本发明属于中药领域，尤其涉及一种构树叶总酚酸新的提取方法及其应用。
背景技术：
构树（Broussonetia papyrifera）为桑科构树属植物，分布于我国黄河、长江、珠江流域，在日本、越南、印度等国亦有分布，资源十分丰富。构树的成熟果实，称为“楮实子”，收载于历版《中国药典》，为常见中药，具有补肾清肝、明目利尿的功效。构树叶又称为楮叶，性凉味甘，无毒，能清热利湿，凉血止血，杀虫解毒，可用于治疗吐血、衄血、血崩、外伤出血、水肿、疝气、痢疾和癣疮、更年期综合症、抗病毒和前列腺炎等疾病。
从20世纪80年代开始，人们开始对构树的化学和药理进行研究。例如：从构树的整株植物中分离得到了多个黄酮类化合物（Lee D，Bhat K，Fong H et al. Aromatase inhibitors from Broussonetia papyrifera [J].J. Nat. Prod，2001，64 (10): 1286-1293）；对构树叶的乙醇提取物（BPAE）与总黄酮苷（BPF）对家兔和豚鼠离体心房的作用进行了研究（高允生，邱玉芳，高聆等. 构树叶醇提取物与黄酮苷对离体心房的抑制作用[J]. 中国药理学通报，1988，4(2)：122-123），发现BPAE和BPF均有抑制家兔和豚鼠心房收缩的作用，且BPF的效价强度远大于BPAE，证实了BPF是构树抑制心房收缩的主要有效成分，构树叶具有类似钙拮抗剂的作用。构树叶中除黄酮外，还含有其它含有酚羟基物质，如木脂素等，这些物质统称为酚酸类物质（Ran Xiao-Ku, Wang Xiao-Tong,Liu Pei-Pei, Chi Yu-Xin, Wang Bo-Jia, Dou De-Qiang, Kang Ting-Guo, Xiong Wei.Cytotoxic constituents from the leaves of Broussonetia papyrifera.Chinese Journal of Natural Medicines 2013,11(3):269-273.）。在对构树叶的研究中，发现总酚酸具有较好的抗癌作用（CN102319291B一种构树叶总酚酸提取物及其在制备抗癌药物中的应用），未再见有其他的药物应用研究相关报道。
帕金森病（PD）是以中脑黑质多巴胺能神经元渐进性死亡为病理特征的中枢神经系统退行性疾病。目前治疗手段主要以西药为主，但西药只改善症状，不能控制其进程，长期应用疗效减弱且毒副性增大，而中医药是通过调节机体整体状况而起作用，药性平和，毒副作用小。中药在保护神经细胞，抑制氧化应激反应，抗兴奋性毒性等方面研究成果为长期治疗帕金森病，有效控制帕金森病进程奠定了良好的基础，近年来，中药治疗帕金森病已成为临床主要治疗手段之一。并且，如果患者单纯服用中药能有效控制早期帕金森病症状，既能避免西药的毒副作用，又能大大增强患者服药的依从性；因此，从中药中发现抗帕金森的有效部位，并进行新药研发，显得尤为重要。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种构树叶总酚酸提取物的新提取方法，并且该提取物用于制备抗帕金森病药物中的新用途，该药物针对性强，无毒副作用。
为实现上述目的，本发明提供一种构树叶总酚酸提取物的新提取方法，具体包括以下步骤：取适量自然干燥的构树叶，粉碎成粉末；将构树叶粉末放入超临界CO2萃取釜中，先用85%乙醇作为夹带剂, 萃取时间为1.5 h，萃取压力为40.0 MPa，萃取温度为50℃，CO2流量为10 kg· h-1 ，分离压力为5.8 MPa，分离温度为40℃；提取后所得的乙醇液，经减压浓缩，减压干燥，得构树叶总酚酸提取物。
所述的构树叶总酚酸提取物中，总酚酸含量大于50%，叶总酚酸提取物中大波斯菊苷含量3-7%，3, 5, 4′-三羟基-二苯乙基-3-O-β-D-葡萄糖苷(3, 5, 4′-trihydroxy-bibenzyl-3-O-β-D-glucopyranside)为1-3%。
所述的构树叶总酚酸提取物用于制备抗帕金森药物。
本发明的有益效果。
本发明采用超临界流体从构树叶中获得较高含量的总酚酸，构树叶总酚酸提取物的总酚酸含量测定采用下述文献报道的比色法对总酚酸的含量进行测定：石玉媛，何凡，李莹莹，窦德强，康廷国，董锋.不同产地亚贡叶中总酚酸的含量测定.中华中医药学刊，2010，28（7）：1475-1477。我们在对抗帕金森病中药有效成分筛选过程中发现构树叶总酚酸具有良好的抗帕金森病的作用，经体内试验和血清药理学评价均发现构树叶总酚酸具有较好的抗帕金森作用。本发明提取方法获得的的构树叶总酚酸提取物，方法简便，成本低，纯度高，为其开发成为抗帕金森病的药物奠定了基础。
附图说明
图1构树叶样品高效液相色谱法测定色谱图；其中I为大波斯菊苷，II为3, 5, 4′-三羟基-二苯乙基-3-O-β-D-葡萄糖苷。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1。
制备构树叶总酚酸提取物：构树叶（包括叶柄），自然干燥后粉碎成20目的粉末；称取构树叶粉末200克，放入超临界CO2萃取釜中（仪器型号：HSCE-50-1，大连卓尔高科技有限公司生产）；按照如下条件进行提取：85%乙醇（乙醇和水的体积比）为夹带剂, 萃取时间为1.5 h，萃取压力为50.0 MPa，萃取温度为50℃；CO2 流量为10 kg• h-1，分离压力为5.8 MPa，分离温度为40℃；提取后所得的乙醇液，经减压浓缩得浸膏，进一步经减压干燥，得构树叶总酚酸提取物。
总酚酸提取物重量为16.2g，测得总酚酸为8.93g，占所述干燥后的总酚酸提取物的重量百分比为55.1%，占构树叶原料药材总重的百分比为4.5%；总酚酸提取物中，大波斯菊苷含量为5.21%，3, 5, 4′-三羟基-二苯乙基-3-O-β-D-葡萄糖苷含量为1.78%。
1. 总酚酸的测定方法，具体操作过程如下。
精密称取10mg的总酚酸提取物于10毫升容量瓶中，加甲醇超声溶解、定容，制备供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，于25ml量瓶中，加甲醇5ml，加0.3%十二烷基硫酸钠2ml后，然后加0.6% FeCl3.6H2O：0.9%K3[Fe(CN)6]为1：1（体积比)的混合溶液2ml，在暗处放置5min，加0.1mol/l HCl溶液至刻度，在暗处放置20min，以显色剂为空白，以绿原酸为对品，在746nm处测定吸光度。根据绿原酸的标准曲线方程Y=145.2X+0.0303(r=0.9997，线性范围0.002 -0.005 mg/mL。其中Y为吸光度,X为对照品溶液浓度(mg/mL ))，进行定量分析。
2.大波斯菊苷和3, 5, 4′-三羟基-二苯乙基-3-O-β-D-葡萄糖苷含量的测定采用高效液相色谱法，色谱条件如下：仪器为Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）, 色谱柱：Kromasil C18 100A (5μm, 250×4.6mm)；以甲醇为流动相A，以0.5%磷酸水为流动相B，梯度洗脱：0分钟为35%A，25分钟为45%A，检测波长为265 nm；柱温为30℃；进样量为10μL；运行时间25min，测定结果见图1。
供试品溶液制备：精密称取10mg的总酚酸提取物于10毫升容量瓶中，加甲醇超声溶解、定容，制备供试品溶液。进样前用0.45μm滤膜过滤，备用。
标准品溶液的制备：精密称取大波斯菊苷和3, 5, 4′-三羟基-二苯乙基-3-O-β-D-葡萄糖苷样品（自制，纯度大于98%）5mg,甲醇定容于20ml容量瓶中。
3.构树叶总酚酸提取物抗帕金森作用研究。
3.1.实验材料。
C57BL/6小鼠购自大连医科大学动物实验中心，所用构树叶总酚酸提取物为采用上述方法制备。
3.2.动物分组。
将50只C57BL/6小鼠随机分为4组：空白组、模型组、阳性药组（多巴丝肼片（美多芭），上海罗氏制药有限公司）和总酚酸高、低剂量组，每组10只。
3.3.造模及给药方法。
模型组、阳性药组、构树叶总酚酸高和低剂量组皮下注射MPTP （购于Sigma公司，批号：1001054803） 25 mg/kg，每天一次，连续4天。空白组以腹腔注射等量生理盐水代替MPTP，每天一次，连续4天。第5天开始，继续皮下注射MPTP，同时构树叶总酚酸高、低剂量组分别给药150mg/kg、75mg/kg，每天给药一次，连续给药9天。阳性药组每天给予50mg/kg的多巴丝肼片,空白组和模型组每天给予等量的生理盐水。每天对小鼠进行动物行为学实验考查。
3.4.行为学考查。
3.4.1悬挂实验。
目的是检测C57BL/6小鼠肢体运动协调情况。给予构树叶总酚酸后的第7、8和9天，将受试小鼠悬挂于一水平电线上，电线直径约为0.2mm。从小鼠双前爪抓住电线开始计时，小鼠掉落则计时结束。25秒以上的记6分；20-25秒记5分；15-20秒记4分；10-15秒记3分；5-10s记2分；0-5s记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析。分值越高，小鼠抓住电线越牢固；说明小鼠肢体运动协调情况越好，反之，则说明小鼠震颤、肌强直等情况严重。实验结果见表1。
表1 悬挂实验得分结果（±s）。
注：△与空白组比较，有差异（p<0.05）；△△与空白组比较，差异显著（p<0.01）；▲与模型组比较，有差异（p<0.05），▲▲与模型组比较，有显著差异（p<0.01）。
3.4.2 爬杆实验。
目的是检测C57BL/6小鼠肢体运动协调情况。于给予构树叶总酚酸的第7、8和9天，将直径为2.5 cm的软木球固定于一根长50 cm，直径1 cm的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录小鼠爬完杆子所需要的时间。然后按以下标准记分：0-3 秒内完成上述动作的记6分；3-6 秒内完成的记5分；6-9秒内完成的记4分；9-12秒内完成的记3分；12-15秒内完成的记2分；15秒以上的记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析。分值越高，小鼠爬完杆子的全程所用的时间越少，说明小鼠肢体运动协调情况越好，也说明小鼠对爬杆实验越来越熟练，实验结果见表2。
表2 爬杆实验得分结果 （±s）。
注：△与空白组比较，有差异（p<0.05）；△△与空白组比较，差异显著（p<0.01）；▲与模型组比较，有差异（p<0.05），▲▲与模型组比较，有显著差异（p<0.01）。
3.4.3游泳实验。
目的是检测C57BL/6小鼠肢体运动协调情况。于给予构树叶总酚酸提取物的第7、8和9天，将受试小鼠放入一个20 cm × 30cm × 20 cm 规格的水箱中，水温为22℃-25℃。记录1min内小鼠漂浮的时间。评分标准如下：在1min内，漂浮时间在10s内的记6分；20s内的记5分；30s内的记4分；40s内的记3分；50s内的记2分；超出50s 的记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析。分值越高，小鼠游泳的时间越多；说明小鼠肢体运动协调情况越好，反之，则说明小鼠震颤、肌强直等情况严重，结果见表3。
表3 游泳实验得分结果 （±s）。
注：△与空白组比较，有差异（p<0.05）；△△与空白组比较，差异显著（p<0.01）；▲与模型组比较，有差异（p<0.05）；▲▲与模型组比较，有显著差异（p<0.01）。
行为学实验结果表明，构树叶提取物可明显增强小鼠的悬挂指数、爬杆指数和游泳指数，具有显著改善MPTP模型C57BL/6小鼠行为学的作用。
4.构树叶总酚酸抗帕金森病的血清药理学研究。
4.1. 实验材料。
方法采用SD大鼠，雌雄各半，体重200 ± 20g，购自大连医科大学。所用构树叶总酚酸为采用上述工艺自制。称取构树叶总酚酸提取物适量，配制成5 mg/mL的水溶液，待用。
4.2. 实验方法。
4.2.1 药物血清的制备。
大鼠适应性饲养3天，自由饮水进食。随机分为空白组和构树叶总酚酸高、低剂量组。高、低剂量组分别给药150mg/kg、75mg/kg，每天灌胃给药2次，连续给药7天；空白组给予等量生理盐水，连续给7天。于末次给药后0.5 h后麻醉，摘眼球取血，静置0.5 h后，3000 rpm/min离心10 min，分离血清，然后56℃灭活30min以除去可能存在的生物活性物质，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20℃冰箱保存备用。
4.2.2细胞分组与处理。
人母神经细胞瘤系细胞（SH-SY5Y细胞，购于中科院上海细胞库）。用含10％灭活胎牛血清、青霉素100U·mL-1、链霉素100 μg·mL-1的 DMEM F-12培养液培养SH-SY5Y细胞，隔天更换培养液，培养至单层细胞约80%汇合时，传代培养，用对数生长期的细胞进行实验。调整细胞密度为1×105接种于96孔板中，每孔100 μL，置于37℃、5％CO2的培养箱中，培养16 h待细胞贴壁。将细胞随机分为4组：空白血清组、模型组、实验高低剂量组，每组设3个复孔。实验组分别加入含体积分数5%、10%和20%的2.1项下高、低剂量组的完全培养基，空白血清组只加相应体积分数的2.1项下空白小组血清培养基；模型组给予响应体积的2.1项下模型组血清的培养基。于37℃、5％CO2的培养箱中培养24 h后，实验组和模型组同时加入1mM的MPP+（购于sigma公司，批号：72111），继续培养48 h。模型组和构树叶总酚酸高、低剂量组，细胞每孔加5 mg/mL MTT 10 μL，培养4 h，吸去孔内培养基，每孔加DMSO 100 μL，待结晶充分溶解，酶标仪检测 492 nm处各孔的吸收值（OD值）（参考波长620 nm），计算细胞存活率。
细胞存活率％=实验组OD值／空白组OD值×100％。
统计学处理数据以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学处理。
4.3.实验结果。
与空白血清组相比，模型组细胞存活率分别为（42.24% ± 1.71%）、（42.53% ± 1.09%）和（37.01% ± 0.97%）；预先加入高、低剂量的构树叶总酚酸含药血清组的存活率显著增加，与模型组有显著统计学意义，见表4。结果表明，一定体积分数的构树叶总酚酸组含药血清对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞有明显的保护作用。
表4 不同体积分数的含药血清对抗MPP+细胞毒性后的SH-SY5Y细胞存活率(±s)。
注：*与模型组比较，有差异（p<0.05）；**与模型组比较，有显著差异（p<0.01），***与模型组比较，有极显著差异（p<0.001）。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。