本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种利用细胞生物反应器进行全悬浮无血清的方式培养生产兽用狂犬病灭活疫苗的方法。
背景技术：
狂犬病(Rabies)是人类认识较早的，由狂犬病毒(Rabies Virus)引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。狂犬病毒属于核糖核酸型弹状病毒，通过破损的皮肤或粘膜侵入人或动物机体，一旦感染发病，死亡率达100％。狂犬病是死亡率最高的传染病，全世界每年约有5万人左右死于狂犬病，其中90％在亚洲。目前，国内狂犬病发病人数比例仍很高，仅次于印度，属于世界上狂犬病严重流行的国家之一。《中华人民共和国传染病防治法》将狂犬病列为乙类传染病。动物是狂犬病毒的主要携带者，目前世界上针对狂犬病没有特别有效地治疗方法，对动物进行狂犬病免疫接种是唯一的高效预防防御措施。
动物狂犬病预防疫苗包括弱毒苗和灭活苗。前期，弱毒疫苗在国内广泛使用，但由于弱毒苗存在着毒力返祖及散毒的潜在危险，在发达国家和地区早已停止使用。世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)提倡使用狂犬病灭活疫苗来控制狂犬病。目前我国已基本采用狂犬病灭活疫苗。
国内狂犬病灭活疫苗的生产方法主要有转瓶培养法和微载体悬浮培养法，两种方法都存在着缺陷。转瓶培养法生产的半成品抗原效价较低，需要浓缩，且劳动强度大，生产周期长，污染风险大。微载体悬浮培养法虽然能够有效地增殖细胞，但微载体的使用成本高、且不易进行放大培养。目前，国内狂犬病疫苗生产中使用的是含血清培养基，由于添加的血清存在着不易纯化、携带外源病毒、批次间质量不同等问题，造成生产的疫苗安全性差、质量不稳定，易诱发机体产生过敏性反应。自动化程度低、生产技术落后、病毒株抗原性差、生产细胞维持时间短、病毒产量低、疫苗潜在着过敏性反应、成产成本高等问题严重影响着我国狂犬病灭活疫苗的发展。因此一种安全、有效、自动化程度高、病毒抗原性好、产量高的生产方法是国内狂犬病灭活疫苗生产所需要的。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的问题之一。
本发明要解决的技术问题之一在于克服国内狂犬病灭活疫苗生产上的不足，为兽用狂犬病灭活疫苗的生产提供一种新型、安全、有效的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供一种制备兽用狂犬病疫苗的方法。
所述方法是利用细胞生物反应器全悬浮无血清的方式培养生产兽用狂犬病疫苗，具体包括如下步骤：
(1)利用细胞生物反应器对狂犬病毒株PV/BHK-21适应的BHK-21细胞进行全悬浮、无血清、连续灌流培养，至细胞密度达到2～4×106cell/ml时，采用狂犬病毒株PV/BHK-21进行病毒感染，而后进行多次病毒收获，至病毒滴度达107.5TCID50/ml；
(2)对步骤(1)中收获的病毒原液进行过滤系统处理和灭活，辅之以佐剂，制成狂犬病灭活疫苗。
其中，狂犬病毒株PV/BHK-21适应的BHK-21细胞选用的为幼年仓鼠肾细胞系，自美国ATCC引进；狂犬病毒株PV/BHK-21自美国引进。根据中华人民共和国农业部公告第683号，附件四《兽用生物制品菌(毒、虫)种种子批建立试验技术指导原则》的规定，对原始毒种进行繁殖鉴定，建立了生产用毒种(PV/BHK-21)的基础毒种库和生产毒种库。
进一步的说，所述无血清培养基为DMEM(Gibico)，所述BHK-21细胞在细胞生物反应器中的培养条件为：细胞接种量为1.0～2×105cell/ml，细胞生物反应器转速为50～80rpm，溶氧值为30～60％，pH值为7.0～7.4，灌流速度为1～3体积/天。
更进一步的说，所述采用狂犬病毒株PV/BHK-21对其适应的BHK-21细胞进行病毒感染这一步中，病毒接种量MOI为0.01～5，培养温度为32～34℃，pH值为7.0～7.4，病毒收集时间为自病毒接种后，连续收获6～12天。
进一步的说，所述狂犬病毒灭活剂为β-丙内酯，其中：β-丙内酯：病毒液(V:V)为0.5～1.5：4000。优选为：β-丙内酯：病毒液(V:V)为1：4000。灭活步骤为将β-丙内酯以上述比例加入病毒样品，4℃过夜，再经37℃水浴水解2小时。
更进一步的说，所述佐剂为氢氧化铝胶，终浓度为0.5～1mg/ml。
采用本发明提供的制备兽用狂犬病疫苗的方法与现有公开的技术方案相比具有的优势为：
1、本发明采用细胞生物反应器进行全悬浮连续灌流培养。采用巴斯德株(PV/BHK-21)狂犬病毒，对PV/BHK-21适应性好的BHK-21细胞进行病毒感染，连续收获病毒，BHK-21细胞密度可达4×106cell/ml，病毒滴度可达107.5TCID50/ml，极大提高了疫苗的产量和产能。收获的病毒原液只需经过简单的过滤系统处理和灭活，辅之以佐剂，定量分装即可获得高质量的疫苗产品。无需经过传统的病毒液浓缩等工艺，节约成本，流程简单，工艺稳定，质量可控，产能量高。
2、疫苗生产中采用无血清培养法，无血清培养基的使用消除了由血清造成的疫苗批次间质量不稳定等问题；无需添加血清，降低生产成本；简化提纯程序；避免了血清源性污染(病毒、细菌等污染)和诱发的机体过敏性反应，增加疫苗的安全性和稳定性。
3、采用的PV/BHK-21病毒抗原性好。BHK-21细胞是国际认可的兽用生产疫苗细胞，高效、安全。灭菌后无致瘤性，制得的疫苗免疫性高、安全性好。
4、疫苗生产过程中的原材料均采用国产产品，疫苗成产直接成本远低于进口疫苗。
具体实施方式
下文将结合具体实施例详细描述本发明方法的具体实施方式及效果。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
以下实施方式中使用的狂犬病毒株为WHO认可的适应幼仓鼠肾细胞系(BHK-21)的狂犬病毒固定毒。PV/BHK-21株，自美国引进。生产用细胞为狂犬病病毒的高产细胞BHK-21细胞，自美国ATCC引进。
1、细胞制备：
取冻存的工作细胞库细胞，将细胞分散到75cm2的细胞瓶中，加入适量无血清培养基。于37℃培养24～36小时，按一定分散率将细胞传到新的培养瓶中，补加新的无血清培养基，继续37℃培养，收集细胞。以同样的方法进行传代，扩大培养，直到扩增到需要的细胞数量。以1×105cell/ml细胞密度接入细胞生物反应器进行全悬浮无血清连续灌流培养，37℃培养至细胞密度为2.0～4×106cell/ml时，用于接毒。
2、病毒接种、培养和收获：
对细胞密度达到2.0～4×106cell/ml的BHK-21细胞进行接毒。病毒接种量MOI＝0.01～5，培养温度为32～34℃，pH值为7.0～7.4，培养时间为6～12天。根据细胞生长情况，进行1～3体积/天的病毒收获，病毒滴度达107.5TCID50/ml。病毒收集完成后，于2～8℃条件下保存，不超过30天。
3、病毒液过滤：
为了去除残留细胞及细胞碎片，保证疫苗的质量，将每批收集的病毒原液经过过滤系统处理。结果显示，经过过滤系统处理后，病毒原液中细胞及细胞碎片全部被清除，病毒滴度基本无变化，系统残留少，损失率低。
4、病毒灭活：
参考WHO及国内外兽用狂犬病疫苗生产的灭活工艺资料，采用1:4000β-丙内酯对每批狂犬病毒进行4℃过夜灭活处理。为了确保β-丙内酯完全水解，灭活的病毒液需再经37℃水解2小时。
5、免疫佐剂：
将每批灭活的病毒抗原与氢氧化铝胶佐剂混合，搅拌均匀，定量分装。氢氧化铝胶佐剂的终浓度为0.6mg/ml。
6、疫苗效力检验：
将3批实验室制品疫苗分别进行NIH法效力检测，参考疫苗购自中国兽医药品监察所。根据检测结果，3批实验室制品疫苗效价均大于2.0IU/ml。
7、疫苗安全性评价：
将3批实验室制品疫苗分别进行安全性试验，试验内容包括对8～14周龄比格犬进行一次单剂量接种、单剂量重复接种和一次超剂量接种的安全性试验。试验结果表明，在三组试验中的所有接种试验犬中，均未出现局部红、肿、疹块或硬块，或在接种部位出现局部溃疡，发炎等症状。所有比格犬的精神状态，行为活动、排便、摄食等临床表现正常。实验室制备的3批制品接种适宜日龄犬，安全性良好。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。