一种治疗烧烫伤的中药材提取物的制作方法

本申请涉及一种中药材提取物及其药学方面用途，具体为一种鹿茸蛋白提取物及其用于治疗烧伤的制药用途。
背景技术：
：鹿茸是中药里的名贵药材，和人参、阿胶被称为中药三宝，已有2000多年的入药历史。古书记载，鹿茸味甘咸，性温，入肝、肾经，补肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒，性温而不燥，具有振奋和提高机体功能，对全身虚弱、久病之后的患者，有较好的强身作用。鹿茸是迄今为止所发现的惟一具有完全再生能力的哺乳动物附属器官。鹿茸再生是以年为周期进行的，再生周期中鹿茸的生长十分迅速，在其快速生长期以每天1-2厘米的速度生长，在90-120天内可完成骨、软骨、血管、神经、表皮等组织的分化发育到成熟的全过程。现代药理研究证实，鹿茸中的化学成分较复杂，主要有氨基酸、蛋白质、维生素、胶质、脂类、粘多糖、碱基、核酸、微量元素及其它无机物等，其中蛋白质含量高达55.26％。鹿茸对心血管系统、神经系统、性功能均有正向调节作用，同时还有促进骨骼愈合，促进皮肤再生等药理作用，这些药理作用均与鹿茸的生理现象相吻合。烧烫伤是临床常见皮肤损伤的病症之一，主要是由于热力如蒸气、火焰、炽热金属、沸水和高温气体等所致的体表组织损害[1]。烧烫伤是日常生活中比较常见的意外情况之一，对患者的生理和心理都造成很大的影响，给病人带来一定的精神创伤和躯体损伤。特别是发生在特殊功能部位或是较大面积深度烧烫伤是十分危险的，后果将是严重的。据不完全统计，我国一般平均每年发生率为总人口的0.5％～1％，其中的1/10病人需要住院治疗[2]。由于烧烫伤治疗技术、治疗药物的差异，目前治疗烧烫伤创面中西医外用药物种类颇多，其方法及疗效迥然不同，寻找治疗烫伤且疗效显著的药物成为人们的迫切愿望。技术实现要素：本发明一方面提供了鹿茸蛋白提取物在制备用于治疗烧烫伤的药物中的用途。本发明提供了鹿茸蛋白质提取物的制备方法。本发明所提供的鹿茸蛋白质提取物的制备方法，包括：1)将鹿茸进行粉碎，得到鹿茸粉碎物；用水浸提所述鹿茸粉碎物，收集水溶性物质得到鹿茸水溶性提取物；2)对所述鹿茸水溶性提取物用水进行透析至pH值为6.5-8.5(如7.0)，结束透析，得到所述鹿茸蛋白质提取物。上述方法中，所述鹿茸粉碎物的粒径可为50μm-100μm，具体可为75μm。上述方法中，所述用水浸提时水的pH值为3-4，例如3.5，所述水的pH值可通过向水中加入冰醋酸进行调节。上述方法中，所述用水浸提为在2-6℃，例如4℃，进行20-26h，例如如24h。上述方法中，所述鹿茸粉碎物和水的质量比可为1∶(4-6)，具体可为1∶5，所述鹿茸的质量为鲜重。上述方法中，所述鹿茸可为新鲜的鹿茸。上述方法中，可采用离心收集所述水溶性物质。所述离心采用的离心力可为3000g-5000g，例如4000g，离心时间可为10-20min，例如10min。上述方法中，所述透析采用截留分子量为1kDa的半透膜进行。所述透析可在水中进行10-12h，每4h更换水一次。上述方法中，所述方法还包括将结束透析后得到的液体在50-60℃，例如55℃，进行浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液在3000g-5000g，例如4000g，进行离心10-20min，例如10min，收集上清液，将所述上清液进行冷冻干燥，得到鹿茸蛋白质提取物干粉的步骤。上述方法中，所述鹿茸蛋白质提取物含有蛋白质，所述蛋白质的分子量可为10kDa-250kDa。上述方法中，所述鹿茸蛋白质提取物中含有表1-表27中的157种蛋白质。表1、钙结合蛋白(Calcium-bindingprotein)蛋白名称NCBI登录号凝溶胶(Gelsolin)gi|74356373纤溶酶原(Plasminogen)gi|113205806钙调素(Regucalcin)gi|6526714钙蛋白酶-3(Calpain-3)gi|148921535表2、细胞粘附分子(Celladhesionmolecule)表3、细胞连接蛋白(Celljunctionprotein)蛋白名称NCBI登录号Dachs，isoformEgi|320544701假定蛋白(Uncharacterizedprotein)gi|335306011表4、分子伴侣(Molecularchaperones)表5、细胞骨架蛋白(Cytoskeletalprotein)表6、防御/免疫蛋白(Defense/immunityprotein)表7、酶调节剂(Enzymemodulator)表8、细胞外基质蛋白(Extracellularmatrixprotein)表9、水解酶(Hydrolase)表10、激酶(Kinase)表11、连接酶(Ligase)表12、裂解酶(Lyase)表13、膜转运蛋白(Membranetrafficprotein)蛋白名称NCBI登录号假定蛋白(Uncharacterizedprotein)gi|194035664突触蛋白1(Synapsin1)gi|374304627表14、核酸结合蛋白(Nucleicacidbindingprotein)表15、氧化还原酶(Oxidoreductase)表16、磷酸酶(Phosphatase)蛋白名称NCBI登录号nositolmonophosphatase1gi|61680900表17、蛋白酶(Protease)表18、受体(Receptor)表19、信号分子(Signalingmolecule)表20、贮藏蛋白(Storageprotein)蛋白名称NCBI登录号结珠蛋白(Junctionplakoglobin)gi|157391365表21、结构蛋白(Structuralprotein)表22、表面活性剂(Surfactant)蛋白名称NCBI登录号胶原α-1(I)的链(Collagenalpha-1(I)chain)gi|27734648胶原α-1(III)链(Collagenalpha-1(III)chain)gi|115290表23、转录因子(Transcriptionfactor)表24、传输/载体蛋白(Transfer/carrierprotein)表25、转移酶(Transferase)表26、跨膜受体调节蛋白/接头蛋白(Transmembranereceptorregulatory/adaptorprotein)表27、转运体(Transporter)本发明所提供的利用所述鹿茸蛋白质提取物的制备方法制备的鹿茸蛋白质提取物也属于本发明保护的范围。本发明还提供了鹿茸蛋白质，所述鹿茸蛋白质含有表1-表27中的157种蛋白质。附图说明图1为鹿茸蛋白质提取物的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2-4均为鹿茸蛋白质提取物。图2鹿茸蛋白提取物对热处理损伤HaCaT细胞的生存率。图3鹿茸蛋白提取物对正常HaCaT细胞的生存率。图4给药前与给予鹿茸蛋白12d后创面愈合情况对比(甘油组)图5给药前与给予鹿茸蛋白12d后创面愈合情况对比(凡士林组)图6给予鹿茸蛋白12d后创面愈合率对比(甘油组)图7给予鹿茸蛋白12d后创面愈合率对比(凡士林组)图8创伤皮肤病理观察(400倍)具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的鲜梅花鹿茸为吉林省吉云集团吉云鹿业发展有限公司的产品。下述实施例中的大鼠为雄性wistar大鼠(体重190-210g)为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。下述实施例中SephadexG-25为Pharmacia公司产品(LotNo.17-0360-01)；超滤离心管为Millipore公司产品(LotNo.UFC800308)；国产安亭牌高速冷冻离心机(LotNo.GL-20G-II)；BCA蛋白定量试剂盒为碧云天生物技术研究所的产品(LotNo.SP2001)；Bradford蛋白定量试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品(LotNo.PA102)；即用型透析袋为北京索莱宝科技有限公司的产品(LotNo.P1000D)；胶体磨购自北京锟捷玉诚机械设备有限公司；美国冷冻干燥机；美国Bio-rad垂直电泳仪：美国基因公司生产G-Box凝胶成像系统；美国Bio-rad酶标仪；iMarkTMMicroplateAbsorbanceReader(Bio-Rad，USA)；高效液相色谱仪(Agilent，1200，美国)；氮空一体机(NA-5L，上海荆和分析仪器有限公司)；质谱仪(Bruker，Altra-TOF/TOF，德国)。实施例1、具有治疗烧伤的鹿茸蛋白质提取物的制备一、鹿茸蛋白质提取物的制备按照下述方法制备鹿茸蛋白质提取物，该鹿茸蛋白质提取物即为预防和/或治疗帕金森病的鹿茸蛋白质提取物。具体如下：鲜鹿茸直接用粉碎机进行第一次粉碎，得到第一次鹿茸粉碎物。将鹿茸第一次粉碎物进行液氮速冻后置入超微粉碎机中，加适量水进行第二次粉碎至肉糜状，得到鹿茸第二次粉碎物，第二次鹿茸粉碎物的分子粒径为75μm。将鹿茸第二次粉碎物补充一定量水(鹿茸第二次粉碎物和水的质量比为1∶5)后加入适量的冰醋酸保持pH为3.5置于4℃保持24h，然后4000g离心10min分离上层清夜，该上清液即为鹿茸水溶性提取物。将鹿茸水溶性提取物用自来水进行透析脱盐10-12h，每4h更换一次水，直至经pH试纸测量外部透析液为7.0后，结束透析，透析袋内所得的物质即为鹿茸蛋白质提取物溶液，透析采用的半透膜的截留分子量为1kDa。将鹿茸蛋白质提取物溶液在55℃以下旋转蒸发浓缩至200mL以内，然后4000g离心10min除掉沉淀之后，收集上清液，将该上清液进行冷冻干燥，得到鹿茸蛋白质提取物干粉，冷冻保存。二、鹿茸蛋白质提取物中蛋白质浓度的测定采用Bradford蛋白定量试剂盒，按照说明书要求操作，将蛋白标准品(BSA)溶液(浓度为1mg/mL)按0μL，1μL，2μL，3μL，4μL，5μL，6μL的体积加到96孔板的标准品孔中，加入1×PBS缓冲液补足到10μL，向孔中加入190μL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置8min后用酶标仪测定595nm处的OD值，得到标准曲线。分别称取5mg按照步骤一方法制备的3个不同时间点的鹿茸蛋白质提取物干粉(1号为2014年12月4日制备，2号为2014年12月5制备，3号为2014年12月25日制备)，分别溶于1×PBS缓冲液中，制备成浓度为2.5mg/mL的鹿茸蛋白质提取物溶液，依次编号为1号、2号和3号的浓度为2.5mg/mL的鹿茸蛋白质提取物溶液，按照说明书要求操作，每组数据重复测定3次。1号、2号和3号的浓度为2.5mg/mL的鹿茸蛋白质提取物溶液的OD595的数值分别为1.229±0.127、0.982±0.148、0.905±0.169，根据BSA标准曲线计算得到1号、2号和3号的5mg鹿茸蛋白质提取物干粉中的蛋白质含量分别为0.972mg，0.677mg，0.585mg，3组数据取平均值0.745mg，经计算还原后采用超微粉碎法获得的鹿茸蛋白质提取物干粉中蛋白质的百分含量为14.892％。三、鹿茸蛋白质提取物中蛋白质分子量的测定将步骤一制备的鹿茸蛋白质提取物干粉采用1×PBS缓冲液进行溶解，鹿茸蛋白质提取物的上样量为50μg、上样体积为20μL。采用5％浓缩胶，10％分离胶，80V电压下进行SDS-PAGE电泳150min。电泳结束后，经考马斯亮蓝染色后，白光下观察蛋白条带，依据蛋白条带与蛋白质量标准条带的相对位置确定鹿茸蛋白质提取物中蛋白质的分子量。结果如图1所示，鹿茸蛋白质提取物中蛋白质的分子量范围为10kDa-250kDa。四、鹿茸蛋白质提取物中蛋白质的质谱鉴定将鹿茸蛋白质提取物经SDS-PAGE初步分离后得到的含蛋白质的凝胶条带等分为10份进行质谱鉴定。具体步骤如下：1、样品预处理将含蛋白质的SDS-PAGE凝胶条带在56℃用DTT还原，然后进行碘乙酰胺烷基化反应，将进行反应后的凝胶条带进行脱色处理。将脱色后的胶粒真空干燥后，加入Roche胰酶溶液，37℃下酶解15小时，获得酶解混合肽溶液。将酶解混合肽溶液进入Fusion液质联用仪进行分析。2、仪器参数设置液相色谱：C18色谱柱。流动相：A相：H2O，0.1％(v/v)甲酸；B相：乙腈，0.1％(v/v)甲酸。梯度：5-70min，5％-25％B；70-80min，25％-35％B；80-90min，35％-80％B；90-100min，80％-80％B，流速为400uL/min。质谱参数：喷雾电压为2.0KV，传输毛细管温度为320℃，一级检测器为orbitrap，质谱一级分辨率为12w，一级扫描范围为350-1550Da，二级碎裂为HCD，碰撞能量为36％，二级检测器为离子阱。通过质谱鉴定在鹿茸蛋白质提取物中共获得157种蛋白质，通过对157种蛋白质的功能和作用分析研究，可以把这157种蛋白质分为如下几类：钙结合蛋白4个，细胞粘附分子3个，细胞连接蛋白2个，分子伴侣3个，细胞骨架蛋白9个，防御/免疫蛋白6个，酶调节剂14个，细胞外基质蛋白7个，水解酶15个，激酶6个，连接酶3个，裂解酶7个，膜转运蛋白2个，核酸结合蛋白10个，氧化还原酶10个，磷酸酶1个，蛋白酶6个，受体15个，信号分子9个，贮藏蛋白1个，结构蛋白1个，表面活性剂2个，转录因子14个，传输/载体蛋白8个，转移酶11个，跨膜受体调节/接头蛋白5个，转运体9个。157种蛋白质的名称及GI号见表1-表27，蛋白质的功能不是唯一的，一种蛋白质可能同时具有两种或两种以上的功能。其中与发育和繁殖相关蛋白共有15个，参见表28。表28、与发育和繁殖相关蛋白(developmentalprocessandreproductionprotein)实施例2、鹿茸蛋白质提取物的药效学研究材料和方法1材料与方法1.1仪器试剂人永化表皮细胞HaCaT细胞株由北京中医院医院赠送；DMEM培养基(Gibco，GrandIsland，NY，USA)；FBS(HyClone，Themoscientific，USA)；MPP+，MTT(sigma，USA)；iMarkTMMicroplateAbsorbanceReader(Bio-Rad，USA)。1.2细胞培养将HaCaT细胞培养于含有10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。选取对数生长期细胞进行实验。热处理细胞：将HaCaT细胞至于45℃水浴15分钟。1.3MTT检测鹿茸促HaCaT细胞增殖作用取对数生长期的HaCaT细胞，以不同浓度的细胞接种于96孔，待细胞贴壁。经热处理后，治疗组分别以7.8125μg/mL～4mg/mL的10个不同浓度鹿茸蛋白提取物作用于HaCaT细胞。对照组不加药物，分别检测鹿茸对损伤24h的HaCaT细胞的保护作用。细胞给药时间结束前4h，每孔加20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液。继续培养4h后弃去培养液，每孔加入200μLDMSO，震荡5min后酶标仪490nm处检测吸光度值(OD)，并计算EC50。1.4实验动物制备用脱毛膏脱去小鼠背部毛(范围约3cm×3cm)，放置2～3min，用温水对脱毛区进行清洗并擦干。脱毛后的小鼠正常饲养24h后进行烧伤模型制作，造模前小鼠禁食12h，自由饮水。以250mL玻璃瓶装适量蒸馏水，置于垫有石棉网的铁架台上，石棉网下置酒精灯，将水煮沸，玻璃瓶盖上开一个1.5cm×1.5cm的口，不同室温下多次测量瓶口蒸汽温度为92℃。将麻醉好的小鼠已脱去毛的背部皮肤置于蒸馏水已沸腾的玻璃瓶瓶口，使小鼠皮肤紧贴瓶口以密封，避免水蒸气泄漏，以秒表计时，每只小鼠烫8s(病理切片证实为深II度)，随后腹腔注射生理盐水抗休克。1.5实验分组及给药全部小鼠随机分为正常对照组，模型组，阳性药物组，鹿茸蛋白提取物组：对照组(Control)：每日定时在小鼠裸露背部涂抹适量凡士林/甘油，连续12d；模型组(Model)：每日定时在小鼠烧伤背部涂抹适量凡士林/甘油，连续12d；阳性药组(重组人表皮生长因子rhEGF)：每日定时在小鼠烧伤背部喷湿重组人表皮生长因子约200IU，连续12d。鹿茸蛋白提取物组(PAE)：鹿茸蛋白提取物2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml的浓度溶于凡士林/甘油。每日定时在小鼠烧伤背部涂抹鹿茸连续12d。1.6创面愈合率各组小鼠均于烧伤后的第1～12d分别用数码照相机拍照，用IPP软件计算创面面积大小并按下列公式计算愈合率：1.7病理形态检查于给药12d后取材。小鼠摘眼球取血，脱颈处死，剪取各组小鼠皮肤。血液室温静置后，离心取上清(3500rpm，10min)存于-80℃低温冰箱待用。部分皮肤固定于10％甲醛溶液中用于制备石蜡切片，每组切厚度分别为6um，进行苏木精-伊红(HematoxylinandEeosin，HE)染色。2结果2.1鹿茸蛋白促细胞增殖作用热处理对HaCaT胞造成损伤细胞生长率下降。当7.8125μg/mL的鹿茸蛋白提取物孵育24h后即可可显著提高热处理后HaCaT细胞的生存率(图2)，其EC50为18.523μg/mL。鹿茸蛋白提取物作用于正常HaCaT细胞，在一定浓度范围内可显著促进细胞生长，其最低有效浓度为31.25μg/mL(图3)。2.2创面愈合率无论是以甘油为辅料还是以凡士林为辅料，给予鹿茸蛋白提取物外用12天后，高剂量组能显著促进创面的愈合，缩小创面面积，见图4。甘油组创面愈合率见表29，凡士林组见表30，相关趋势线分别见图5、图6。表29：给予鹿茸蛋白12d后创面愈合率对比(甘油组)表30：给予鹿茸蛋白12d后创面愈合率对比(凡士林组)2.3病理观察模型组表现为表皮结构不完整坏死及炎性渗出，部分创面有表皮覆盖，胶原纤维束较少；各用药组表现为表皮结构基本完整，可见创面部分或完全被表皮覆盖，胶原纤维及纤维细胞数量明显多于模型组，肉芽组织形成，毛囊增生，如图7。总之，上述实验结果表明无论是将本发明的鹿茸蛋白提取物直接作用于正常HaCaT细胞还是烫伤的HaCaT细胞均有明显的促增殖作用，提示在部分损伤的细胞群体中对正常细胞的促增值作用可能是鹿茸保护皮肤愈合的可能途径。外用鹿茸蛋白提取物可以显著促进创面的愈合，缩小创面面积，提示鹿茸中可能具有透皮吸收的蛋白发挥其活性作用。不同实验表明，鹿茸提取物有促进创面愈合，促进皮肤再生的药理作用，本发明已特定地参考本发明的优选实施方案进行了详细描述，但是应当理解，在本发明的精神和范围内可实现变化和修改。因此，本发明所公开的实施方案在所有方面均应视为说明性而非限制性的。本发明的范围由所附权利要求书指定，且落入其等同形式的含义和范围内的所有改变均欲涵盖在本发明的范围内。当前第1页1 2 3