一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物及其制备方法与流程

本发明属于中药复方领域，涉及一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物及其制备方法。

背景技术：

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是靠传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种急性的高度接触性呼吸道传染病，因传染性支气管炎早期仅见鸡感染，所以叫鸡传染性支气管炎。临床表现为咳嗽、打喷嚏、肾脏损害、产蛋数量减少、蛋品质下降等。鸡传染性支气管炎病毒具有变异速度快、血清型复杂，疾病临床差异比较大的特点。该病可以感染任何时期的鸡，导致生长延缓、体重减轻和死亡，引起霉形体混合感染及大肠杆菌病等继发性感染，增加鸡群死亡数量，给养殖场带来严重的损失。目前对于鸡传染性支气管炎尚无有效的治疗方法，主要采用预防免疫手段来保护鸡群，但由于该病毒血清类型较多，临床疫苗免疫时有失败，且病毒常会产生新的变异株，造成疫苗免疫失败风险高，对IB预防效果差，加之抗生素容易产生耐药性，易残留等。对于临床发病鸡群目前主要采用对症治疗，传统中药主要是粉散剂，制剂工艺简单，产品可控性较差，临床使用效果时好时坏。鸡传染性支气管炎主要分为呼吸型和肾脏型，但感染前期主要是呼吸型，随着病程的延长，逐渐发展成肾脏型等。因此，针对鸡传染性支气管炎的治疗前期控制较为关键。因此迫切需要一个安全、有效的治疗药物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种防治效果显著、不影响产蛋的防治鸡传染性支气管炎的中药组合物及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，其特征在于该中药组合物由以下重量份数的原料药制备而成的：100-200份黄芩、100-200份连翘、100-200份栀子、50-150份金银花、100-200份广藿香、10-100份柴胡、50-150份浙贝母。

优选的，该中药组合物由以下重量份数的原料药制备而成的：120-180份黄芩、120-180份连翘、120-180份栀子、60-140份金银花、120-180份广藿香、20-80份柴胡、60-140份浙贝母。更优选的，该中药组合物由以下重量份数的原料药制备而成的：140-160份黄芩、140-160份连翘、140-160份栀子、80-120份金银花、140-160份广藿香、40-60份柴胡、80-120份浙贝母。

进一步的，所述的防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，其特征在于：所述中药组合物为散剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、注射液或片剂。

本发明还提供了一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤如下：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，粉碎成细粉，过80-100目筛，混匀，分装，制得散剂。

本发明还提供了一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤如下：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量8-12倍量的水浸泡0.5-3小时，煎煮2-3次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次1-2小时，合并煎液，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入适量辅料，混匀，制备胶囊剂、颗粒剂或片剂。

本发明还提供了一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤如下：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量8-12倍量的水浸泡0.5-3小时，煎煮2-3次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次1-2小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达50-70％；10℃以下放置24-72小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入防腐剂，加水稀释至每1mL的口服液含原生药材0.6～1.0g，滤过，灌装，灭菌，即得口服液制剂。

优选的，防治家畜腹泻的中药组合物的制备方法，其特征在于：提取工艺参数为：加水10倍量，煎煮3次，第一次2小时，第二次、第三次各1小时。

优选的，除杂工艺参数为：提取液浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达60％。

本发明还公开了所述的中药组合物在制备用于治疗或预防鸡传染性支气管炎中的应用。使用方法：按照0.5～1.0％的重量比将该散剂加至饲料中，拌匀， 连用5-7天，即可有效防治鸡传染性支气管炎。

本发明的中药组合物主要由黄芩、连翘、金银花、栀子、广藿香、柴胡、浙贝母等组成，为外感风热所致温病初起、表里俱热而设，可对传染性支气管炎病毒感染等进行防治。。方中黄芩苦寒而气薄，主入上焦，善泄肺中之火邪，治上焦湿热，疗膈上热疾，除胸中气逆，为君药。金银花甘寒，疏风散热，透邪解毒，偏清肺火；连翘苦微寒，质轻而浮，泻六经郁火；栀子苦，寒。善泻心、肺、三焦烦火。三药相合，疏散在表风热为臣药。广藿香辛微温，芳香化肺经之浊，和中止脾胃不适之呕吐，发表解全身暑气；柴胡辛、苦，微寒，疏散退热，疏肝解郁，升举阳气；二药合用，佐助臣药清全身之热，兼能除湿止呕。浙贝母具有甘凉润肺之性，即可润肺养阴，又可化痰止咳，为使药；诸药相合，共奏疏散风热、利咽消肿、清肺止咳之效。经临床治疗传染性支气管炎病毒感染引起的呼吸道发病症状及现场应用研究证明，本方以疏散风热、利咽消肿、清肺止咳为治则，主要是针对IBV引起的精神萎顿、食欲不振，生产性能下降，特别是甩鼻、打喷嚏，渐发展为咳嗽，呼吸困难，气管啰音，气管炎，支气管炎，甚至肺部充血、水肿，不同程度的肺炎为主的呼吸道疾病。

中兽医认为，鸡传染性支气管炎病毒主要在机体正气虚弱时通过呼吸道感染，由于呼吸道感染病毒后造成热毒内蕴，导致痰涎阻塞气管，使鸡出现体温升高、怕冷、全身无力、懒惰、咳嗽、气喘等症状。本发明针对IB的临床症状，采用中兽医辩证施治，以疏散风热、利咽消肿、清肺止咳为治则。黄芩、连翘等具有抗IBV作用；栀子超微粉对角叉菜胶致小鼠足肿胀有明显抑制作用，对二甲苯致小鼠耳廓肿胀有明显抑制作用，对醋酸致小鼠扭体潜伏期有明显延长作用，对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠有协同作用；三者连用可增强清热解毒之效；广藿香芳香化湿，能帮助清除机体浊气，广藿香油可使内毒素性发热家兔体温降低，具有解热作用；柴胡为解表药，能发散内热，柴胡对酵母所致发热大鼠，具有一定的解热作用；浙贝母为清热化痰药，能化痰涎；浙贝母碱与去氢浙贝母碱对化学刺激小鼠、机械刺激引咳豚鼠及电刺激引咳猫有镇咳作用及中枢抑制作用。

药物组成和分析：

黄芩：味苦，性寒。归肺、胆、脾、大肠、小肠经。功能主治：清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎。用于湿温、暑温胸闷呕恶，湿热痞满，泻痢，黄疸，肺热咳嗽，高热烦渴，血热吐衄，痈肿疮毒，胎动不安。《别录》：疗痰热，胃中热，小腹绞痛，消谷，利小肠，女子血闭，淋露下血，小儿腹痛。《药性论》：能治热毒，骨蒸，寒热往来，肠胃不利，破壅气，治五淋，令人宣畅，去关节烦闷，解热渴，治热腹中疞痛，心腹坚胀。《滇南本草》：上行泻肺火，下行泻膀胱火，(治)男子五淋，女子暴崩，调经清热，胎有火热不安，清胎热，除六经实火实热。

柴胡：味苦，性微寒。归肝、胆经。功能主治：和解表里，疏肝，升阳。用于感冒发热，寒热往来，胸胁胀痛，月经不调，子官脱垂，脱肛。《本经》：主心腹肠胃中结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新。《别录》：除伤寒心下烦热，诸痰热结实，胸中邪逆，五藏间游气，大肠停积，水胀，及湿痹拘挛。《药性论》：治热劳骨节烦疼，热气，肩背疼痛，宣畅血气，劳乏羸瘦；主下气消食，主时疾内外热不解，单煮服。《日华子本草》：补五劳七伤，除烦止惊，益气力，消痰止嗽，润心肺，添精补髓，天行温疾热狂乏绝，胸胁气满，健忘。《滇南本草》：伤寒发汗解表要药，退六经邪热往来，痹痿，除肝家邪热、痨热，行肝经逆结之气，止左胁肝气疼痛，治妇人血热烧经，能调月经。

金银花：味甘，性寒。归肺、心、胃经。功能主治：清热解毒，凉散风热。用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热。《滇南本草》：清热，解诸疮，痈疽发背，丹流瘰疬。《生草药性备要》：能消痈疽疔毒，止痢疾，洗疳疮，去皮肤血热。《重庆堂随笔》：清络中风火湿热，解温疫秽恶浊邪，息肝胆浮越风阳，治痉厥癫痫诸症。

浙贝母：味苦，性寒。归肺、心经。功能主治：清热散结，化痰止咳，用于风热犯肺，痰火咳嗽，肺痈，乳痈，瘰疬，疮毒。《本草正》：大治肺痈肺萎，咳喘，吐血，衄血，最降痰气，善开郁结，止疼痛，消胀满，清肝火，明耳目，除时气烦热，黄疸淋闭，便血溺血；解热毒，杀诸虫及疗喉痹，瘰疬，乳痈发背，一切痈疡肿毒，湿热恶疮，痔漏，金疮出血，火疮疼痛，较之川贝母，清降之功，不啻数倍。《本草从新》：去时感风痰。《纲目拾遗》：解毒利痰，开宣肺气，凡肺家夹风火有痰者宜此。《山东中草药手册》：清肺化痰，制酸，解毒。治感冒咳嗽，胃痛吐酸，痈毒肿痛。

连翘：味苦，性凉。入心、肝、胆经。功能主治：清热，解毒，散结，消肿。治温热，丹毒，斑疹，痈疡肿毒，瘰疬，小便淋闭。《本经》：主寒热，鼠痿，瘰疬，痈肿恶疮，瘿瘤，结热。《药性论》：主通利五淋，小便不通，除心家客热。《日华子本草》：通小肠，排脓。治疮疖，止痛，通月经。李杲：散诸经血结气聚；消肿。

栀子：味苦，性寒。归心、肺、三焦经。功能主治：泻火除烦，清热利尿，凉血解毒。用于热病心烦，黄疸尿赤，血淋涩痛，血热吐衄，目赤肿痛，火毒疮疡。《本经》：主五内邪气，胃中热气，面赤，酒疱皶鼻，白癞，赤癞，疮疡。《别录》：疗目热亦痛，胸心、大小肠大热，心中烦闷，胃中热气。《医学启源》：疗心经客热，除烦躁，去上焦虚热，治风。朱震亨：泻三焦火，清胃脘血，治热厥心痛，解热郁，行结气。《纲目》：治吐血、衄血、血痢、下血、血淋，损伤瘀血，及伤寒劳复，热厥头痛，疝气，汤火伤。

广藿香：为唇形科植物广藿香Pogostemoncablin(Blanco)Benth.的地上部分。性微温，味辛。功能主治：芳香化浊，开胃止呕，发表解暑。用于湿浊中阻、脘痞呕吐、暑湿倦怠、胸闷不舒、寒湿闭暑、腹痛吐泻、鼻渊头痛。《别录》：疗风水毒肿，去恶气，疗霍乱、心痛。《本草图经》：治脾胃吐逆，为最要之药。《珍珠囊》：补卫气，益胃气，进饮食，又治吐逆霍乱。《汤液本草》：温中快气。肺虚有寒，上焦壅热，饮酒口臭，煎汤漱。《本草述》：散寒湿、暑湿、郁热、湿热。治外感寒邪，内伤饮食，或饮食伤冷湿滞，山岚瘴气，不伏水土，寒热作疟等症。《本草再新》：解表散邪，利湿除风，清热止渴。治呕吐霍乱，疟，痢，疮疥。梗：可治喉痹，化痰、止咳嗽。

本发明的有益效果是：

1)本发明的组合物在促进动物生长、预防和治疗IB方面，有独特的效果。且因中草药安全、无毒副作用、无残留、防治效果好、成本低，不影响产蛋；与西药相比，具有独特的优势，其疗效优于抗生素类药物。

2)药效学研究结果显示，本发明的组合物其具有止咳、解热、抗炎作用。通过观察对人工感染IBV鸡的治疗效果和临床验证表明，食用本发明的制剂后，症状减轻，精神状态好转，采食量增加，咳喘症状消失等，仅个别鸡出现甩头，打喷嚏。本发明的组合物能有效缓解IBV引起的病鸡临床症状，总有效率达到94％以上，痊愈率和有效率较阳性对照组为高。通过对靶动物鸡的安全性试验，确定了本品无毒副反应。其生产工艺稳定，质量可控，适合大生产提取，可大规模应用于IB的防治。

附图说明

图1为IBV的荧光定量PCR图；其中，从上到下依次为扩增曲线、溶解曲线、实时荧光定量PCR标准曲线图；

图2为IB模型建立情况图；其中，a.临床，b.气管和支气管，c.气管，d.心脏。

图3肺脏组织及气管组织HE染色切片图(40倍)，其中，A.肺脏，B.支气管，1.阴性对照组；2.阴性对照组；3.本发明口服液中剂量组。

具体实施方式

实施例1:散剂的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下原料药制备而成：400g黄芩、400g连翘、400g栀子、400g广藿香、300g金银花、300g浙贝母、200g柴胡。制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量12倍量的水浸泡1小时，煎煮2次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次2小时，合并煎液，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入230g淀粉，混匀，制备1000g散剂。

实施例2:颗粒剂的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下原料药制备而成：400g黄芩、400g连翘、400g栀子、400g广藿香、200g金银花、200g浙贝母、40g柴胡。制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量12倍量的水浸泡1小时，煎煮2次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次2小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达50％；10℃以下放置24小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入淀粉200g和微晶纤维素400g，制粒，干燥，整粒，制得1000g颗粒剂。

实施例3:颗粒剂的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下原料药制备而成：300g黄芩、300g连翘、300g栀子、300g广藿香、200g金银花、200g浙贝母、100g柴胡。制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量10倍量的水浸泡1小时，煎煮3次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，第一次2小时，第二次、第三次各1小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达60％；10℃以下放置48小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入淀粉300g和微晶纤维素360g，制粒，干燥，整粒，制得1000g颗粒剂。

实施例4:胶囊剂的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下原料药制备而成：120g黄芩、120g连翘、120g栀子、120g广藿香、60g金银花、60g浙贝母、20g柴胡。制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量12倍量的水浸泡1小时，煎煮2次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次2小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达60％；10℃以下放置48小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入淀粉75g和微晶纤维素200g，制粒，干燥，加入少量硬脂酸镁，灌装，制得1000粒胶囊剂，0.4g/粒。

实施例5:散剂的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下原料药制备而成：20份黄芩、20份连翘、20份栀子、15份金银花、20份广藿香、10份柴胡。制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，粉碎成细粉，过80-100目筛，混匀，分装，制得散剂。

实施例6:片剂的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下原料药制备而成：180g黄芩、180g连翘、180g栀子、180g广藿香、140g金银花、80g柴胡、140g浙贝母。制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝 母，除黄芩外的药材先加处方全部重量8倍量的水浸泡1小时，煎煮3次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次2小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达70％；10℃以下放置24-72小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入糊精90g和微晶纤维素200g，制粒，干燥，加入硬脂酸镁10g，制得片剂1000片，每片0.5g。

实施例7:口服液的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下原料药制备而成：150g黄芩、150g连翘、150g栀子、150g广藿香、100g金银花、100g浙贝母、50g柴胡。制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量8-12倍量的水浸泡0.5-3小时，煎煮2-3次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次1-2小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达50-70％；10℃以下放置24-72小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入2g防腐剂山梨酸钾，加水稀释至1000mL，滤过，灌装，灭菌，即得口服液制剂。

提取与精制优选工艺研究：

考虑到禽类给药特点，我们优选制备口服液制剂，参考传统中药提取及中兽医用药经验，确定对黄芩等七味药材进行水煎煮提取有效成分，采用正交试验优选提取参数。口服液因为有澄清度的要求，且为了保证口服液在放置的过程中不会产生大量的沉淀，结合方中各药味的性质，选择水提醇沉的提取除杂方法。综合考虑成本及安全性等各因素，本工艺采取乙醇作为除杂溶剂，对其进行除杂工艺研究。

1试验材料

1.1试药：黄芩等七味药材(购自安国药材市场)，黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110715-200514)。

1.2仪器：高效液相色谱仪：安捷伦1200泵，安捷伦二极管阵列检测器，

安捷伦自动进样器。

2方法

2.1水煎煮正交试验

2.1.1实验设计

根据水煎煮提取过程中的影响因素，以加水量A、煎煮时间B、煎煮次数C为三个考察因素，分别取三个水平，采用L₉(3⁴)表设计正交实验，见表1。

表1水提正交因素水平表

2.1.2实验方法

分别称取黄芩、连翘等7味药材9份，按L₉(3⁴)正交实验方法进行工艺考察。其中黄芩待水煎液煮沸后下，以样品中黄芩所含黄芩苷量为指标，优选结果(表2、表3)。

含量测定：照高效液相色谱法(中国兽药典2010年版二部附录35页)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸(47∶53)为流动相；检测波长为280nm。理论塔板数以黄芩苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶解，制成每1mL含50μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备精密量取本品1mL于10mL量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液2.5mL，放置于10mL量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，过滤(0.45μm滤膜)，续滤液作为供试品溶液。

测定法分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2除杂工艺的优选

2.2.1除杂溶剂的选择

按1000mL处方量称取药材，按照优选的水提工艺进行提取、浓缩至相对密度1.05(50℃)，平均分成10份，取4份备用；其余6份，1份测定黄芩苷含量，另5份分别加乙醇使含醇量达45％、50％、60％、70％、75％，进行沉淀过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加山梨酸钾0.2g，加水至100mL，摇匀，过滤，测定黄芩苷含量，并于放置1周后观察药液澄清度。

2.2.2减压浓缩相对密度的考察

本制剂采取60％乙醇做为纯化的溶剂，药液相对密度越小，乙醇用量越大，药液中的黄芩苷溶解于乙醇溶液中效果越好，但是太浪费乙醇；药液相对密度越大，消耗乙醇量越小，但是有效成分不一定能全部溶解，因此对药液的浓缩相对密度进行了考察。

取上述2.2.1试验下备用药液，两份浓缩至相对密度为1.10(50℃测)，另两份浓缩至相对密度为1.15(50℃测)的清膏，放冷，加乙醇使含醇量达60％，放置过夜，过滤，滤渣干燥，称重，滤液回收乙醇至无醇味，分别加山梨酸钾0.2g，加水至200mL，摇匀，过滤，测定黄芩苷含量。

2.2.3放置时间的考察

称取处方量的药材，共4份，按照上述优选的工艺，加10倍量水煎煮3次，第一次2小时(其中黄芩待药液煮沸后下)，第二次、第三次各1小时，合并煎煮液，滤过，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，放冷，加入乙醇，使含醇量至60％，分别在10℃以下放置12小时、24小时、48小时、72小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入2g山梨酸钾，加水调节至1000mL，滤过，灌装，放置一周后观察。

2.3工艺验证

称取处方量的药材，共三份，分别按照上述优选的工艺，加10倍量水煎煮3次(其中黄芩待第一次药液煮沸后加入)，第一次2小时，第二次、第三次各1小时，合并煎煮液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.10(50℃测)的清膏，放冷，加入乙醇，使含醇量至60％，放置48小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加水调节至1000mL，滤过，灌装，测定黄芩苷含量。

3结果

3.1水提取工艺正交优选参数试验结果

表2水提取工艺优选L9(3⁴)正交实验结果

表3方差分析表

直观分析表明，A₂>A₁>A₃，B₃>B₂>B₁，C₃>C₂>C₁，即最佳组合为：A₂B₃C₃，即加水10倍量，每次2小时，煎煮3次。极差R显示，各因素对水提取工艺的影响顺序是C→A→B。

方差分析的结果显示，因素C具有显著性影响，故选择因素C影响最大的水平C₃；A、B均无显著影响，即A、B均可选择任一水平。考虑到节约能源又能保证提取完全，结合生产经验，因素A选择中间水平A₂，B选择提取2小时、1小时、1小时。

故本品最佳提取工艺为：以上七味，加水10倍量，煎煮3次，第一次2小时，第二次、第三次各1小时。

3.2除杂工艺优选结果

3.2.1醇沉溶剂选择结果见表4。

表4醇沉浓度优选结果

从以上实验可知，醇沉浓度达到45％和75％时黄芩苷的含量有较大损失，醇沉浓度达到50％-70％，黄芩苷含量变化较小，说明醇沉浓度50％-70％时较为合理，因50％乙醇醇沉，上清液和沉淀处于混悬状态，较难过滤，70％乙醇醇沉， 成本较高，综合考虑各因素，选择60％乙醇进行醇沉除杂。

3.2.2浓缩密度选择结果见表5。

表5减压浓缩相对密度优选结果

从实验结果分析，药液浓缩至相对密度1.05、1.10时，药液中黄芩苷含量基本相当，产生的沉淀量也基本相当，可以判定相对密度1.05～1.10时醇沉基本可以除杂完全；相对密度为1.15时乙醇用量少，同时药液产生的沉淀过多，药液中黄芩苷含量较低，分析可能是除杂过程中将部分有效成分除去。综合考虑各方面因素，故选择浓缩相对密度为1.05～1.10(50℃)。

3.2.3醇沉后放置时间考察结果见表6。

表6醇沉后放置时间的考察结果

结果显示，醇沉后放置12小时过滤，最终产品放置一周后有微量沉淀，放置48小时过滤，最终产品放置一周后澄清，符合口服液性状要求，故选择10℃以下放置48小时以上即可。

3.3工艺验证

称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量10倍量的水浸泡0.5-3小时，煎煮3次，第一次2小时，第二次、第三次各1小时,其中黄芩待首煎药液煮沸后下，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达60％；10℃以下放置48小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入防腐剂，加水稀释至1000mL，滤过，灌装，灭菌，即得口服液制剂。结果见表7。

表7工艺验证结果

结果显示，工艺验证结果与正交优选结果基本一致，表明所优选的工艺参数重复性好。

试验例1：药理学试验

本发明拟对止咳、解热、镇痛、抗炎方面的主要药效学进行研究。

一、止咳作用研究

采用药理学记载的氨水刺激引咳法，操作简单、经济适用，故本次试验采用刺激性试剂氨水，制成氨水气雾，刺激小鼠，引起小鼠咳嗽，从而观察本发明组合物的止咳作用。

1试验材料

1.1试验动物

采用中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心的昆明小鼠(雄性，体重20～22g，许可证号：SCXK-(军)2007-004)。

1.2药品与试剂

试验用药：实施例5的口服液制剂，本实验室自制，批号：20140701，1mL药液生药含量0.85g。口服给药。阳性对照药：麻杏止咳糖浆，广西大力神制药股份有限公司，批号140301，规格：100mL/瓶。氨水，北京化工厂，批号110501，分析纯。氯化钠注射液，四川科伦药业股份有限公司，批号20131025。

1.3主要仪器YLS-8A多功能诱咳引喘仪，济南益延科技发展有限公司。

2方法

2.1筛选氨水引咳给药时间

取9只小鼠，分为3组，每组3只，分别放入多功能诱咳引喘仪，用氨水给药20s，40s，60s，观察小鼠的反应，记录给药后到第一次咳嗽的时间及5min内咳嗽次数。典型的咳嗽是小鼠腹肌收缩，同时张大口，有咳嗽声。选出小鼠咳嗽次数在50～100之间，咳嗽动作声音清晰明显，界限分明的给药时间组，确定为本次试验给药时间。经试验结果显示给药40s时，刺激适中，小鼠可产生清晰明显的咳嗽声，动作明显。

2.2本发明口服液止咳试验

取小鼠30只，随机分为5组，每组6只，第一组灌胃给予1mL/kg·bw的生理盐水，第二组灌胃给予麻杏止咳糖浆1mL/kg·bw，分别作为空白对照及阳性 药对照，其它三组给予本发明口服液低、中、高剂量组(0.75，1.5，3mL/kg·bw)。给药1h后，将小鼠放入多功能诱咳引喘仪，用氨水给药40s诱咳，观察小鼠的反应，记录给药后到第一次咳嗽的时间(潜伏时间)及5min内咳嗽次数。

2.3统计分析

应用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，卡方检验、方差分析和多重比较进行数据分析和差异显著性比较，试验结果以平均数±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

3结果

试验结果如下表所示，本发明口服液具有良好的止咳作用，与阳性对照药麻杏止咳糖浆效果稍好，差异不显著。与生理盐水对照组差异显著，咳嗽潜伏时间和5min咳嗽次数相差一倍，疗效显著。

表8本发明的口服液对氨水引起的咳嗽的影响

注：同列比较，相邻字母表示差异显著(P<0.05)，相间字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。

首先确定氨水引咳所需时间，其次将正常小鼠分为五组，分别灌胃给予生理盐水(空白组)、麻杏止咳糖浆(阳性对照组)、(低、中、高)剂量本发明口服液，1小时后，氨水诱咳，统计结果显示，阳性药组及试验药组潜伏时间均比空白组长，咳嗽次数均比空白组少。表明，本发明口服液能显著减少氨水引起的小鼠咳嗽，说明本发明口服液有较好的止咳效果。

二、解热作用研究

本试验发热模型选择大鼠，外源性致热剂选用2，4-二硝基苯酚，观察本发明口服液的对体温的改变。

1试验材料

1.1试验动物

采用中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心的Wistar大鼠，30只，雄性，体重200～220g，许可证号：SCXK-(军)2007-004。

空调控制室温18～25℃，湿度50％～70％，自由饮水，摄食。

1.2药品与试剂

试验用药：本发明实施例5口服液，本实验室自制，生产批号：20140701，1mL药液生药含量0.85g。口服给药。

阳性对照药：阿斯匹林片，广东康博通药业实业有限公司，国药准字H44021139，100mg/片，临用时用生理盐水配制成40mg/mL的溶液。

氯化钠注射液，四川科伦药业股份有限公司，批号20131025

2，4-二硝基苯酚，天津市大茂化学试剂厂，批号20101202，分析纯，临用时用生理盐水配制成1.5mg/mL的溶液。

2方法

2.1 2，4-二硝基苯酚溶液制备

精密称取2，4-二硝基苯酚150mg，置80mL生理盐水中，逐滴加入氢氧化钠溶液(浓度：5mol/l)，用磁力搅拌器不断搅拌，至2，4-二硝基苯酚恰好溶解，变为亮黄色澄明溶液，加生理水定容至100mL，即得。

2.2大鼠适应性饲养

雄性大鼠置实验室环境中(23±1℃)适应3d，测肛温2次/日，连续3d，先使大鼠适应测肛温操作。试验当天每隔1小时，测肛温1次，连续测3次，取平均值记为基础体温。选取体温变化不超过0.3℃、平均体温在35.5～36.5℃的大鼠，随机分组。

2.3解热试验

选上述大鼠30只，平均分成5组，每组6只。即生理盐水组(等体积生理盐水)，阳性药对照组(阿司匹林组200mg/kg·bw)，本发明口服液低、中、高剂量组(0.75，1.5，3mL/kg·bw)。灌胃给药1小时后，在鼠背部皮下注射2，4-二硝基苯酚溶液2mL(浓度：1.5mg/mL)，分别于0.5、l、1.5、2、4、6小时各测肛温一次，计录各测定时间点大鼠的体温(℃)。以体温变化为纵坐标，测定时间点为横坐标，绘制体温曲线。

2.4统计分析

应用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，卡方检验、方差分析和多重比较进行数据分析和差异显著性比较，试验结果以平均数±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

3结果

试验表明，本发明的口服液具有一定的解热作用。在注射2，4-二硝基苯酚后半小时，大鼠体温上升，大约1小时后达到最高，可持续3～4小时。致热1小时后本发明口服液高剂量组体温显著低于生理盐水组及本发明口服液低剂量及中剂量组，与阳性药对照组间无明显差异；2小时和4小时，本发明口服液各试验组体温及阳性药对照组体温均显著低于生理盐水组；6小时后各组之间体温无显著差异。结果见下表。

表9本发明的口服液对2，4-二硝基苯酚致热的影响(平均值±标准差，n＝6)(℃)

通过给五组大鼠，分别灌胃给予生理盐水(空白组)、阿司匹林(阳性对照组)、(低、中、高)剂量本发明口服液，1小时后，鼠背部皮下注射2，4-二硝基苯酚溶液2mL，对不同时间点的体温进行统计分析，结果显示，致热1小时后，本发明口服液产生解热作用，解热作用可持续4小时，6小时后各组之间无差异。表明，本发明口服液具有一定的解热作用，但是解热作用不如阳性对照药阿司匹林。

三、抗炎作用研究

本次试验选择以下两种炎症模型，来评价本发明的口服液的抗炎作用，为临床提供试验依据。

1试验材料

1.1试验动物

采用中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心Wistar大鼠，30只，雄性，体重200～220g，许可证号：SCXK-(军)2007-004。

采用中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心的昆明小鼠，30只，雄性，体重18～22g，许可证号：SCXK-(军)2007-004。

空调控制室温20～25℃，湿度50％～70％，自由饮水，摄食。

1.2药品与试剂

试验用药：本发明口服液，本实验室自制，生产批号：20140701，1mL药液生药含量0.85g。口服给药。

阳性对照药：阿斯匹林片，广东康博通药业实业有限公司，国药准字H44021139，100mg/片，临用时碾碎，用生理盐水溶解，配制成40mg/mL溶液。

2方法

2.1本发明口服液对大鼠蛋清所致足趾肿胀度的影响

选取Wistar雄性大鼠30只，随机平均分成5组，每组6只。即对照组(等体积生理盐水)，阳性药对照组(阿司匹林200mg/kg·bw)，本发明口服液低、中、高剂量组(0.75，1.5，3mL/kg·bw)，灌胃给药，1天1次，连续7天。于末次给药后，用大鼠足趾容积测量仪，测量致炎前左后只爪容积。末次给药1h后，给大鼠左后只爪跖皮下注射新鲜蛋清，每只0.1mL，致炎，分别于致炎后的0.5、1、2、4、6、8h，用大鼠足趾容积测量仪测量致炎后的爪容积，以致炎前后爪容积差值为肿胀度。计算各组的肿胀度和抑制率(％)。

足趾肿胀度＝致炎后的足爪容积﹣致炎前的足爪容积

足趾肿胀抑制率(％)＝(对照组足趾肿胀度平均值-给药组足趾肿胀度平均值)/对照组足趾肿胀度平均值×100％

2.2本发明口服液对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

选取昆明小鼠30只，随机分成5组，每组6只。即对照组(等体积生理盐水)，阳性药对照组(阿司匹林组200mg/kg·bw)，本发明口服液低、中、高剂量组(0.75，1.5，3mL/kg·bw)。每天灌胃给药1次，连续7天。于末次给药l h后，给小鼠右耳的前后两面涂抹0.02mL的二甲苯致炎，l h后颈椎脱臼处死小鼠，并立即沿耳廓基线剪下双耳，用直径为6mm的打孔器，分别在双耳同一部位打孔，用电子天平精密称重，双耳重量差为肿胀度；将各组的肿胀程度进行统计学 分析，计算肿胀率均值、标准差、抑制率，比较各组之间的差异。

肿胀度(mg)＝右耳片重﹣左耳片重

肿胀度抑制率(％)＝(对照组肿胀度平均值-给药组肿胀度平均值)/对照组肿胀度平均值×100％。

2.3统计分析

应用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，卡方检验、方差分析和多重比较进行数据分析和差异显著性比较，试验结果以平均数±标准差P<0.05表示差异显著。

3结果

3.1本发明的口服液对大鼠蛋清所致足趾肿胀的影响

从表10可知，本发明口服液各剂量组对大鼠足趾肿胀均呈现抑制作用，抑制作用与剂量成正相关。试验结果表明，与对照组相比较，发现阳性药及本发明口服液各试验组有很好的抑制蛋清引起的足趾肿胀作用，并且本发明口服液中剂量组抑制足趾肿胀作用与阳性药对照组接近。

表10本发明的口服液对蛋清所致大鼠足趾肿胀的影响(平均值±标准差，n＝6)

3.2本发明的口服液对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

从表11可知，本发明口服液可有效抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，抑制作用与药物剂量呈现正相关。阳性药对照组抑制作用介于本发明口服液中、高剂量组之间。

表11本发明口服液对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(平均值±标准差，n＝6)

采用蛋清和二甲苯两种致炎方法。蛋清致足趾肿胀实验中，给五组大鼠分别灌胃给予生理盐水(空白组)、阿司匹林(阳性对照组)、(低、中、高)剂量本发明口服液，连喂7天，末次给药1小时后，在大鼠左后肢爪跖皮下注射新鲜蛋清，分别于不同时间测定足爪容积，计算肿胀度，结果显示，芩边口服液中剂量组与阳性对照组抑制率接近。二甲苯致耳肿胀实验中，给五组小鼠分别灌胃给予生理盐水(空白组)、阿司匹林(阳性对照组)、(低、中、高)剂量本发明口服液，连喂7天，末次给药1小时后在小鼠右耳的前后两面涂抹0.02mL的二甲苯，1小时后观察耳肿胀度，结果显示，高剂量组抑制率比阳性对照组明显高。表明本发明口服液能抑制蛋清引起的大鼠足趾肿胀，以及二甲苯引起的小鼠耳肿胀，具有较好的抗炎作用。本方抗炎的机理，可能是由某味药产生，也可能是由方中药味协同产生。

小结：本发明的口服液低、中、高剂量均能减少氨水引咳小鼠的咳嗽次数、抑制2，4-二硝基苯酚引起的大鼠体温升高、抑制蛋清致大鼠的足趾肿胀和二甲苯致小鼠的耳廓肿胀，具有止咳、解热、抗炎作用。

试验例2：对IB的治疗效果

本研究通过观察本发明口服液对人工感染IBV鸡的治疗效果，为进一步开发和临床应用提供依据。

1试验材料

1.1试验动物

采用北京梅里亚维通实验动物技术有限公司生产的3周龄SPF来航鸡，雄性，180只，许可证编号：SCXK(京)2009-0003。

1.2试验用药

本发明口服液，本实验室中试产品，生产批号：20140901，1mL药液生药含量0.85g。口服给药。

阳性对照药：按照功效相近，同类可比的原则，选用麻杏石甘口服液，洛阳惠中兽药有限公司，批号：20140301，每1mL相当于原生药2.4g。功能与主治：清热解毒、宣肺止咳、通咽利喉。主治家禽病毒性呼吸道疾病。用法用量：混饮，每1千克体重，鸡，1.5mL。

1.3试验用毒株

IBV：M41株，购自中国兽医药品监察所，批号：AV1511。

1.4试验试剂与仪器

酶类：RNase A，购自TIANGEN公司；反转录酶(M-MLV)，Promega公司。

载体及菌株：采用北京全式金生物技术有限公司提供的PMD18T克隆载体和DH5α感受态细胞。

核酸Marker：100bp DNA ladder，由北京汇天东方有限公司提供。

试剂盒：green Realtime PCR Master Mix，日本TOYOBO公司产品；DNA片段快速胶回收试剂盒，博大泰克生物科技公司；高纯度质粒小提试剂盒，购自TIANGEN公司。

RNA提取用试剂：TRIzol LS Reagent：Promega公司产品。

Mx 3005P荧光定量PCR仪：Stratagene公司。

1.5试验时间、地点：本试验于2014年11月27日到2014年12月30日在北京农学院实验动物房进行。

2方法

2.1复壮病毒EID₅₀的测定

2.1.1病毒的复壮

1)接种前处理：先用检卵灯在暗室检查鸡胚活力，并用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好一个记号。鸡胚发育正常时，可见清晰的血管及活的鸡胚，血管及其主要分支均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。未受精和死胚胚体固定在一端不动，看不到血管，应剔出。

2)实验操作要求：所有操作必须严格无菌。实验室、实验超净台都需事先用紫外线消毒20～30分钟，实验用具高压消毒灭菌。接种操作在超净台进行。

3)尿囊腔接种

取出鸡胚，在鸡胚气室接近胚位处(打孔的位置)用碘酒棉、酒精棉进行消毒，用钢锥在酒精灯火焰灼烧消毒后，在气室顶端和气室下沿无血管处各穿一小孔；IBV标准株M41按1：10稀释，加双抗后4℃作用4～6h，注射器吸病毒稀释液，随后将注射器针头从气室下沿小孔垂直插入0.5～1.0厘米处(避开血管)，注入0.2mL接种物。紧接着用石蜡封口，并置孵卵箱中直立孵育，24h 内死亡者废弃。孵育36～40h后进行收获尿囊液，取出放4℃冰箱过夜(大概10h)或-20℃冰箱中1.5h冻死鸡胚，以免收获时出血。收集尿囊液：从冰箱取出鸡胚，用碘酒或75％酒精消毒气室部卵壳，在超净台用镊子剥开气室部位的蛋壳，撕去内层壳膜和绒毛尿囊膜，用镊子轻轻按住胚胎，以无菌吸管或消毒注射器避开血管吸取尿囊液，以3000r/min离心30min，取上清，将收集的鸡胚尿囊液均合并后分装保存于-20℃冰箱，以备下次传代用。以上方法盲传7代，等传到第7代时测定EID₅₀。

2.1.2IBV EID₅₀测定

将含IBV-M41的尿囊液用PBS液做10^-2～10^-7稀释，每个稀释度接种10日龄SPF鸡胚6枚，0.1mL/胚，同时设有对照接种生理盐水，至20日龄，记录侏儒胚及死亡情况，用Reed-Muench法计算其EID₅₀，具体公式为：

距离比＝(高于50％的感染百分数-50)/(高于50％的感染百分数-低于50％的感染百分数)

LgEID₅₀＝高于50％感染的病毒最高稀释度的对数+距离比×稀释系数的对数差

2.2IBV模型的建立

根据多次预试验结果，采用10^-3.30/0.1mL剂量给每只供试SPF鸡滴鼻0.2mL供试毒液。攻毒后鸡只隔离在密闭的环境中饲养，每天给1～2小时的低温(10℃)刺激，其余时间保持室内温度舒适，相对湿度控制在70％±5％，观察临床症状和病理剖检。

2.3本发明口服液对IB的治疗

2.3.1试验动物分组和处理

3周龄SPF雄性来航鸡180只，在北京农学院实验动物房饲养，随机分为6组，每组30只鸡。阴性对照组、阳性对照组在隔离器中单独饲养，阳性药对照组及本发明口服液低剂量组、本发明口服液中剂量组、本发明口服液高剂量组分别于三层育雏鸡笼饲养。饲料中不含任何药物，自由采食及饮水。适应性饲喂4天后攻毒；攻毒后48小时所有雏鸡均发病，开始灌服给药治疗，连续给药7天。试验分组和处理见表12。

表12试验分组及处理

7天治疗结束后，根据临床疗效评价标准对各试验组进行评分，判定药效。

试验鸡全部剖杀，其中随机抽取各试验组鸡10只，系统剖检，观察气囊的透明度、气管与支气管是否有渗出以及肺脏等剖检病理变化，以判定本发明口服液的疗效。

2.3.2IBV载量测定方法的建立

2.3.2.1组织中总RNA提取

取100mg冻存组织，在液氮中研碎后加入1mL TRIzol LS Reagent，充分混匀后，室温5min；按照每1mL TRIzol LS Reagent加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温3min，4℃12000r/min离心15min，吸取上层水相；在上层水相中加入0.5mL异丙醇，室温沉淀8min，4℃12000r/min离心10min；倾弃上清，加入75％乙醇1mL漂洗后，弃上清，室温风干10min，用适量DEPC水溶解备用。

按照GenBank已发表的IBV毒株M41株的序列，采用Premier5.0设计一对引物，扩增片段长度为227bp。上游引物5’-AAAACCAGTCCCAGATGCT-3’；下游引物5’-GAGGAAT GAAATCCCAACG-3’。

2.3.2.2cDNA的合成

进行按上述方法提取的总RNA的反转录，合成cDNA。按AMV ReverseTranscriptase说明进行cDNA的合成，建立20μL的反转录体系，42℃下2h，然后95℃再变性5min，作为PCR模板。20μL反转录体系：

2.3.2.3标准质粒的制备方法(测序鉴定)

将获得的cDNA进行PCR扩增。PCR反应体系如下：上、下游引物各5pmol，dNTPs 5nmol，10×Buffer 2μL，cDNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.5U，加ddH₂O 至20μL。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。PCR产物用1.5％琼脂糖进行凝胶电泳观察，回收纯化目的产物片段(采用DNA片段快速胶回收试剂盒)，构建IBV-PMD18T标准的重组质粒，重组质粒经过华大基因公司完成测序，比对后与感染的IBV(M41株)特异性片段吻合。

用核酸浓度分析仪测OD260和OD280的值，经计算，浓度为1.1×10¹⁰copies/μL，选用OD260与OD280的比值在1.8～2.0之间的质粒，构建标准曲线。根据测得质粒浓度，按下式计算拷贝数：

拷贝数/μL＝6.02×10²³(copied/mol)÷MW(g/mol)×浓度(g/μL)

其中，MW＝目的片段大小(bp)copies/μL×660(g/mol.bp)

根据计算得出的拷贝数，将重组质粒十倍系列用TE缓冲液稀释成含有10¹⁰～10³copies/μL的8个梯度。用稀释后的质粒DNA作为模板，每个不同稀释梯度的模板重复2个孔，进行PCR扩增。结果如图1所示。

2.3.3主要观察指标

2.3.3.1生产性能

从攻毒开始计算到给药结束，共9天。分别记录试验开始至结束各组饲料消耗量，计算采食量：平均日采食量(g)＝总采食量/∑每天鸡只数。

每组随机抽取10只鸡并标记，在治疗开始和治疗结束时，逐只空腹称重，计算平均日增重。平均日增重(g)＝(试验结束体重-试验开始体重)/天数。

料重比：料重比＝平均日采食量/平均日增重

2.3.3.2病理变化

剖检变化：观察试验鸡鼻腔、气管、支气管、肺脏、气囊、肝脏、肾脏等各组织器官病理变化。

组织学观察：肺脏、肾脏中性甲醛固定，石蜡包埋，做组织切片，HE染色，观察组织病理变化。

2.3.3.3组织中病毒核酸载量测定

在治疗7天后，每组鸡取5只，无菌采取气管、支气管、肺脏和肾脏组织，在-80℃保存备用，用2.2建立的组织病毒核酸载量的测定方法测定。

2.3.3.4疗效判定标准

观察临床症状、病理变化，结合各项检测指标的变化来判断疗效。

无效：精神高度沉郁，驱赶不走，食欲显著下降，甩头，咳嗽、打喷嚏、气管啰音。剖检可见气管环充血、出血，有较多浆液性、卡他性和干酪样渗出物；肺部支气管内可见出血，肾脏尿酸盐沉积。无效鸡只数占该组鸡数的百分比为无效率。有效：精神较好，食欲逐渐恢复，少量鸡有甩头，咳嗽、打喷嚏。剖检观察可见气管少量浆液性和卡他性黏液，气管环轻微充血、发红，肾脏尿酸盐少量沉积。有效鸡只数占该组鸡数的百分比为有效率。痊愈：精神、食欲、呼吸恢复正常，剖检气管、支气管、肺脏、肾脏等组织未见异常。痊愈鸡只数占该组鸡数的百分比为痊愈率。总有效率：有效和痊愈鸡数总和占该组鸡数的百分比。

2.4统计分析

应用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，采用卡方检验、方差分析、多重比较，进行数据分析和差异显著性比较，试验结果用平均数±标准差来表示，P<0.05表示差异显著。

3结果

3.1半数鸡胚感染量(EID₅₀)测定结果

根据Reed-Muench法计算半数鸡胚感染量(EID₅₀)：EID₅₀的对数＝高于50％病毒稀释对数+距离比例×稀释系数的对数＝10^-6.30/0.1mL

距离比例＝(高于50％鸡胚死亡百分数－50％)/(高于50％鸡胚死亡百分数－低于50％鸡胚死亡百分数)＝(8/14－50％)/(8/14－4/12)＝0.3

LgEID₅₀＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％死亡率稀释度的对数

＝0.3×(－1)+(－6)＝－6.3

EID₅₀＝10^-6.30/0.1mL。

表13传染性支气管炎病毒感染鸡胚试验处理

3.2IB模型的建立情况

发现试验鸡于攻毒36h后陆续发病，迅速波及全群。第3天开始症状明显，病鸡主要表现为精神沉郁、不安或嗜睡、畏寒怕冷、扎堆，羽毛松乱，垂翅呆立，甩头、粘涕、喷嚏、喘咳、出现明显的气管啰音，晚上症状尤为明显。剖检发现病鸡鼻道、气管、支气管粘膜肿胀，腔内含有不同数量的浆液、粘液或干酪样渗出物；支气管和气管交界处有出血，而气管的环状部分也呈现出血症状；气囊混浊；心胞积液严重。以上症状均符合鸡传支的临床症状。结果见图2所示。结果表明，IB模型成功建立，供试毒液以10^-3.30/0.1mL浓度给每只供试SPF鸡滴鼻0.2mL，为本试验模型的感染剂量。

3.3本发明口服液对IB发病鸡的疗效

3.3.1对生产性能的影响

表14试验结果显示，与阳性对照组相比，阴性对照组、阳性药对照组和本发明口服液高、中、低剂量组的试验鸡的平均日增重均有显著增加(P<0.05)；从料重比显示，阳性对照组料重比增加，而阳性药对照组、本发明口服液高中低剂量组料重比与对照组相比略低。

表14本发明口服液对IB鸡生产性能的影响(n＝10)

3.3.2组织学变化

由图2的病理组织切片图可知呼吸道型M41株感染SPF鸡后可造成阳性对照组肺组织，肺泡周围淤积有大量的红细胞，另外还可以看到在支气管管腔内有红细胞，本发明口服液治疗组可清晰看到肺小叶及各级组织结构，仅见少量红细胞。支气管壁充血，水肿和淋巴细胞、浆细胞浸润；气管黏膜上皮细胞变性，部分坏死脱落，黏膜上皮内杯状细胞增多。经过本发明口服液治疗后，上述病变均有明显改善。

综上可知，本发明口服液对呼吸道型传染性支气管炎病毒所致鸡肺、气管组织损伤具有明显的治疗效果。

3.3.3治疗后组织中病毒核酸载量的测定

如表15所示，经过7天治疗后组织中IBV核酸载量发生明显变化，阳性药对照组，本发明口服液高、中、低剂量组病毒核酸载量显著降低(P<0.05)，而阳性对照组组织中IBV病毒核酸载量最高。

表15IBV感染鸡治疗后IBV核酸载量结果(10x，n＝5)(logcopy)

3.3.4本发明口服液对IB鸡临床症状的影响

在适应性饲养后，用IBV感染的鸡胚尿囊液，经滴鼻点眼感染雏鸡，24小时后部分鸡发病，48小时后所有雏鸡均发病；主要表现为精神高度沉郁，呆立不动，被羽凌乱，咳嗽流涕，呼吸啰音，呼吸困难，食欲减退，采食量减少等症状。本发明口服液及阳性药治疗后，症状减轻，精神状态好转，采食量增加，咳喘症状消失等，仅个别鸡出现甩头，打喷嚏。

表16本发明的口服液对IB鸡疗效的影响

试验结果显示，与阳性对照组相比，本发明口服液低、中、高剂量组均能有效缓解IBV引起的病鸡临床症状，其中以高剂量组效果最好，总有效率达到83.33％，中剂量组效果次之，高、中、低剂量组间总有效率呈量效依赖关系。

试验例3：临床验证

试验动物：根据流行病学，临床症状，病理剖检、病原分离与鉴定、经综合诊断为传染性支气管炎的病鸡400只，随机分为4组，每组100只，分别为实施例4组、实施例5组、红霉素对照组和空白对照组。

试验药物：按照0.8％的重量比将实施例4-5制备的中药组合物加至饲料中，拌匀，分别饲喂病鸡。红霉素对照组饲喂每千克基础日粮添加15万IU红霉素的饲料。空白对照组食用不加任何药物的饲料。连用7天。

治疗标准：1)痊愈：以病鸡咳嗽，喷嚏，雏鸡流鼻液，产蛋鸡产蛋量减少，呼吸道粘膜呈浆液性，卡他性炎症等症状消失为标准；2)有效：以病鸡咳嗽，喷嚏，雏鸡流鼻液，产蛋鸡产蛋量减少，呼吸道粘膜呈浆液性，卡他性炎症等症状缓解为标准；3)无效：症状未改善，精神高度沉郁，驱赶不走，食欲显著下降，甩头，咳嗽、打喷嚏、气管啰音。剖检可见气管环充血、出血，有较多浆液性、卡他性和干酪样渗出物；肺部支气管内可见出血，肾脏尿酸盐沉积。总有效率：有效和痊愈鸡数总和占该组鸡数的百分比。

表17本发明的口服液对IB鸡的临床治疗结果

本发明的制剂及阳性药治疗后，症状减轻，精神状态好转，采食量增加，咳喘症状消失等，仅个别鸡出现甩头，打喷嚏。结果显示，本发明的组合物均能有效缓解IBV引起的病鸡临床症状，总有效率达到94％以上，痊愈率和有效率较阳性对照组为高。