸收利用的大分子有效活性物质降解为小分子活性物质，小分子活性物质可通过血脑屏障，并与机体的细胞蛋白结合，从而易于机体对有效成分的吸收和利用，提高中药的治疗效果。
本发明利用酶解技术和发酵技术，通过对人体有益的肠道细菌，在体外发酵中药。一方面，保留了中药的水提物全成分；另一方面，体外转化大分子物质，易于人体吸收，增强疗效；并且在发酵过程中，产生丰富风味物质，改善了中药的口感。
经动物实验证明，本发明的益生菌发酵型参术建中口服液对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮含量、一氧化氮合酶含量、胃泌素含量等指标有显著的提高和改善。经临床验证，对于治疗饮食停滞，胃脘胀闷，纳呆食少，失眠多梦，头晕心悸，神倦乏力等症优于原工艺制备的参术建中口服液。
具体实施方式
实施例1：益生菌发酵型参术建中口服液A的制备
按下列重量称取各中药成分：人参 50g 焦山楂50g 五味子20g 炒麦芽10g 焦白术10g。
取人参、炒麦芽、焦白术三味药，粉碎，过20目，加10倍量水浸泡1.0小时，110℃加热20分钟，降温至90℃时，调pH=6，加入高温淀粉酶0.2g，酶解至碘试液不再变蓝。
调整pH7.0并于115℃下灭菌50分钟，温度降至39℃左右时，接种预培养的体积百分比各约0.5%的两歧双歧杆菌（正常人体分离，经中国科学院微生物研究所鉴定）和青春双歧杆菌（CGMCC 1.2190）的菌液，37℃培养约6小时后，再接种体积百分比各约0.5%的干酪乳杆菌（CGMCC 1.3113）、鼠李糖乳杆菌（CGMCC 1.2466）和德氏乳杆菌（CGMCC 1.1480）的菌液，37℃发酵16小时检测pH值，当pH值降至4.0以下时结束发酵，离心，收集发酵液，残渣再加水5倍量，90℃加热提取0.5小时，离心，合并发酵液与提取液，浓缩至500ml，备用。
另取焦山楂、五味子加水浸泡1.0小时，煎煮二次（8倍量水、6倍倍量水），第一次1.5 小时，第二次为1.0 小时，过滤，合并滤液，调pH5.0，50℃加果胶酶0.3g，酶解2.0小时，离心，浓缩至300ml，备用。
合并以上两种浓缩液，用ZTC1+1澄清剂处理，添加三氯蔗糖200mg，加纯化水稀释至1000ml，分装，灭菌，即得益生菌发酵型参术建中口服液A。
实施例2：益生菌发酵型参术建中口服液B的制备
按下列重量称取各中药成分：人参 50g 焦山楂50g 五味子20g 炒麦芽10g 焦白术10g。
取人参、炒麦芽、焦白术三味药，粉碎，过60目，加10倍量水浸泡0.5小时，100℃加热40分钟，降温至80℃时，调pH=6.2，加入高温淀粉酶0.3g，酶解至碘试液不再变蓝。
调整pH7.0并于121℃下灭菌40分钟，温度降至39℃左右时，同时接种预培养的体积百分比各约1.0%的短双歧杆菌（CGMCC 1.2213）的菌液，体积百分比各约0.5%的嗜酸乳杆菌（CGMCC 1.1854）、植物乳杆菌（CGMCC 1.19）的菌液，37℃发酵24小时检测pH值，当pH值降至4.0以下时结束发酵，离心，收集发酵液，残渣再加水5倍量，100℃加热提取0.5小时，离心，合并发酵液与提取液，浓缩至500ml，备用。
另取焦山楂、五味子加水浸泡1.0小时，煎煮二次（8倍量水、6倍倍量水），第一次1.5 小时，第二次为1.0 小时，过滤，合并滤液，调pH4.5，50℃加果胶酶0.5g，酶解2.0小时，过滤，浓缩至300ml，备用。
合并以上两种浓缩液，用ZTC1+1澄清剂处理，添加三氯蔗糖150mg，加纯化水稀释至1000ml，分装，灭菌，即得益生菌发酵型参术建中口服液B。
本发明中使用的益生菌为双歧杆菌和乳杆菌，其中双歧杆菌是人或哺乳动物体内最重要的生理性细菌，主要分布于小肠下部和结肠内。乳杆菌是人体内分布最为广泛的益生菌，在胃肠道中，该细菌主要分布于迥肠部。本发明选用两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、和植物乳杆菌等常见益生菌菌株，主要是基于它们在人或动物肠道内分布的总体广泛性，以及它们生理学活性的互补性。
可以从中国典型培养物保藏中心（CCTCC）（中国，武汉）和中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）（中国，北京）购得，或者从正常人的粪便或肠粘膜组织中分离得到这些细菌菌株。
为检测本发明的益生菌发酵型参术建中口服液与原工艺生产的参术建中口服液的功能作用，下面通过对比实验，验证益生菌发酵型参术建中口服液与原工艺制备的参术建中口服液，对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮含量、一氧化氮合酶含量、胃泌素含量的影响。并进一步通过临床对比，验证益生菌发酵型参术建中口服液优于原工艺制备的参术建中口服液。
实验例1：益生菌发酵型参术建中口服液与原工艺参术建中口服液益气健脾功能实验
本实验旨在利用对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮含量、一氧化氮合酶含量、胃泌素含量的测定，举例描述按本发明方法制备的发酵型参术建中口服液，与原工艺制备的参术建中口服液功能作用的比较。
取实施例1、2制备的益生菌发酵型参术建中口服液与原工艺制备的参术建中口服液（三株福尔制药有限公司生产，批号151001），分别浓缩至相同浓度（按所含药材量折算），作为供试样品。
取SPF 级 Wistar 大鼠，雌雄各半，3 月龄，体重(180±20)g，适应性饲养 1 周后，受试动物按体重编号，用随机数字表法分为正常对照组、模型组、原工艺组、发酵口服液A组、发酵口服液B组，每组 10 只,雌雄各半分笼饲养。以大黄法、 力竭法及饥饿法三因素复合法复制脾气虚证模型，共 21 d。造模同时原工艺组、发酵口服液A组、发酵口服液B组给予相应药物灌胃给药干预，灌胃剂量 10 g/(kg·d),灌胃容积为 1 mL/100 g ，连续 3 周；空白对照组、模型组给予同体积蒸馏水灌胃。各组均以蒸馏水、标准饲料喂养。各组大鼠于末次灌胃给药后，禁食不禁水 24 h，测体重作记录, 采血后断头处死并制备待检标本。
血清制备：股动脉取血 4 mL，静置 2 h 后，2 000 r/min 离心 10 min，取上清,放入尖底管中 4 ℃低温冰箱保存待测，一部分采用比色法检测 NO、NOS,一部分采用放免法检测 GAS。 胃、小肠组织的收集：动物处死后,迅速将近胃小弯胃组织、胃窦端小肠组织截取，称重后分别用眼科小剪刀尽快剪碎，分别置于匀浆器中，用组织重 9 倍生理盐水匀浆(匀浆器的末端置于放冰块的冷水中)，后以3500 r/min离心 10 min，取上清液置 4 ℃冰箱保存，其中胃、小肠组织匀浆上清液一部分采用比色法检测 NO、NOS,胃组织匀浆一部分采用放免法检测 GAS。
观察：正常对照组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及饮食量正常,被毛浓密柔顺而有光泽,粪便呈棕褐色颗粒状。模型组大鼠多数在第 5 日即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯；第 10 日后出现少食、怠动、消瘦、肛周污秽,部分动物出现脱肛,动作迟缓, 甚至行动歪斜,同时毛发失去正常光泽而枯槁、疏散,而后出现畏寒,成群蜷缩或拱背,并逐渐出现体重减轻,大便增多(垫料呈橘黄色)等脾虚症状。原工艺组大鼠第 6 日出现轻度倦卧、被毛稀疏干枯；第 13 日后出现少食、怠动、消瘦、肛周污秽,少部分动物出现脱肛,动作迟缓,大便增多等；第 16 日后上述症状开始减轻或消失,表现为反应较为灵敏,活动及饮食量正常,被毛疏散但有光泽,粪便部分呈颗粒状。发酵口服液A组、发酵口服液B组大鼠第 8 日出现轻度倦卧；第 13 日后出现少食、怠动、动作迟缓，大便增多等；第 15 日后上述症状开始减轻或消失,表现为反应较为灵敏,活动及饮食量正常,被毛浓密柔顺有光泽,粪便呈棕褐色颗粒状。
表 1为不同制备工艺的参术建中口服液对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮含量的影响。
表1：各组大鼠血清及胃肠组织 NO 含量比较( x±s)
注：与正常对照组比较,*P ＜0.05,**P ＜0.01；
与模型组比较,▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；
与原工艺组比较,△P ＜0.05，△△P ＜0.01。
从本实验结果中可以看出，模型组与正常对照组各指标存在非常显著差异（p<0.01），说明脾虚证模型组造模成功；原工艺组、发酵口服液A组、发酵口服液B组与模型组各指标存在非常显著差异（p<0.01）或显著性差异（p<0.05），说明原工艺与发酵制备工艺的产品均有一定的治疗效果；原工艺组与发酵口服液A组、发酵口服液B组比较存在显著差异（p<0.05），说明益生菌发酵型工艺制备的样品比原工艺制备的样品，对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮含量的影响增强。
表 2为不同制备工艺的参术建中口服液对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮合酶含量的影响。
表 2 各组大鼠血清及胃肠组织 NOS 含量比较(x±s)
注：与正常对照组比较,*P ＜0.05,**P ＜0.01；
与模型组比较,▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；
与原工艺组比较,△P ＜0.05，△△P ＜0.01。
从本实验结果中可以看出，模型组与正常对照组各指标存在非常显著差异（p<0.01）或显著性差异（p<0.05），说明脾虚证模型组造模成功；原工艺组、发酵口服液A组、发酵口服液B组与模型组各指标存在非常显著差异（p<0.01）或显著性差异（p<0.05），说明原工艺与发酵制备工艺的产品均有一定的治疗效果；原工艺组与发酵口服液A组、发酵口服液B组比较存在显著差异（p<0.05），说明益生菌发酵型工艺制备的样品比原工艺制备的样品，对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮合酶含量的影响增强。
表 3为不同制备工艺的参术建中口服液对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织胃泌素含量的影响。
表 3 各组大鼠血清及胃组织 GAS 含量比较(x±s）
注：与正常对照组比较,*P ＜0.05,**P ＜0.01；
与模型组比较,▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；
与原工艺组比较,△P ＜0.05，△△P ＜0.01。
从本实验结果中可以看出，模型组与正常对照组各指标存在非常显著差异（p<0.01），说明脾虚证模型组造模成功；原工艺组、发酵口服液A组、发酵口服液B组与模型组各指标存在非常显著差异（p<0.01）或显著性差异（p<0.05），说明原工艺与发酵制备工艺的产品均有一定的治疗效果；原工艺组与发酵口服液A组、发酵口服液B组比较存在显著差异（p<0.05），说明益生菌发酵型工艺制备的样品比原工艺制备的样品，对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织胃泌素含量的影响增强。
实验结果表明，本发明的益生菌发酵型参术建中口服液比原工艺制备的参术建中口服液，对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮含量、一氧化氮合酶含量、胃泌素含量等指标有不同程度的提高和改善，且两者有显著性差异。
一氧化氮合酶(NOS)广泛分布于胃肠道，其产物一氧化氮(NO)是非肾上腺素能非胆碱能神经的抑制性递质，广泛参与胃肠生理功能。NO 不仅在神经传导、胃肠保护中起重要作用，而且参与多种病理发生的信号转导。胃泌素(GAS)属胃肠激素，分布于中枢神经系统和胃肠道黏膜组织，在外周作为激素调节胃的运动功能，属兴奋胃肠运动的脑肠肽之一。
脾虚证作为一种全身性的病理状态存在着胃肠道运动功能紊乱，消化吸收功能下降，淀粉酶活性下降及其化学消化能力低下，胃排空加速，小肠吸收功能下降；同时胃肠道内分泌及激素异常,餐后血清 GAS 明显降低，G 细胞合成分泌功能减弱，出现如饮食停滞、胃脘胀闷、纳呆食少、神倦乏力等症状均为胃肠道生理功能紊乱所致，故本实验以脾气虚证大鼠为对象，研究一氧化氮信号通路及 GAS 表达水平在脾气虚证中的变化以及不同制备工艺的参术建中口服液的干预效应，比较不同制备工艺的参术建中口服液治疗脾气虚证的效果。
动物实验证明，按照本发明的方法制备的发酵型参术建中口服液，功效优于原工艺制备的参术建中口服液。
实验例2：临床验证
试验药物：实施例1制备的益生菌发酵型参术建中口服液A与原工艺制备的参术建中口服液（三株福尔制药有限公司生产，批号151001）
用法用量：口服，一次10mL，一日3次。21天为一个疗程，一个疗程为一个周期观察各项指标。
1、观测指标：饮食停滞，胃脘胀闷，纳呆食少，失眠多梦，头晕心悸，神倦乏力等。
2、单项症状疗效判定
痊愈：症状消失；显效：症状明显减轻，症状减少2个等级（+++→+）； 有效：症状好转，症状减少1 个等级（+++→++或++→+)；无效：症状无改善。
3、结果
全部病例均为门诊患者，实际入组病例120例，其中男58例，女62 例；病例分组，按照检查结果，病情及中医证候相似者平均分配在发酵型组与原工艺组中，尽量使病例有可对比性，并且高血糖患者分配在发酵型组。
临床疗效：见表4、5
表4 益生菌发酵型参术建中口服液A治疗前后中医症候疗效
表5 原工艺制备的参术建中口服液治疗前后中医症候疗效
从表4、5所示结果可以看出，本发明提供的发酵型参术建中口服液疗效显著，与原工艺制备的参术建中口服液比较疗效明显提高。说明本发明所涉及的制备方法提高了参术建中口服液的临床疗效。