本发明属于医药产品研究开发技术领域。具体涉及一种托盘根提取物的制备及其应用。
背景技术：
：
肝损伤是一种常见的肝疾病，主要由氧化应激造成的系列损伤所致，容易演变成肝炎、肝纤维化、肝坏死，甚至肝硬化和肝癌。研究表明，很多中药及其活性成分具有明显的预防和治疗肝损伤的作用，因此，从天然药物中寻找和制备具有预防和治疗肝损伤的提取物及其制剂具有一定的理论意义和现实意义。
托盘根为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属植物山楂叶悬钩子(Rubus crataegifolius Bunge)的根，又名牛叠肚、马林果、树莓、托盘儿等，主要生长于东北、内蒙古、河北、山东等地，为分布广泛的药食同源植物。托盘根味苦、涩，性微寒，具有清热凉血、散结、止痛、利尿、消肿之功效，可用于治疗肝炎、风湿性关节炎、痛风等，民间广泛用于预防和治疗各种肝损伤。该植物含有黄酮、萜、鞣质、甾，以及少量醌、有机酸、生物碱等多种化学成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗过敏、保肝、镇痛、降糖、保护心脑血管、减肥降血脂、抗衰老、抗骨质疏松等多方面的药理活性，具有很高的医疗保健价值。
临床已经证明，托盘根对各类肝病具有预防、辅助保护、辅助修复和改善、缓解功能，并改善缓解由于各类肝损伤或肝郁脾弱或健康情况欠佳而引起的抑郁、烦躁、疲劳乏力、食欲不振、消化功能差等症状。中国专利CN1714834A中披露一种治疗乙肝、丙肝、肝炎、肝硬化的药物，其采用托盘根或以托盘根为主配以常规治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎、肝炎肝硬化的中药制成，治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎、肝炎肝硬化疗效较好，无副作用。
研究表明，托盘根中具有肝保护活性的主要有效部位是三萜类和黄酮类化合物，其能使急性肝损伤大鼠血清中ALT、AST以及MDA水平明显降低，GSH、SOD活性显著增强，对急性肝损伤有明显保护作用。然而，在现有应用中，托盘制剂仅仅是粉碎后直接制备成片剂、胶囊剂等，或仅仅经水煎煮、浓缩后，加入辅料制成制剂，工艺较为简单粗糙，有效部位不明确，存在大量没有治疗作用的无效物质，服用量大，严重的甚至会导致二次肝损伤的发生，其药效大打折扣，严重影响其肝保护的应用。
在现有技术中，以托盘根为原料、以总黄酮和总三萜类化合物为有效部位的托盘根提取物及其制备方法和工艺还没有涉及，因此，很有必要在明确托盘根对肝损伤保护作用的有效部位和药理活性成分的基础上，向深度和广度进一步研究，制备托盘根提取物，充分应用其有效部位和药理活性成分，去除无效甚至可能导致二次肝损伤的成分，应该具有良好的应用前景。
技术实现要素：
：
本发明所要解决的技术问题是提供一种托盘根提取物，同时提供托盘根提取物的制备方法。
本发明还提供了托盘根提取物在制备预防/治疗肝损伤药物和食品中的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种托盘根提取物，通过如下方法制备：
托盘根粉碎，用醇-水混合溶剂提取，提取液过滤、浓缩，浓缩液先用乙酸乙酯萃取后，再用正丁醇萃取，分别将乙酸乙酯和正丁醇萃取部位浓缩、去除有机溶剂，所得浓缩液合并，经大孔吸附树脂柱吸附，不同浓度的乙醇和水的混合溶液梯度洗脱，收集含三萜类化合物和黄酮类成分的洗脱部位，即得所述的托盘根提取物；其中该提取物含有重量百分比分别为40％～55％的总黄酮和30％～45％的总三萜类化合物。
本发明提供的托盘根提取物的制备方法，具体技术方案包括以下过程：
称取干燥后的托盘根，粉碎成粗粉；加入粗粉重5～50倍量体积的醇-水混合溶剂，提取0.5～24小时，提取1～3次，过滤，滤液合并，浓缩，得托盘根提取浸膏；
然后用0.5～3倍量体积的乙酸乙酯萃取1～5次，乙酸乙酯萃取液合并、浓缩去除乙酸乙酯，得托盘根乙酸乙酯萃取浓缩液，含有包括山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯、槲皮素-3-鼠李糖苷、根皮苷二水合物、齐墩果酸、2α,3α-二羟基齐墩-11,13(18)二烯-19β,28-内酯，熊果醇，山奈酚-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷等化学成分；
将托盘根乙酸乙酯萃取后的水层，蒸去乙酸乙酯，然后用0.5～3倍量体积的正丁醇萃取1～5次，正丁醇萃取部位合并、浓缩去除正丁醇，得托盘根正丁醇萃取浓缩液，含有玫红酸、肉豆蔻酸、2α,3α-二羟基齐墩-11,13(18)二烯-19β,28-内酯、3-羰基甘遂烷-7,24-二烯-21-酸、槲皮素-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷、胡萝卜苷等化学成分。
合并托盘根乙酸乙酯萃取浓缩液和正丁醇萃取浓缩液，所得浓缩液经大孔吸附树脂柱，依次用0％～10％的乙醇、40％～60％的乙醇洗脱，收集40％～60％乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，即得所述的托盘根提取物。
所述醇-水混合溶剂中，醇为乙醇或甲醇，醇浓度为0～100％，优选为：40～70％；
优选地，醇-水混合溶剂的体积为粗粉重量的8-10倍；提取时间为2～4小时；
所述的大孔吸附树脂为D-101、AB-8、HP-20、Amberlite XAD-4、DA-201、DM-130、DM-301、HPD-100、XDA-1，优选为D-101、HPD-100、HP-20；
优选地，进柱液浓度为相当于5～10g药材量/mL，药液吸附流速：2～3BV/h；
优选地，大孔吸附树脂依次用5％～10％的乙醇、40％～60％的乙醇洗脱；洗脱流速3～5BV/h。
本发明制备的提取物含有重量百分比分别为40％～55％的总黄酮和30％～45％的总三萜类化合物。
所述的总黄酮含有山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯、槲皮素-3-鼠李糖苷、根皮苷二水合物、山奈酚-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷等活性成分，所述的总三萜含有齐墩果酸、2α,3α-二羟基齐墩-11,13(18)二烯-19β,28-内酯，熊果醇，胡萝卜苷等活性成分。
本发明制备的托盘根提取物，对肝损伤具有显著的改善和保护作用，对CCl4所致肝损伤可以增强GSH、SOD活性及降低血清中ALT、AST以及MDA水平。
本发明的托盘根提取物可用于制备预防/治疗肝损伤的药物或保健食品。
本发明还提供了一种药物组合物，其含有治疗有效量的托盘根提取物和药学可接受的辅料，该提取物含有重量百分比为40％～55％的总黄酮和30％～45％的总三萜。
本发明的上述组合物，其可以为任何口服剂型或注射剂型，优选口服剂型，如片剂、胶囊、颗粒等。
本发明的积极效果在于：以托盘根为原料，提供有效部位明确、质量可控的托盘根提取物。以总黄酮和总三萜为有效部位、以提高得率和纯度为目的，采用常规提取方法，运用溶剂萃取方法结合大孔树脂吸附方法，制备托盘根提取物，通过色谱-光谱技术明确主要的、结构已知的药理活性成分。本发明提供的托盘根提取物对肝损伤有保护作用，可应用于肝病的预防、治疗和辅助治疗中，可用于制备对肝损伤具有保护作用的保健食品或药物。本发明的托盘根提取物具有如下突出特点：工艺简便，易于产业化；有效成分明确，质量可控；高效低毒；适应症广，市场容量大。
【具体实施方式】：
下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
步骤(1)：托盘根粗粉100g，加70％乙醇800ml浸泡1h，回流提取2h，过滤，收集滤液；滤渣再加70％乙醇600ml回流提取1.5h，过滤，收集滤液；合并滤液，减压浓缩至稠浸膏；
步骤(2)：将浸膏按1:2加水溶解稀释，然后按体积比1:2加乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯萃取部位浓缩。
步骤(3)：水层，挥尽乙酸乙酯，按体积比1:2加正丁醇萃取3次，将正丁醇萃取部位浓缩。
步骤(4)：合并(2)和(3)萃取物，加水稀释至相当于每1mL含5g药材，经D-101大孔吸附树脂吸附，10％乙醇洗脱3倍量柱体积；
步骤(5)：然后用50％乙醇洗脱8倍量柱体积，洗脱液减压浓缩，干燥，既得托盘根提取物，其中该提取物含有重量百分比分别为55％的总黄酮和45％的总三萜类化合物。
实施例2：
步骤(1)：托盘根粗粉100g，加800ml水浸泡0.5h，煎煮1.5h，过滤，收集滤液；滤渣再加600ml水煎煮1.0h，煎煮后过滤，收集滤液；合并滤液，减压浓缩至稠浸膏；
步骤(2)：将托盘根提取浸膏按1:1加水溶解稀释，然后按1:3加乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯萃取部位浓缩。
步骤(3)：水层，挥尽乙酸乙酯，按1:3加正丁醇萃取3次，将正丁醇萃取部位浓缩。
步骤(4)：合并(2)和(3)萃取物，加水稀释至相当于每1mL含7g药材，经AB-8大孔吸附树脂吸附，5％乙醇洗脱3倍量柱体积；
步骤(5)：然后用60％乙醇洗脱8倍量柱体积，洗脱液减压浓缩，干燥，既得托盘根提取物，其中该提取物含有重量百分比分别为40％的总黄酮和30％的总三萜类化合物。
实施例3：
步骤(1)：托盘根粗粉100g，加40％乙醇1000ml浸泡1h，回流提取2.5h，过滤，收集滤液；滤渣再加40％乙醇800ml回流提取1.5h，过滤，收集滤液；滤液合并，减压浓缩至稠浸膏；
步骤(2)：将托盘根提取浸膏按1:3加水溶解稀释，然后按1:1加乙酸乙酯萃取2次，将乙酸乙酯萃取部位浓缩。
步骤(3)：水层，挥尽乙酸乙酯，按1:1加正丁醇萃取3次，将正丁醇萃取部位浓缩。
步骤(4)：合并(2)和(3)，加水稀释至相当于每1mL含10g药材，经HP-20大孔吸附树脂吸附，8％乙醇洗脱3倍量柱体积；
步骤(5)：然后用40％乙醇洗脱6倍量柱体积，洗脱液减压浓缩，干燥，既得托盘根提取物，其中该提取物含有重量百分比分别为50％的总黄酮和41％的总三萜类化合物。
实施例4：
步骤(1)：托盘根粗粉100g，加70％乙醇800ml浸泡1h，回流提取2h，过滤，收集滤液；滤渣再加70％乙醇600ml回流提取1.5h，过滤，收集滤液；合并滤液，减压浓缩至稠浸膏；
步骤(2)：将浸膏按1:2加水溶解稀释，然后按体积比1:2加乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯萃取部位浓缩。
步骤(3)：水层，挥尽乙酸乙酯，按体积比1:2加正丁醇萃取3次，将正丁醇萃取部位浓缩。
步骤(4)：合并(2)和(3)萃取物，加水稀释至相当于每1mL含5g药材，经D-101大孔吸附树脂吸附，水洗脱3倍量柱体积，再用50％乙醇洗脱8倍量柱体积，洗脱液减压浓缩，干燥，既得托盘根提取物，其中该提取物含有重量百分比分别为35％的总黄酮和25％的总三萜类化合物。
结果说明，直接经50％乙醇洗脱获得的提取物其有效部位重量百分含量低于先经5～10％乙醇洗脱后获得的提取物有效部位重量百分含量。
实施例5：
步骤(1)：托盘根粗粉100g，加70％乙醇800ml浸泡1h，回流提取2h，过滤，收集滤液；滤渣再加70％乙醇600ml回流提取1.5h，过滤，收集滤液；合并滤液，减压浓缩至稠浸膏；
步骤(2)：将浸膏加水稀释至相当于每1mL含5g药材，经HPD-100大孔吸附树脂吸附，10％乙醇洗脱3倍量柱体积；
步骤(3)：然后用50％乙醇洗脱8倍量柱体积，洗脱液减压浓缩，干燥，既得托盘根提取物，其中该提取物含有重量百分比分别为26％的总黄酮和18％的总三萜类化合物。
结果说明，直接经大孔吸附树脂纯化不经乙酸乙酯和正丁醇萃取获得的提取物其有效部位重量百分含量相对较低。
实施例6：含有托盘根提取物的片剂处方和制法
处方
按照上述制剂的处方，取托盘根提取物，加入微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素，以95％的乙醇为黏合剂，过20目筛制软材，60℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁混匀压片，即得。
实施例7：托盘根提取物胶囊处方及其制法
处方
取托盘根提取物，加入预胶化淀粉，以75％的乙醇为粘合剂，过20目筛制软材，60℃干燥，整粒；干颗粒加入过100目的交联羧甲基纤维素钠和微粉硅胶，混匀，测定颗粒中指标成分含量，装入胶囊，装两约为0.1g，包装即得。
为进一步说明本发明的托盘根提取物对肝损伤的保护作用，下面提供托盘根提取物对肝损伤保护作用的药理实验结果。
托盘根提取物对小鼠肝损伤保护作用的实验
1实验材料、试剂
谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)以及BCA测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；水飞蓟素由中国材料研究中心提供；其他试剂均为分析纯。
实验动物为昆明种小鼠，雄性，4～5周，体重22～30g，购自沈阳药科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(辽)2010-0001
2实验方法
所用提取物均为由具体实施例1的方法制备得到。萃取液滤纸过滤，减压浓缩，真空干燥；将干燥后的乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及本发明托盘根提取物用生理盐水溶解，用于给药。
将72只小鼠适应性喂养5天后，随机分为9组，正常对照组、阴性(模型)对照组、阳性对照组，托盘根提取物高、低剂量组，乙酸乙酯提取物高、低剂量组，正丁醇提取物高、低剂量组。
阳性对照组：按200mg/kg将阳性药水飞蓟素给小鼠灌胃。低剂量组：每天按150mg/kg的给药剂量给小鼠灌胃；高剂量组：每天按300mg/kg的给药剂量给小鼠灌胃。正常对照组和模型组对照每日灌胃相同剂量的生理盐水。所有组均连续给药14天。
模型组和不同剂量给药组最后一次给药2小时后，按体重10mL/kg腹腔注射含0.1％CCl4的橄榄油，正常对照组给与相同体积的橄榄油，所有小鼠禁食不禁水。造模18小时后，摘除小鼠眼球取血0.5～1.0mL，离心分离血清，分别置于微量离心管中，-80℃低温贮藏，检测血清ALT和AST水平。小鼠脱臼处死，迅速取出肝脏，称重；匀浆，3500r/min离心15min，取肝脏上清液，测定SOD、GSH和MDA活性。
3结果
3.1对小鼠体重和肝组织重量的影响
托盘根提取物对小鼠体重和进食的影响与初始相比，各组之间无明显差异；相对肝指数组间比较未见统计学差异，表明托盘根对小鼠的食欲和体重无明显影响。
3.2 ALT、AST测定结果
表1 CCl4肝损伤小鼠血清ALT、AST测定结果
与空白对照组比较###P<0.001,##P<0.01；与模型组比较***P<0.001，**P<0.01,*P<0.05
结果显示，托盘根提取物能够增强CCl4诱导肝损伤小鼠血清的GSH、SOD活性，具有较好的保肝作用，并且经纯化后的提取物保肝活性更强。
3.3 GSH、SOD和MDA活性测定结果
表2 CCl4肝损伤小鼠血清GSH、SOD和MDA测定结果
与空白对照组比较###P<0.001,##P<0.01；与模型组比较***P<0.001，**P<0.01,*P<0.05
结果显示，托盘根提取物能够降低CCl4诱导肝损伤小鼠血清中ALT、AST以及MDA水平，具有较好的保肝作用，并且经纯化后的提取物保肝活性更强。
综上结果，提示托盘根提取物对四氯化碳诱导的急性肝损伤具有较强的抗氧化活性和明显的保护作用，并且经纯化后的提取物保肝活性增强，说明制备工艺的可行性与必要性。