低铁饱和度牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药物中的应用的制作方法

本发明涉及胃病药物
技术领域：
，具体是一种低铁饱和度牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药物中的应用。
背景技术：
：目前对幽门螺杆菌的治疗多选用抗生素。但是长期使用抗生素容易引起细菌对其产生耐药性。因此研制一种高效杀灭耐药性幽门螺杆菌制剂，成为当务之急。乳铁蛋白具有抗微生物活性是由于它具有结合对于某些细菌生长必需的铁的能力。一些研究者(Bishop等，1977；Payne等，1990)的研究证实乳铁蛋白的抗微生物活性依赖于它的铁饱和度。Batish等人(1988)还发现低铁饱和度乳铁蛋白的抗菌活性比高铁饱和度乳铁蛋白的抗菌活性高。中国专利CN200510095244.3公开了一种从牛奶或者乳清水中提取与制备高纯度乳铁蛋白的方法，其中制备的乳铁蛋白纯度虽然较高，但是由于奶源的产地不同，比如奶牛的品种、饲养地以及所用饲料均存在一定的区别，因此导致牛奶中乳铁蛋白的铁饱和度具有较大的随机性，难以满足其标准化、规模化应用的需要。为拓宽乳铁蛋白应用，为了保证功效的一致性，需要乳铁蛋白保持稳定一致的饱和度；目前将铁饱和度保持一致的高饱和度可以通过加入铁离子的方式；但是在抗菌类药物的生产过程中为了保证功效的稳定性，需要乳铁蛋白保持稳定一致的低铁饱和度，从而实现药物的标准化、规模化生产；但是目前还未见将乳铁蛋白实现一致低铁饱和度的生产工艺，导致药物抗菌活性未能达到最佳效果；因此，如何实现乳铁蛋白低铁饱和度，满足其做为药品原料标准化的要求，也成为亟待解决的问题。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种低铁饱和度牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药物中的应用，其首要目的将低饱和度牛乳铁蛋白用于胃病药物中能够有效抑制幽门螺旋杆菌；同时本发明还提供一种低铁饱和度牛乳铁蛋白生产工艺，保证所获得的低铁饱和度的乳铁蛋白铁饱和度的一致性，从而实现药物的标准化、规模化生产。低铁饱和度牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药物中的应用，所述低铁饱和度牛乳铁蛋白为铁饱和度＜15％的牛乳铁蛋白。优选铁饱和度6％～8％的牛乳铁蛋白。所述胃病包括急慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜脱落以及胃酸度过高。所述低铁饱和度乳铁蛋白的制备步骤为：第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解析；所述解析过程是采用二级解析，第一级解析是采用1～2.5％的盐溶液解析，解析液是乳过氧化物酶蛋白，弃去；第二级解析是采用3.5～7％的盐溶液解析，解析液送入第2步处理；所述的盐溶液是指钠盐、钾盐或者钙盐溶液；第2步，对第1步得到的解析液采用分离膜进行浓缩；所述的分离膜是截留分子量在1000～30K的超滤膜；第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂进行吸附，再采用分离膜对浓缩液进行浓缩；所述吸附操作时需要在浓缩液中加入醋酸、醋酸盐以及枸橼酸盐，配制其吸附环境中枸橼酸盐浓度为0.1mol/L～0.5mol/L,并调节pH至5.0～6.7；所述的分离膜是截留分子量在1000～30K的超滤膜。进一步的，所述的第2步得到的浓缩液在送入第3步之前，可再经过一次弱酸型阳离子树脂的吸附、解附和超滤膜的浓缩处理；所述的弱酸型阳离子树脂是指CM树脂。进一步的，所述第2步得到浓缩液在进入第3步之前可以加入氯化钠，使氯化钠的浓度达到5～10g/L，再用截留分子量范围是200000～400000的超滤膜对浓缩液进行过滤。进一步的，所述的第3步中，所述的不溶性Fe3+螯合树脂是指D403螯合树脂；树脂的吸附时间20～120分钟，吸附时搅拌桨转速速率为20～150rpm，吸附温度在3～30℃。进一步的，所述的第3步中不溶性Fe3+螯合树脂可以选择由以下方法制备的螯合树脂，包括如下步骤：S1，按重量份计，将4～6份的苯酚、60～80份质量浓度在20～30wt％的甲醛水溶液混合，在40～45℃温度范围内进行反应1～5h，再加入5～8份2,2-二羟基丙酸和35～40份乙二醇，搅拌均匀，得到预聚液；S2，在预聚液中再加入35～55重量份液体石蜡和3～5重量份脱水山梨醇油酸酯，升温至60～65℃后搅拌0.5～1h,再加入浓度在30～35wt％的盐酸0.5～0.8重量份和2～4重量份烷羟基硅油，在80～85℃范围内聚合反应1～5h后，过滤分出固体，用乙醇洗涤、烘干之后，得到螯合树脂。以下提供几种基于低铁饱和度牛乳铁蛋白的治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药物：第一种，其组成包括6％～8％铁饱和度牛乳铁蛋白80-200mg、雷贝拉唑10-20mg、克拉霉素300-500mg、替硝唑300-500mg。第二种，其组成包括6％～8％铁饱和度牛乳铁蛋白80-200mg、奥美拉唑100-200mg、阿莫西林200-500mg。第二种，其组成包括6％～8％铁饱和度牛乳铁蛋白10％、碳酸氢钠10％、碳酸钠30％、柠檬酸38％、氯化钠2.4％、赋形剂9.6％。本发明以生鲜乳、乳清粉为原料提取与制备低铁饱和度乳铁蛋白，其能够作为治疗急慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜脱落和胃酸度过高的药物、辅助用药及保健食品的有效成分，疗效显著并且而无任何副作用。此外，本发明提供的方法具有乳铁蛋白提取与制备纯度高的优点，同时能够降低乳铁蛋白中Fe3+离子含量，使铁饱和度降低至6-8％，从而明显提高了乳铁蛋白的抗菌活性。此外通过调整Fe3+螯合树脂吸附的时间、搅拌速度以及媒介的浓度、pH，可以对乳铁蛋白处理后的铁饱和度进行控制，以满足不同产品应用对乳铁蛋白铁饱和度的要求。附图说明图1是NaHCO3浓度对抑菌活性的影响的曲线图。具体实施方式实施例1以下通过分组实验对牛乳铁蛋白的作用机理进行研究。一、牛乳铁蛋白对耐药幽门螺旋杆菌(HP)的体外抗菌试验(一)试验目的本实验指在对牛乳铁蛋白进行体外抗耐药幽门螺旋杆菌活性评价,并与丽珠集团丽珠制药厂生产的丽珠得乐(铋剂)进行比较,以正确评价和开发利用牛乳铁蛋白的抗菌功效。(二)受试药品1、试验品:7％铁饱和度牛乳铁蛋白(LF),总蛋白合量97％,LF纯度96％。2、对照品:铋剂(丽珠得乐),由丽珠集团丽珠制药厂生产,每克药含铋剂110mg。3、对照品:14％铁饱和度牛乳铁蛋白，LF纯度96％；20％铁饱和度牛乳铁蛋白，LF纯度96％。(三)细菌:所试细菌为30株幽门螺旋杆菌临床分离株,均为近年来从患者新鲜胃黏膜检材中分离获得,并经尿素酶试验,革兰染色镜检等方法鉴定证实，其中6株幽门螺旋杆菌为临床耐药株。(四)培养基:采用HP培养基和布氏肉汤。(五)药物配制1、牛乳铁蛋白配制将牛乳铁蛋白直接用无菌HP培养基配制成一系列不同浓度的含药平皿。2、铋剂先用蒸馏水将铋剂溶解,再用灭菌的培养基作一系列倍比稀释使制成含不同浓度的药物平皿。(六)试验方法1、最小抑菌浓度(MIC):不同铁饱和度LF的HP培养基平板(浓度32μg/mg～0.125μg/mg)。将30株幽门螺旋杆菌(其中包括6株临床耐药性HP菌株)培养物分成A、B两批(每批15株),各用布氏肉汤配制成浓度为1x106/ml的菌液。以内径为2mm的接种环挑取1环菌液划线接种到不同浓度药物平板的表面,同时接种不含药物的平板上作为对照,划线长度为1cm左右。于37℃微需氧环境中培养48h后观察细菌生长情况。以无细菌生长平皿中所含药物最小的浓度作为最小抑菌旅度(MIC)。结果见表1-1,表1-2。表1-1不同铁饱和度牛乳铁蛋白及铋剂对HP菌株的MIC表1-27％铁饱和度牛乳铁蛋白对临床耐药HP菌株的MIC菌种名(菌株数)药物MIC范围幽门螺旋杆菌(30)7％铁饱和度牛LF0.5625～3mg/ml2、杀菌曲线(1)将0.1ml浓度为106/ml的HP菌液,分别加入铁饱和度为20％、14％、7％牛乳铁蛋白浓度为(2.5mg/ml,5mg/ml,10mg/ml)的溶液中,混匀,于37℃的摇床中培养,分别于0.5h、1h、1.5h和2h时吸取0.1ml样品涂布于HP培养基平板表面,37℃微氧环境中孵育48h后计数活菌数,并绘制出时间—杀菌曲线。(2)将0.1ml浓度为106/ml的HP菌液加入0.9ml含4μg的铋剂溶液中,按上法同样绘制出铋剂的时间—杀菌曲线作为已知药物的对照试验。不同铁饱和度牛LF及铋剂在各时间计数活菌数的对数值见表2。表2不同铁饱和度牛LF及铋剂在各时间计数活菌数的对数值3、培养条件对MIC的影响(1)pH值对MIC的影响将各浓度的含药培养基的HP分别调整至5、7、9三种状态,测定该药物平板对2株HP试验菌株的MIC变化,结果见表3表3不同PH值对MIC的影响(2)细菌接种量对MIC的影响在其他条件不变的前提下,改变细菌接种量(103、106、109/ml比较不同菌量对MIC的影响,结果见表4。表4细菌接种量对MIC的影响接种菌量牛乳铁蛋白MIC(mg/m1)铋剂MIC(μg/m1)103/ml0.56251106/ml1.52109/ml32(3)NaHCO3浓度对抑菌活性的影响将铁饱和度为20％、14％、7％的blf溶于NaHCO3溶液中,blf浓度为2.5mg/ml,测定对H.pylori的抑菌圈直径，结果见图1。图1表明HCO3-的浓度为100mmol/L时，产生的抑菌圈直径几乎是对照组的1.7～2.2倍。这与HCO3-的浓度增加会提高blf铁结合能力有一定关系。二、牛乳铁蛋白对幽门螺旋杆菌感染动物的治疗实验(一)材料与方法:1、实验动物:蒙古沙鼠,体重160±10g,月龄2～3与雌雄兼用,健康无腹泻,分笼普通饲料喂养。2、实验药物:(1)8％铁饱和度牛乳铁蛋白；(2)食醋,恒顺牌镇江陈醋,瓶装500ml,PH:4～5(3)丽珠得乐(铋剂),由丽珠集团丽珠制药厂生产,每克药含铋剂110mg。(4)安必仙,香港联邦制药厂生产。3、实验方法:(1)脾虚大鼠幽门螺旋杆菌感染模型的复制参考彭氏法加以改良,造模大鼠每天空腹灌胃食醋2ml/100g,形成嗜酸偏食,共10天,单日禁食,双日不限食,自由饮水,形成饥饱失常,以致饮食不节。第11天采用空腹束缚水浴(温室29±15℃,水温23士0.5℃)6小时形成倦冷刺激,使大鼠在上述因素共同作用下产生脾虚症侯。第12天起空腹灌胃1x109cfu/ml的HP混悬液,剂量1.5ml/隔日一次,共三次,并继续隔日禁食饲。(2)实验分组大鼠随机分为10组:①不用药脾虚感染组,每日冷开水4ml灌胃。②阳性用药对照I组用丽珠得乐治疗10天,阳性II组用安必仙治疗3天。③Lf治疗分A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组、H组共八组。(3)方法第17天予以治疗用药,脾虚感染组喂蒸馏水。阳性对照I组喂丽珠得乐0.35g/kg,阳性II组用安必仙0.53g/kg,7％铁饱和度牛乳铁蛋白大剂量A组2.0g/kg鼠,中剂量B组0.45g/kg鼠,小剂量C组0.05g/kg,连续用药10天。D组0.45g/kg鼠,用药3天,E组0.45g/kg鼠,用药5天,F组0.45g/kg,用药7天,G组0.45g/kg,用药10天,H组0.45g/kg,用药15天阳性对照II组治疗3天后处死,取胃黏膜组织作检查。(4)检测指标:1、HP培养:大鼠胃黏膜活检标本45份,分别取自大鼠胃窦部,将大鼠胃黏膜组织放入20％GS运用液中,4℃3h内送至实验室,将灭菌组织黏膜研成匀浆,涂布于ECY培养基,在微需氧环境中37℃培养3-6天,3日后逐日观察菌落。其可疑菌落作涂片染色、镜检,并作快速尿素酶试验,如具有典型的菌、菌体形态和染色特征,快速尿素酶试验阳性者鉴定为HP。2、快速尿素酶试验。3、常规HE染色观察组织形态学变化。4、W-S银染观察HP感染程度,HP检查按Marshal1标准分级。5、电镜观察胃黏膜修复及HP感染情况。(二)结果:1、各检测方法对幽门螺旋杆菌的检出情况,见表5表5各组HP检出情况2、常规HE染色观察组织形态学变化。主要观察胃黏膜炎症反应。炎症细胞以淋巴细胞及嗜酸性细胞为主,多分布于胃黏膜的底部及胃黏膜下层结缔组织中,以炎症细胞的数量为标准,将炎症分为四级,“0”,为基本无炎症细胞出现,“1”可见少量炎症细胞,“2”为中等炎症细胞,“3”可见大量炎症细胞。结果见表6表6HE染色观察炎症情况表**P<0.01，*P<0.053、鼠胃黏膜电镜观察:高剂量组(0.5g/ml)电镜下可见黏膜上皮结构完整,微绒毛可见,内质网清晰、丰富,分泌颗粒丰富。中剂量组(0.11g/ml)电镜下可见黏膜上皮结构基本完整,微线毛可见,分泌颗粒较多。低剂量组(0.01g/ml)电镜下可见大部分黏膜上皮结构完整,微线毛可见,分泌颗粒较少。阳性对照组电镜下可见表层黏膜上皮细胞结构完整,微绒毛可见,充满分泌颗粒。模型组电镜下可见大部分表层黏膜上皮细胞坏死,不完整,微绒毛较少,分泌颗粒少。(三)、结论牛乳铁蛋白对HP有一定的抑制作用,同时对由HP引起的胃粘膜损伤有修复作用。三、牛乳铁蛋白对感染幽门螺旋杆菌小鼠的治疗研究(一)材料与方法:1、实验动物:C57BL/6小鼠,体重17士20g,7周龄,均为雌性,健康无腹泻,分笼普通饲料喂养。2、实验药物:(1)7％铁饱和度牛乳铁蛋白。(2)丽珠得乐(铋剂),由丽珠集团丽珠制药厂生产,每克药含铋剂110mg。(3)菌株:HP菌株由浙大医学院提供。3、实验方法:所有动物灌胃前禁食12小时,将用布氏肉汤洗脱的HP菌灌胃小鼠,0.4ml/只(约109/m1),连续5次,1周完成；从最后一次灌胃HP液计算，4周以后喂牛乳铁蛋白,小鼠分大剂量组(0.1875g/kg体重),中剂量组(0.0938g/kg体重)、低剂量(0.0469g/kg体重),丽珠得乐对照组(0.148g/kg体重),模型组,每组10只，共给药10天。末次给药后一天,处死小鼠,取胃黏膜组织,HE染色和W-S银染观察HP感染程度,同时进行尿素酶试验及HP培养(取小鼠胃黏膜标本,置于标本保存液中-70℃保存。取标本于研磨器中,滴加约0.2ml的标本研磨液进行研磨,将研磨液涂布在ECY选择性培养基上,5％02,15％C02,8.0％N2,微需氧培养5天,观察菌落形态,典型的HP菌落形态为针尖样大小,无色透明,表面光滑,湿润,有光泽,挑取部分细菌进行快速尿素酶实验和革兰氏染色镜检,典型HP应为快速尿素酶实验强阳性,镜检为革兰氏阴性,形态呈飞鸟状或螺旋杆状)(二)结果:1、各检测方法对幽门螺旋杆菌的检出情况,见表7表7各检测方法对幽门螺旋杆菌的检出情况(三)结论牛乳铁蛋白对C57BL/6小鼠感染的HP有一定的抑制作用。其中的细菌学检(查阳性率)和尿素酶阳性率结果与丽珠得乐的结果还低10个百分点。四、牛乳铁蛋白对水浸应激性胃溃疡动物模型的影响(一)试验目的:研究牛乳铁蛋白对水浸大鼠应激性胃溃疡的影响。(二)药物和实验方法1、7％铁饱和度牛乳铁蛋白。2、丽珠得乐(铋剂)，由丽珠集团丽珠制药厂生产,每克药含铋剂110mg。3、动物SD大鼠,体重(200～250g),雌雄各半，由渐江省中医药研究院动物房提供。4、试验方法:取SD大鼠50只,体重(200～250g),雌雄各半,随机分为5组,10只/组,设立空白对照,三个剂量的牛乳铁蛋白组(1.4g/kg,0.7g/kg,0.28g/kg)和丽珠得乐阳性对照组(0.8g/kg),喂药十天后,禁食24h,自由饮水,然后将动物装入特制笼内,垂直浸入23±0.5℃水中。浸入深度平动物剑突水平，24h后取出，颈椎脱位处死。打开腹腔,结扎胃贲门和幽门并经胃壁向胃腔内注入1％的甲醛溶液8m1,将胃取出浸入甲醛溶液中,30分钟后沿胃大弯剖开,计数腺胃部出现的溃疡点数及溃疡指数。解剖显微镜下测量胃黏膜损伤长度(mm),以其总和作为溃疡指数,在组间进行比较。5、统计方法实验数据表示为平均值±标准差组间差异的显著性用t一检验进行。(三)、试验结果结果表明,牛乳铁蛋白0.7g/kg、2.8g/kg能明显降低大鼠的溃疡指数。与空白组比较,有显著差异(P<o.o5或P<o.o1)。结果见表8表8牛乳铁蛋白对水浴应激致大鼠急性胃黏膜损伤的影响(X±s,N＝10)**P<0.01,*P<0.05,与空白对照组比较(四)、结论本试验采用水浸应激致大鼠急性胃黏膜损伤,以胃黏膜损伤长度为指标,研究牛乳铁蛋白对水浸应激致大鼠胃黏膜损伤的影响。结果表明,牛乳铁蛋白能降低大鼠的溃疡指数(降低78％,比丽珠得乐高48％,),抑制率在28-78％之问,比丽珠得乐的抑制率多高出20个百分点。牛乳铁蛋自能降低大鼠胃黏膜损伤长度,对水漫应激致大鼠急性胃黏膜损伤有一定的保护作用。五、牛乳铁蛋白对乙酸灼烧致大鼠胃溃疡的影响。(一)试验目的研究牛乳铁蛋白对乙酸灼烧致大鼠胃溃疡的影响。(二)药物1、7％铁饱和度牛乳铁蛋白。2、丽珠得乐(铋剂),由丽珠集团丽珠制药厂生产,每克药含铋剂110mg。3、胃动素(MTL)试剂盒:由苏州大学医学院血栓研究室提供。4、前列腺素(PEG2)试剂盒:由北京福瑞公司提供。(三)动物:SD大鼠,体重(200～250g),雌雄各半,由渐江省中医药研究院动物房提供。(四)试验方法取SD大鼠50只,体重(200～250g),雌雄各半,试验前禁食24h,自由饮水,在乙醚麻醉下打开腹腔,将内径5mm长30mm的玻璃管垂直放置于胃体部浆膜面上,向管腔内加入冰乙酸0.2m1,1.5分钟后用棉签蘸出冰乙酸,缝合手术切口。术后正常饮食,第二天随机分为5组,10只/组,设立空白对照,三个剂量的牛乳铁蛋白组(1.4g/kg,0.7g/kg,0.28g/kg)和丽珠得乐阳性对照组(0.8g/kg),连续喂药十天。解剖取出胃,并用甲醛固定,测量溃疡面积(rhm2),各组间进行比较。同时取血,分离血清,测胃动素(MTL)及前列腺素(PGE2)。(五)、统计方法实验数据表示为平均值±标准差组间差异的显著性用t一检验进行。(六)、试验结果结果见表9表9牛乳铁蛋白对乙酸的灼烧型溃疡的影响组别剂量(g/kg)动物数(n)溃疡面积抑制率(％)空白模型对照组1041.20±10.01牛乳铁蛋白(1.4g/kg)1013.93±9.7866.19牛乳铁蛋白(0.7g/kg)1026.57±8.1835.51牛乳铁蛋白(0.28g/kg)1035.81±9.6413.08丽珠得乐(0.8g/kg)1029.40±8.1228.64**P<0.01,*P<0.05,与空白对照组比较表10牛乳铁蛋白对乙酸灼烧型大鼠胃动素(MTL)及前列腺素(PGE2)的影响*P<0.05,与空白对照组比较(七)结论本试验采用乙酸灼烧致大鼠胃黏膜损伤,以溃疡面积为指标,研究牛乳铁蛋白对乙酸灼烧致大鼠胃黏膜损伤的影响。结果表明,牛乳铁蛋白能降低大鼠的溃疡指数(降低65％,比丽珠得乐高52％),抑制率在13-66％之间,比丽珠得乐的抑制率高出37个百分点，对乙酸灼烧致大鼠胃黏膜损伤有一定的保护作用。六、牛乳铁蛋白对幽门结扎致大鼠急性胃黏膜损伤的影响(一)试验目的观察牛乳铁蛋白对幽门结扎致大鼠急性胃粘膜损伤的影响。(二)药物1、7％低铁饱和度牛乳铁蛋白。2、丽珠得乐(铋剂)，由丽珠集团丽珠制药厂生产,每克药含铋剂110mg。(三)动物SD大鼠,体重(200～250g),雌雄各半，由浙江省中医药研究院动物房提供。(四)试验方法取SD大鼠50只,体重(200～250g),雌雄各半,随机分为5组,10只/组,设立空白对照,三个剂量的牛乳铁蛋白组(1.4g/kg,0.7g/kg,0.28g/kg)和丽珠得乐阳性对照组(0.8g/kg),喂药十天。禁食36小时,自由饮水,在乙醚麻醉下固定大鼠,沿腹中线剪开一小口,找出胃并结扎幽门。术后18小时解剖胃,向胃腔内注入1％甲醛溶液8m1。将胃浸入1％福尔马林溶液中,10min后,沿胃大弯剪开胃,观察前胃部溃疡的发生情况。溃疡程度的评价,可以计数前胃部溃疡的面积,以其总和作为溃疡指数。也常用okabe法,在解剖显微镜下测量溃疡面积,将每只鼠溃疡面积的总和分为5个等级,作为溃疡指数。根据溃疡指数可进一步计算:溃疡抑制百分比＝(对照组溃疡指数-给药组溃疡指数)/对照组溃疡指数*100％(五)统计方法实验数据表示为平均值±标准差组间差异的显著性用t一检验进行。(六)试验结果结果见表11表11牛乳铁蛋白对幽门结扎溃疡的影响**P<0.01,*P<0.05,与空白对照组比较结论本试验采用幽门结扎致大鼠急性胃黏膜损伤,以溃疡指数为指标,研究牛乳铁蛋白对幽门结扎致大鼠胃黏膜损伤的影响。结果表明,牛乳铁蛋白能降低大鼠的溃疡指数,抑制率在31-51％之问,比丽珠得乐的抑制率多高出12个百分点.对幽门结扎致大鼠急性胃黏膜损伤有一定的保护作用。七、牛乳铁蛋白对乙醇致大鼠胃黏膜损伤的影响(一)实验目的研究牛乳铁蛋白对乙醇致大鼠急性胃黏膜损伤的影响。(二)药物1、7％铁饱和度牛乳铁蛋白,临用前将牛乳铁蛋白用蒸馏水配成0.14g/ml,0.07g/m1,0.028g/m1的浓度,大鼠ig(灌胃)上述溶液1ml/100g。相当于人临床用药15g,7.5g,3g。2、丽珠得乐:由丽珠集团丽珠制药厂生产,临用前用蒸馏水配制,2包加水25ml,每100g大鼠灌胃1ml。(三)动物:SD大鼠,体重(200±20)g,雌雄兼用,由浙江省中医药研究院动物房提供。(四)实验方法取SD大鼠50只,体重(200±20)g,雌雄兼用,随机分成5组,10只/组,设立空白对照组,三个剂量的牛乳铁蛋白组(1.4g,0.7g,0.28g)和丽珠得乐组阳性对照组(0.8g/kg)连续喂药10天,末次给药后,禁食48小时,自由饮水,实验时灌服无水乙醇(1ml/只),一小时后解剖取胃,以1％的甲醛溶液固定。损伤程度以溃疡指数表示。条索状损伤的长度大于1mm者测量其长度,每mm计1分,若其宽度大于1mm者将其分加倍,计分总数为该动物的:溃疡指数,各组间进行比较。(五)统计方法实验数据表示为平均值±标准差组间差异的显著性用t一检验进行。(六)试验结果结果见表12表12牛乳铁蛋白对乙醇型溃疡的影响**P<0.01,*P<0.05,与空自对照组比较(七)结论本试验用乙醇致大鼠急性胃黏膜损伤,以溃疡指数为指标,研究牛乳铁蛋白对乙醇致大鼠胃黏膜损伤的影响。结果表明,牛乳铁蛋白能降低大鼠的溃疡指数,比丽珠得乐降低大鼠的溃疡指数还多15％,比丽珠得乐的抑制率多高出10个百分点，对乙醇致大鼠急性胃黏膜损伤有一定的保护作用。八、牛乳铁蛋白对大鼠胃液分泌的影响(-)实验目的:观察牛乳铁蛋白对大鼠胃液量、胃液酸度和胃蛋白的影响。(二)药物7％铁饱和度牛乳铁蛋白。阳性对照药:丽珠得乐(铋剂)由丽珠集团丽珠制药厂生产,每克药含铋剂110mg。(三)动物SD大鼠,体重(200士20)g,雌雄兼用,由浙江省中医药研究院动物房提供。(四)试验方法:把SD大鼠随机分为5组,每组10只,分别设立高剂量组(LF0.28g/200g大鼠)、中剂量组(LF为0.134g/200g大鼠)、低剂量(LF为0.056g/200g大鼠),空白对照组(LF为0.053g/200g大鼠)、阳性对照(折合人剂量,每日4包)、空白对照组(喂蒸馏水),连续喂药10天,末次给药后均禁食24小时，不禁水。在乙醚麻醉下,沿腹正中线剪开小口,轻轻找出胃,结扎幽门,缝合腹壁切口,4～6小时后拆线找开腹腔结扎贲门,摘取全胃,用滤纸擦净血迹,沿大弯侧剪开胃腔,倾出胃内容物收集于刻度离心管中,记录胃液量,再以1,000-2,000g离心约5分钟,去除食物残渣等胃内容物(以酸度计测胃液的酸度)用酸碱滴定法测胃液总酸度。利用胃蛋白酶分解血红蛋白生成酪氨酸,再用酚红试剂的显色反应测定酪氨酸的量,从而间接计算胃蛋白酶的活性。胃液总酸度的测定:取上清胃液1ml,加酚红指示剂1滴,用0.0lmol/L的NaoH滴定,直至胃液先呈黄色后转为红色2秒内不消失为终点,记录用去NaoH溶液量。总酸度mmo1/L＝耗去的NaoH溶液量。(2)胃蛋白酶活性测定取上清胃液0.1ml,加入1％牛血清白蛋白(0.1NHCL配制)1ml37℃温孵20分钟,加入2％三氯乙酸,并在沸水中加热5分钟,冷却后过滤.。取滤出液0.2ml,加入0.8m10.125NNa2C03,溶液,同时加入Folin-Ciocalte试剂(5ml甲液和0.5ml乙液),混匀后静置30分钟后比色(700mn)。以酪氨酸标准曲线计算胃蛋白酶活性。以mmol/h酪氨酸表示胃蛋白酶排出量。(五)、结果结果见表13结果表明,牛乳铁蛋白能抑制大鼠胃液分泌,抑制胃液酸度。表13牛乳铁蛋白对胃液的影响(六)、结论结果显示,1.4g/kg牛乳铁蛋白能抑制大鼠胃液分泌,减少胃液酸度。其中低剂量组(0.23g/kg)与空白对照组相比,能降低胃液36％,降低胃总酸度12％。以下提供一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白(即实施例1中所用的低铁饱和度乳铁蛋白)的方法，它分别用放置阳离子交换树脂的搅拌罐来吸附、解附牛乳中乳铁蛋白，并辅以膜分离技术将其分离、浓缩，可以实现对乳铁蛋白的高度纯化；接下来，将所得乳铁蛋白浓缩液放置不溶性Fe3+螯合树脂(如D403螯合等系列树脂)的搅拌罐来吸附铁离子使其失去铁离子变为不饱和状态，并辅以膜分离将其浓缩纯化。在使用阳离子交换树脂对乳铁蛋白进行吸附、解析时，搅拌罐可调搅拌桨转速速率为20～100rpm；罐内侧壁有增涡流挡板，罐底设置带过滤板的树脂床，在树脂床上的树脂层上方8～12cm高度处设置快速导流抽滤管。罐内设置供自动控制的各种传感器pH计，重量计，电导率计及温度计，罐内液体保温温度为3～60℃。乳铁蛋白吸附树脂为阳离子交换树脂，树脂吸附解附的次数和条件可以根据不同产品和产品纯度的要求设定；树脂的吸附时间为20～120分钟，吸附温度在3～30℃。树脂的解附采用两级盐浓度分别解附乳过氧化物酶蛋白、乳铁蛋白。第一级盐浓度为1～2.5％，解附乳过氧化物酶蛋白，解附时间为20～120分钟；第二级盐浓度为3.5～7％，解附乳铁蛋白，解附时间为20～120分钟；解附的搅拌速率为20～150rpm。树脂解附的时间为20～120分钟，树脂解附所用的盐为钠盐、钾盐、钙盐；乳铁蛋白解附液通过0.05～1.4微米的微滤膜将乳铁蛋白解附液除菌，去残余的脂肪与其他小颗粒；再用1K～50K分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。在一个实施方式中，为了提高乳铁蛋白的纯度，可以对经上述工艺吸附解附脱盐浓缩的乳铁蛋白浓液再经过一次弱酸型阳离子树脂(如CM树脂)的吸附、解附和超滤膜的浓缩获得的。在一个实施方式中，所述第2步得到浓缩液在进入第3步之前加入氯化钠，使氯化钠的浓度达到5～10g/L，再用截留分子量范围是200000～400000的超滤膜对浓缩液进行过滤。上述得到的浓缩液再放置于不溶性Fe3+螯合树脂如D403螯合树脂，加入醋酸溶液、醋酸盐、枸橼酸盐作为媒介，配制其吸附环境浓度为0.05mol/L～1.0mol/L，调pH4.0～6.7，加以搅拌吸附乳铁蛋白中铁离子，树脂吸附搅拌时间、媒介浓度、转速、pH可根据产品对铁饱和度的要求设定(经实验测定，吸附时间对铁饱和度影响最大，拟取10～150分钟)；树脂的吸附时间10～150分钟，搅拌桨转速速率为10～150rpm，吸附温度在3～30℃。吸附后清液用1K-50K分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。将乳铁蛋白浓液进行真空冷冻干燥制成冻干粉。树脂经吸附工艺过程后，所吸附的铁离子用1mol/L～3mol/L盐酸浸泡即可将树脂解附再生，再用RO水冲洗即可供下一批次吸附之用。实施例2阳离子交换树脂的制备本发明所使用的阳离子交换树脂可以通过如下的方法制备得到：第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体(PS-acyl-Cl)，加入60ml四氢呋喃溶胀12h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比(PS-acyl-Cl)：乙二胺(EDA)：碳酸氢钠为1：8：0.7，依次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80℃下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂芯漏斗中，用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体；第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12h后，加入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸(AMPS)16g、N-丁氧基甲基丙烯酰胺(NBMA)3g、丙烯酸双环戊烯基酯(DCPA)、K2CO35g、四丁基溴化铵(TBAB)12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物转移至沙芯漏斗中，用5wt％的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。实施例3阳离子交换树脂的制备与实施例3的区别在于第2步中未加入NBMA。本发明所使用的阳离子交换树脂可以通过如下的方法制备得到：第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体(PS-acyl-Cl)，加入60ml四氢呋喃溶胀12h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比(PS-acyl-Cl)：乙二胺(EDA)：碳酸氢钠为1：8：0.7，依次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80℃下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂芯漏斗中，用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体；第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12h后，加入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸(AMPS)16g、丙烯酸双环戊烯基酯(DCPA)、K2CO35g、四丁基溴化铵(TBAB)12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物转移至沙芯漏斗中，用5wt％的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。实施例4乳铁蛋白的吸附、解附试验配备3份100ml1.6wt％乳铁蛋白溶液于250ml烧杯中，各取20μl进高效液相色谱仪检测，峰面积分别为1240.0034(万)、1241.6533(万)和1240.0535(万)，分别将100gSPC70树脂、实施例1和实施例2中的阳离子交换树脂分别100g置于上述盛有250ml乳铁蛋白溶液的烧杯中，吸附搅拌速率为60rpm，每10min取样一次进行检测，实验数据如下表看出实施例4和5中阳离子树脂提高生产回收率，改善吸附解附所消耗的时间。另外，再经过盐溶液淋洗、解附后计算蛋白含量。淋洗、解附的操作是：采用两级盐浓度分别解附乳过氧化物酶蛋白、乳铁蛋白。第一级盐浓度为1.5％，采用的是NaCl水溶液，解附乳过氧化物酶蛋白，解附时间为70分钟；第二级盐浓度为5.0％，采用的是NaCl水溶液，解附乳铁蛋白，解附时间为80分钟；解附的搅拌速率为100rpm。乳铁蛋白解附液通过0.2微米的微滤膜将乳铁蛋白解附液除菌，去残余的脂肪与其他小颗粒；再用2000分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。从上表可以看出，采用SPC70树脂、实施例2和实施例3中的阳离子交换树脂都可以较好地获得乳铁蛋白的吸附、解附效果，不过回收率上还是有所区别。实施例5乳铁蛋白的提取与制备试验半脱脂牛奶1890L，pH6.7，总蛋白为3.38g/L，乳铁蛋白浓度为126mg/L，将SPC70树脂加入搅拌罐，吸附80min，搅拌速率为60rpm，收集已吸附后的牛奶并用RO水冲洗树脂，加入第一级100L2.5％NaCl水溶液解附40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集；加入第二级100L5.5％NaCl水溶液解附40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集树脂3次。第二级的解吸液以及第二次RO淋洗液合并收集共180L，输送到0.8μm的微滤膜设备中进行除菌、除杂；用30K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，取样检测其铁饱和度为20％；将乳铁蛋白浓液输入到装有CM树脂罐中除去杂蛋白，收集已吸附杂蛋白后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，将其中的少量浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0％，灰分1.1％，总蛋白为96.3％，铁饱和度20％；再将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进行脱铁，加入0.1mol/L枸橼酸盐，并醋酸-醋酸钠缓冲液调pH至6.0，加以搅拌吸附铁离子，树脂吸附时间120分钟，搅拌桨转速速率60rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0％，灰分1.0％，总蛋白为96.3％，铁饱和度7％。实施例6乳铁蛋白的提取与制备试验半脱脂牛奶1890L，pH6.7，总蛋白为3.38g/L，乳铁蛋白浓度为126mg/L，采用实施例2中描述的步骤操作生产阳离子交换树脂，将树脂加入搅拌罐，吸附80min，搅拌速率为60rpm，收集已吸附后的牛奶并用RO水冲洗树脂，加入第一级100L2.5％NaCl水溶液解附40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集；加入第二级100L5.5％NaCl水溶液解附40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集树脂3次。第二级的解吸液以及第二次RO淋洗液合并收集共180L，输送到0.8μm的微滤膜设备中进行除菌、除杂；用30K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，取样检测其铁饱和度为20％；将乳铁蛋白浓液输入到装有CM树脂罐中除去杂蛋白，收集已吸附杂蛋白后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，将其中的少量浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.2％，灰分1.1％，总蛋白为96.7％，铁饱和度20％；再将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进行脱铁，加入0.1mol/L枸橼酸盐，并调pH至6.0，加以搅拌吸附铁离子，树脂吸附时间120分钟，搅拌桨转速速率60rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.1％，灰分1.0％，总蛋白为96.7％，铁饱和度7％。实施例7乳铁蛋白的提取与制备试验与实施例5的区别在于：将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进行脱铁，加入1.0mol/L枸橼酸盐，并醋酸-醋酸钠缓冲液调pH至4.0，加以搅拌吸附铁离子，树脂吸附时间20分钟，搅拌桨转速速率150rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0％，灰分1.0％，总蛋白为96.4％，铁饱和度7％。实施例8乳铁蛋白的提取与制备试验与实施例6的区别在于：将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进行脱铁，加入0.3mol/L枸橼酸盐，并醋酸-醋酸钠缓冲液调pH至6.7，加以搅拌吸附铁离子，树脂吸附时间70分钟，搅拌桨转速速率80rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0％，灰分1.0％，总蛋白为96.5％，铁饱和度8％。实施例9乳铁蛋白的提取与制备试验与实施例6的区别在于：不溶性Fe3+螯合树脂采用如下方法制备的树脂，包括如下步骤：S1，按重量份计，将5份的苯酚、70份质量浓度在25wt％的甲醛水溶液混合，在42℃温度范围内进行反应3h，再加入6份2,2-二羟基丙酸和37份乙二醇，搅拌均匀，得到预聚液；S2，在预聚液中再加入45重量份液体石蜡和4重量份脱水山梨醇油酸酯，升温至62℃后搅拌0.6h,再加入浓度在30wt％的盐酸0.6重量份和3重量份烷羟基硅油，在82℃范围内聚合反应2h后，过滤分出固体，用乙醇洗涤、烘干之后，得到螯合树脂。实施例10乳铁蛋白的提取与制备试验与实施例9的区别在于：不溶性Fe3+螯合树脂吸附前将得到浓缩液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度达到5g/L，再用截留分子量是200000的超滤膜对浓缩液进行过滤，然后进行螯合树脂脱铁。对照例1与实施例10的区别在于：浓缩液中中未加入氯化钠，即得到浓缩液直接用截留分子量是300000的超滤膜对浓缩液进行过滤；然后进行螯合树脂脱铁。对照例2与实施例10的区别在于：第3步中未采用超滤膜进行过滤。即得到浓缩液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度达到5g/L；然后进行螯合树脂脱铁。对照例3与实施例10的区别在于：螯合树脂的制备中，未加入烷羟基硅油改性剂。即不溶性Fe3+螯合树脂的制备方法，包括如下步骤：S1，按重量份计，将5份的苯酚、70份质量浓度在25wt％的甲醛水溶液混合，在42℃温度范围内进行反应3h，再加入6份2,2-二羟基丙酸和37份乙二醇，搅拌均匀，得到预聚液；S2，在预聚液中再加入45重量份液体石蜡和4重量份脱水山梨醇油酸酯，升温至62℃后搅拌0.6h,再加入浓度在30wt％以上的盐酸0.6重量份，在82℃范围内聚合反应2h后，过滤分出固体，用乙醇洗涤、烘干之后，得到螯合树脂。以上各实施例最终所得到的粉末的检测指标如下：从上表中可以看出，实施例10提供的方法具有更高的吸附收率和蛋白的纯度，通过实施例10和对照例1对比可以看出，通过加盐变性之后，可以有效地去使一部分影响到吸附过程的蛋白发生变性，进而被超滤去除；实施例9和对照例2对比可以看出，通过加盐之后未采用超滤过滤仍然无法将这部分蛋白的影响去除，仍然会导致吸附步骤中的回收率偏低；实施例9和对照例3对比可以看出，通过在螯合树脂的制备中加入烷羟基硅油改性剂，可以提高对蛋白的排斥力，避免乳铁蛋白被吸附。本发明提供的方法具有乳铁蛋白提取与制备纯度高的优点，同时能够降低乳铁蛋白中Fe3+离子含量，使铁饱和度降低至6-8％，从而明显提高了乳铁蛋白的抗菌活性。此外通过调整Fe3+螯合树脂吸附的时间、搅拌速度以及媒介的浓度、pH，可以对乳铁蛋白处理后的铁饱和度进行控制，以满足不同产品应用对乳铁蛋白铁饱和度的要求。实施例11一种治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药物，其组成包括6％～8％铁饱和度牛乳铁蛋白140mg、雷贝拉唑15mg、克拉霉素400mg、替硝唑400mg。实施例12一种治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药物，其组成包括6％～8％铁饱和度牛乳铁蛋白140mg、奥美拉唑150mg、阿莫西林350mg。实施例13一种治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药物，其组成包括6％～8％铁饱和度牛乳铁蛋白10％、碳酸氢钠10％、碳酸钠30％、柠檬酸38％、氯化钠2.4％、赋形剂9.6％。以下是实施例11-13这三种药物3天、5天、7天、15天的治疗wistar大鼠效果数据，以证明上述三种药物在治疗胃病上的疗效。当前第1页1 2 3