本发明涉及一种共价缀合物，尤其涉及一种多糖和蛋白质通过共价结合而得的缀合物，以及制取该种缀合物的方法，和在肺炎链球菌疫苗制取中的应用。
背景技术：
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是链球菌属下的一种球状的革兰氏阳性菌，具有α溶血性。由肺炎链球菌引致的肺炎是在年幼或年长的人中最经常出现。肺炎链球菌也是一种普遍导致成人感染细菌性脑膜炎的病菌。此外，肺炎链球菌亦会导致不同种类的疾病，如：急性鼻窦炎、中耳炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心囊炎和蜂窝组织炎等。
治疗由肺炎链球菌疾病大多会使用β内酰胺类抗生素。早期，差不多所有肺炎链球菌的菌株都对青霉素敏感，随着抗生素使用率的提高，病菌对抗生素的抵抗亦发生上升的趋势。
自2000年起，一种七价的肺炎链球菌结合疫苗在美国被建议使用，主要适合2个月～23个月大的婴儿或2岁～5岁的孩童，可以保护孩童免受肺炎链球菌的深层感染，如：败血病及脑膜炎。
肺炎链球菌在人和动物体内可产生荚膜。根据荚膜内多糖抗原性的不同已将肺炎球菌分为91个血清型。
中国发明专利申请200680017776.8公开了一种多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物，其包含13种不同的多糖-蛋白质缀合物，以及生理学上可接受的载体，其中每种缀合物包含缀合到载体蛋白的来自不同血清型的肺炎链球菌的夹膜多糖，并且所述夹膜多糖从血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F制备，其中所述载体蛋白是CRM197。
在现有上市产品中，已经出现了15价的疫苗，但此类疫苗所能实现的免疫覆盖率仍有待进一步提高。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种具有免疫原性的多糖-蛋白质缀合物，以利于制造多价肺炎球菌多糖结合疫苗。
本发明的另一个目的在于提供一种制取多价肺炎球菌多糖结合疫苗的方法，通过对优化荚膜多糖与载体蛋白的结合工艺，提高结合效率和缀合物收获率，提高缀合物 原液的稳定性和免疫原性，获得具有免疫原性的多糖-蛋白质缀合物，便于后续的纯化和应用。
本发明的再一个目的在于提供一种具有免疫原性的多糖-蛋白质缀合物在制备肺炎链球菌结合疫苗中的应用。
一种具有免疫原性的多糖-蛋白质缀合物，由来自于肺炎链球菌的多糖与蛋白质组成缀合物，荚膜多糖的血清型为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、16F、17F、18C、19A、19F、20、20F、23A、23F和33F的荚膜多糖。
另一种具有免疫原性的多糖-蛋白质缀合物，将来自于肺炎链球菌的荚膜多糖降解为200,000Da～300,000Da的多糖，而与CRM197蛋白质组成缀合物。
本发明提供的肺炎链球菌荚膜多糖的制取方法如下：
将灭活的肺炎球菌离心，收集上清液，经超滤浓縮，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，离心收集上清液；经离心的上清液再经过三次乙醇沉淀，离心收集沉淀即为粗制多糖；
将粗制多糖溶于水，经超滤膜浓缩透析，除菌过滤后上羟基磷灰石柱层析柱，分别收集各种组分(流穿液(Flow-through)和1～3个柱体积的洗脱液(Elution))，经超滤膜浓缩透析，透析收集液中加入乙醇，离心收集沉淀，即得精制的荚膜多糖。
为了取得降解的荚膜多糖，先采用物理剪切将肺炎链球菌荚膜多糖进行降解，再超滤富集，获得降解的荚膜多糖。
均质的作用在于均匀分散同一体系内的不同成分，打散或细化液体中的不溶相颗粒，形成稳定均一的溶液。
物料在柱塞的推动作用下进入均质阀，在均质阀内被加压并排放。在此过程中，物料受到多种作用：气穴作用，强烈湍流的高频振动作用，与均质阀边缘的剪切作用，与均质阀挡环的撞击作用。
均质可分为：珠磨法(属于固体剪切作用，可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难)、高压均质法(属于液体剪切作用，可达较高破碎率，可大规模操作，对于少量物料＜100ml，难操作)、超声破碎法(属于液体剪切作用，对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作)，以及X-press法(属于固体剪切作用，破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合)。
一种制取具有免疫原性的多糖-蛋白质缀合物的方法，将26种经纯化的血清型肺炎链球菌荚膜多糖(或其各自降解的多糖)分别制成浓度为10mg/ml的多糖溶液，然后向多糖溶液中分别加入50mg/ml～100mg/ml激活剂，后用0.2mol/L的三乙胺或氢氧化钠调整pH值至8.70～9.70，活化1分钟～5分钟后加入载体蛋白，再次用0.2mol/L的三乙胺或氢氧化钠调整pH值(8.90～9.60)，室温下反应30分钟～60分钟，加入终止剂后再反应16小时～24小时，即得结合物原液。
激活剂如：1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸、溴化氰和高碘酸钠等。这些化合物 单独和组合应用于本发明。用量为多糖(即降解的荚膜多糖)重量的50w/w％～100w/w％，如：但不仅限于50w/w％、55w/w％、60w/w％、65w/w％、70w/w％、75w/w％、80w/w％、85w/w％、90w/w％、95w/w％和100w/w％等，尤其是65w/w％～80w/w％。
各种血清型的肺炎链球菌荚膜多糖(或其降解糖链)与CRM197蛋白相互作用的pH为8.90～9.60。
经验证，所制取的多糖-蛋白质缀合物具有免疫原性，再加入赋形剂和助剂制成用于肺炎链球菌防治的疫苗的。
本发明技术方案实现的有益效果：
免疫原性的多糖-蛋白质缀合物，将26种血清型肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白结合制得具有免疫原性的多糖-蛋白质缀合物，血清覆盖率达90％以上，对2月龄以上的人群均有保护效果。
具体实施方式
以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明以下实施例的1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、16F、17F、18C、19A、19F、20、20F、23A、23F和33F等共计26种血清型肺炎链球菌购自瑞典哥德堡大学菌种保藏中心(CCUG)，并按肺炎球菌菌种检定要求进行全检。
以下以制备1型肺炎球菌荚膜多糖为例，说明荚膜多糖的制备过程。
(1)制备主种子批和工作种子批
从瑞典哥德堡大学菌种保藏中心(CCUG)菌株得到1型肺炎球菌。以此菌株进行扩增细菌，首先制备主种子批，再从主种子批扩增生产工作种子批，从而产生两个其它的种子批。这些种子批细菌采用脱脂牛奶进行冻干，冻干菌株冷藏保存。冻干前，通过离心浓缩细菌，除去培养基，将细菌沉淀物重新悬浮在脱脂牛奶中，并利用冻干机进行冻干。
(2)发酵和收获
来自工作种子批的培养物用于接种基于大豆蛋白的培养基的种子瓶。将瓶子在35℃～37℃、5％CO2的培养箱中培养到满足生产需要。种子批接种含有大豆蛋白培养基的种子发酵罐，用氢氧化钠溶液保持pH在6.8～7.5范围，并控制转速50～110rpm。达到目标OD600值后，将种子发酵罐的培养菌液接种含有基于大豆蛋白培养基的生产发酵罐，用氢氧化钠溶液保持pH在6.8～7.5范围，并控制转速50～110rpm。细菌浓度在OD600值达到一定范围时加入补充培养基，待生长停止后终止发酵。发酵结束后，向培养菌液中加入适量甲醛进行灭活，完成后加入适量脱氧胆酸钠用来裂解细菌细胞和释放细菌的多糖。裂解后进行离心，收集离心上清液。
(3)纯化
肺炎球菌多糖的纯化由几次浓缩透析、至少经过多次乙醇沉淀后，离心收集，根据情况还使用柱层析和深层过滤等步骤。
将上述发酵罐培养、离心收集的上清液用50KDa～100KDa超滤膜浓缩，使用注射用水进行透析。透析从大分子的生物聚合物中除去低分子量的培养基成分。
向浓缩透析液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，使其终浓度在0.3w/w％～1.0w/w％，乙醇沉淀杂质。
沉淀用注射用水溶解后先分别用不同缓冲液进行透析，后用注射用水进行透析；透析液用0.22μm膜过滤，获得滤过液。
用缓冲液平衡好羟基磷灰石柱，然后将上述滤过液装载柱子。在这些条件下，杂质结合到基质，而多糖会流过柱子，从而可通过收集流穿液回收多糖。
收集的多糖溶液用50KDa～100KDa超滤膜浓缩，使用注射用水进行透析。收集的透析液用乙醇沉淀，离心收集沉淀，并利用冻干机将沉淀冻干，获得的精制的荚膜多糖在-20℃冷冻保藏。
荚膜多糖按如下要求进行质量鉴定：
精制纯化多糖通常应在-20℃以下储存，以维持其稳定性。为控制精制纯化多糖的质量应进行的测定包括：(1)鉴别试验：通常采用双向免疫扩散方法，肺炎球菌多糖应与对应的肺炎球菌多糖抗血清产生沉淀线；(2)磷含量：应采用钼酸铵法测定纯化多糖的磷含量；(3)固体总量：采用干烤法测定固体总量；(4)总氮含量：采用凯氏定氮法测定纯化多糖的总氮含量，(5)蛋白含量：应采用Lowry法、BCA法等方法测定纯化多糖中蛋白杂质的含量，应同时采用相应的国家标准品作蛋白测定对照；(6)核酸含量：应采用分光光度法在紫外260nm测定纯化多糖中核酸杂质含量；(7)多糖含量：应采用特定的方法测定多糖含量，如采用碱性盐酸羟胺-三氯化铁法测定O-乙酰基含量、采用咔唑-乙醇溶液法测定糖醛酸含量、采用半胱氨酸显色法测定甲基戊糖含量和采用二氨基苯甲醛显色法测定氨基己糖含量等方法；(8)内毒素：应采用鲎试验定量(凝胶限量试验)测定方法测定纯化多糖中的内毒素含量；(9)分子大小分布(Kavg)：应采用高效液相色谱(HPLC)方法测定纯化多糖的分子大小分布，并建立相应的Kavg值合格标准；(10)无菌检查：采用膜过滤法对多糖进行检查，应无菌生长。
将26种经纯化的血清型肺炎链球菌荚膜多糖(或其各自降解的多糖)分别制成浓度为5～10mg/ml的多糖溶液，然后向多糖溶液中分别加入50mg/ml～100mg/ml激活剂，后用0.2mol/L的三乙胺或氢氧化钠调整pH值，活化1分钟～5分钟后加入载体蛋白，再次用0.2mol/L的三乙胺或氢氧化钠调整pH值(8.90～9.60)，室温下反应30分钟～60分钟，加入终止剂后再反应16小时～24小时，即得结合物原液。
结合物原液按如下方法鉴定
(1)蒽酮法测定多糖含量。
糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合形成呈蓝绿色的糠醛衍生物，620nm处有最大吸收，在一定范围内，其溶液的吸光度值A与糖含量成正比，从而测定溶液中总多糖和游离多糖的含量。
(2)Lowry法测定蛋白含量。
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在吸收峰波长下进行比色，利用光吸收值与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。
(3)分子大小分布：结合物原液应逐批进行相对分子大小的测定，可采用凝胶过滤或高压液相色谱等方法进行测定；
结合物原液再经超滤膜浓缩透析，除菌过滤后添加赋形剂和佐剂等配制即为结合疫苗。多糖结合疫苗按如下方法鉴定：
(1)多糖测定及鉴别
采用速率比浊法进行检测，每批单型多糖与其相应的特异性抗血清产生免疫反应聚合物，并可以测出多糖含量，并且每个血清型的多糖含量为标示量的70％～130％。特异性抗血清由国家检定机构分发或经认可。
(2)佐剂含量：采用适宜的方法检测成品中佐剂的含量，所使用的佐剂及其用量应符合国家有关规定。如果所使用的佐剂为铝佐剂，每人用剂量中的佐剂含量应不超过1.25mg；
(3)防腐剂含量：选择防腐剂时应该考虑防腐剂的稳定性，应避免选择可能与疫苗成分产生相互作用的防腐剂。如果疫苗中加入了防腐剂，应采用符合国家规定的方法测定成品中防腐剂的含量。所加入的防腐剂及其含量应符合国家有关规定，即应不破坏疫苗的免疫效果，也不会损害人体健康；
(4)内毒素含量：采用家兔热原试验或鲎试验定量测定内毒素含量；
(5)异常毒性试验：符合现行版《中国药典》的要求；
以1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(CDAP)作为多糖活化剂，活化纯化的荚膜多糖(未降解)，并与CRM197进行偶联结合(参见FEBS Letters，1983，154，209～210)，制得多糖-CRM197蛋白缀合物。
具体方法为：将26种经纯化的血清型肺炎链球菌荚膜多糖或其各自降解的多糖 分别制成浓度为5mg/ml～10mg/ml的多糖溶液，然后向多糖溶液中分别加入50mg/ml～100mg/ml激活剂，后用0.2mol/L的三乙胺或氢氧化钠调整pH值至8.70～9.70，活化1分钟～5分钟后加入载体蛋白，再次用0.2mol/L的三乙胺或氢氧化钠调整pH值至8.90～9.60，室温下反应30分钟～60分钟，加入终止剂后再反应16小时～24小时，即得结合物原液，含有多糖-CRM197蛋白缀合物。再经超滤膜浓缩透析获得多糖-CRM197蛋白缀合物。
中间取样检测KD值(表征多糖与蛋白结合率的常数)，待反应结束后将反应缀合物进行澄清、浓缩及超滤透析，以去除游离蛋白和反应试剂。
还通过物理剪切各种血清型的荚膜多糖，得到降解的荚膜多糖。
本实施例使用ATS均质机，具有破碎效率高、处理量大、瞬间破碎，物料停留时间少于1秒，以及在位冷却(保证出料温度低于10度)等特点。
经Sephacry1S-300(XK-50)柱分离纯化，分段收集，得到分子量区间为200,000Da～300,000Da的若干多糖。利用高压液相技术测定分子量，从而对大分子多糖的物理剪切工艺进行优化。
通过1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(CDAP)作为多糖活化剂，活化纯化的经物理剪切降解的荚膜多糖，并与CRM197进行偶联结合(参见FEBS Letters，1983，154，209～210)，制得降解多糖-CRM197蛋白缀合物。再经超滤膜浓缩透析，用于后续的检测。
具体方法为：降解后的荚膜多糖溶液(5mg/ml～10mg/m1)与CDAP溶液(CDAP用量为多糖总量的50w/w％～100w/w％)混合，用调整pH至8.90～9.60，室温激活1分钟～5分钟。然后加入CRM197蛋白，室温作用30分钟～60分钟；再加入过量甘氨酸终止反应体系，室温30分钟。最后将反应物置于2℃～8℃反应16小时～24小时，即得降解多糖-CRM197蛋白缀合物。
中间取样检测KD值(表征多糖与蛋白结合率的常数)，待反应结束后将反应缀合物进行澄清、浓缩及超滤透析，以去除游离蛋白和反应试剂。
采用HPLC检测缀合物的KD值，利用蒽酮法检测原液中的总多糖含量和游离多糖含量，Lowry法检测原液中总蛋白含量，以及HPLC测定游离蛋白含量及残留试剂等。
经验证，制得多糖-CRM197蛋白缀合物或降解多糖-CRM197蛋白缀合物实现的血清覆盖率达90％以上，能对2月龄以上的人群产生保护效果。
向制备的26价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合物混合原液中加入佐剂和赋形剂制成结合疫苗(包括多糖降解和未降解)，免疫16g～22g的NIH小鼠，各种免疫物质的多糖含量除血清型6B型为8.8mg/ml外，其它多糖含量均为4.4mg/ml，每组接种小鼠6只，0、14、28天腹腔注射0.5ml，第42天采血，采用ELISA方法践行血清抗上述所有血清型肺炎球菌荚膜多糖的抗体滴度。
结果表明，26种血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物混合原液(未降解多糖) 与26种血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物混合原液(降解多糖)免疫小鼠后，血清的抗IgG比阴性对照有显著升高，两者相对于同意血清型的肺炎球菌荚膜多糖的抗体水平无显著差异；26种肺炎球菌结合疫苗与26种血清型肺炎球菌结合疫苗(降解多糖)免疫小鼠后，血清的抗IgG也明显高于阴性对照，两者相对于同意血清型的肺炎球菌荚膜多糖的抗体水平无显著差异。26种肺炎球菌结合疫苗的抗体水平明显高于阴性对照，并且高于26价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物的混合物。所以，吸附到铝佐剂后打的抗体水平比未吸附的多糖-蛋白组合物高一些。