本发明涉及一种山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
背景技术：
养羊业与国民经济的发展和各族人民生活水平的提高关系十分密切，特别是进入21世纪后，我国养羊业得到快速发展，成果显著，养羊业在国民经济中的比重也逐年提高。根据联合国粮农组织(FAO)数据，2013年，中国大陆地区的绵羊养殖量即达1.91亿头，山羊1.83亿头，合计3.74亿头。2014年，中国大陆地区的绵羊养殖量为2.02亿头，山羊1.88亿头，合计3.90亿头。虽然我国养羊数量位居世界首位，但与养羊业发达的国家相比，疫病防控水平较薄弱，这在一定程序上制约了我国养羊业的发展。2014年，国家现代肉羊产业技术体系分别对全国肉羊主产区内蒙古、新疆、宁夏、甘肃、青海等14个省区市的近60个县(区、旗)的肉羊产业发展现状进行专题调研后形成的《2014年全国肉羊产业调研报告》中指出：从调查的总体情况看，当前对我国肉羊产业危害最为严重的传染病有羊支原体肺炎(传染性胸膜肺炎)、链球菌病、梭菌病、羊痘、羊传染性脓疱(羊口疮)、羔羊痢疾和羊肠毒血症。这些病均引起不同程度的死亡，养羊户损失严重。其中最引人关注的是近年来发生严重的羊支原体肺炎，饲养密集的规模化羊场和经过长途运输的羊只羊支原体肺炎的发病率很高，死亡严重。在宁夏、安徽、云南和四川调研时，发现所有的规模化羊场都存在羊传染性胸膜肺炎，只是危害的程度不同。
山羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleurpneumonia,CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp，引起的一种山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病，以呈现纤维素性肺炎和胸膜炎为特征,发病率为22％～30％，个别地区高达60％～80％，死亡率15％～30％。该病在非洲、亚洲等数十个国家和地区都有流行，对山羊养殖业带来了较为严重的损失，被世界动物卫生组织列为B类传染病。我国于1947年首发于甘肃,继而在内蒙古、四川、山东、湖北、河北、云南、江西、江苏等地陆续发现。近几年，在湖南、河南、贵州、重庆、内蒙等地区都有CCPP的报道，给山羊养殖业造成了较大的经济损失。
目前，我国预防山羊传染性胸膜肺炎，主要依靠中国兽医药品监察所研发的“山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗”，该疫苗已在我国广泛使用近60年，长期的临床实践证明该疫苗具有极好的临床免疫保护效力。但原疫苗采用强毒气管注射山羊，采集肺组织制成山羊传染性胸膜肺炎组织灭活疫苗，该疫苗不适宜工业化生产，存在散毒的危险；肺组织中杂菌含量高，所制备的疫苗易出现过敏反应。
技术实现要素：
本发明目的在于制备出采用液体培养基发酵培养工艺生产的山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗，用于预防山羊传染性胸膜肺炎。
本发明技术方案
1.一种山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗，其特征在于所述灭活疫苗含有采用EZH液体培养基培养的山羊支原体山羊肺炎亚种抗原。
2.本发明所述山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗，其特征在于所述山羊支原体山羊肺炎亚种抗原生产菌株为C87001株。
3.本发明所述山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗，其特征在于所述液体培养基为EZH液体培养基，由如下组分(W/W)制成:水解乳蛋白3.5％、酵母粉1.5％、葡萄糖1.5％、PPLO肉汤粉10.5％、1％酚红0.1％，余量为注射用水；用灭菌1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.8，经0.22μm过滤除菌。
4.本发明所述山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于用所述山羊支原体山羊肺炎亚种C87001株作为疫苗生产菌株，接种适宜培养基，培养后收获培养物经浓缩、灭活，加矿物油佐剂混合乳化制成山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗。
本发明具体实施方式
1.山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗的制备
(1)生产和检验用菌种 山羊支原体山羊肺炎亚种C87001株生产用基础种子，山羊支原体山羊肺炎亚种C87002株为疫苗检验用菌种，由中国兽医药品监察所制备并提供(该菌原分类命名为丝状支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma mycoides suhsp.capri Edward and Freundt)(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p89)。)。
(2)一级种子繁殖及鉴定 取C87001株冻干菌种1支，接种含15％马血清的EZH液体培养基，置37℃培养3～5日，当培养基pH值下降至7.0左右时，作为制苗用一级种子。
(3)二级种子繁殖及鉴定 取一级种子，接种含15％马血清的EZH液体培养基，置37℃培养3～5日，当培养基pH值下降至7.0左右时，作为制苗用二级种子。
(4)制苗用抗原 制备取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含15％马血清的EZH液体培养基，37℃培养，当培养物pH值下降到7.0左右时，终止培养。取样进行纯粹检验及活菌滴度测定。活菌滴度应≥1×109.0CCU/ml。
(5)抗原浓缩 采用2万截留分子量(MW)超滤浓缩系统浓缩15倍(V/V)。
(6)灭活 按浓缩抗原总量的0.01％加入硫柳汞，充分混匀，在15～25℃作用10小时，期间搅拌数次。灭活结束后，2～8℃保存，应不超过30日，取样进行半成品检验。
(7)疫苗配制 将油佐剂导入油相罐内，以至少121配高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据灭活前活菌滴度测定结果，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)将浓缩后的抗原稀释至每1ml含1m109.0CCU菌体。将油相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入水相，加完后搅拌5～10min，用乳化机以5600r/min，循环乳化10～20min。乳化后取样进行检验，合格后分装。
本发明以上所述液体培养基为EZH液体培养基，由如下组分(W/W)制成:水解乳蛋白3.5％、酵母粉1.5％、葡萄糖1.5％、PPLO肉汤粉10.5％、1％酚红0.1％，余量为注射用水；用灭菌1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.8，经0.22μm过滤除菌。
2.山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗的检验
(1)性状
外观 乳白色或淡黄色乳剂。
剂型 油包水型(W/O)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状不扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应不得超过0.5ml。
黏度 按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
(2)装量检查 按《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行检查，应符合规定。
(3)无菌检验 按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(4)安全检验 用体重1.5～2.0kg健康家兔5只，各肌肉注射疫苗1.0ml；用1月龄的健康易感山羊2只，各分点肌肉注射疫苗4.0ml，均观察10日。应全部健活。
(5)效力检验 用体重至少为20kg、1～3岁的健康易感山羊4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0ml。21日后连同对照山羊3只，各气管注射山羊支原体山羊肺炎亚种强毒C87002株肺组织乳剂4.0ml，观察30日。对照山羊应全部发病，免疫山羊应至少保护3只。
(6)汞类防腐剂残留量测定 按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
本发明涉及生物材料资源信息
山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)C87001株生产用基础种子，山羊支原体山羊肺炎亚种C87002株为疫苗检验用菌种，该类菌原分类命名为丝状支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma mycoides suhsp.capri Edward and Freundt)C87001株和C87002株，均由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p89)。
本发明的积极意义
本发明涉及一种山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗及其制备方法。本发明采用山羊支原体山羊肺炎亚种C87001株，接种适宜培养基，收获培养物，经浓缩、硫柳汞灭活后，加矿物油佐剂混合乳化制成，用于预防山羊支原体山羊肺炎亚种引起的山羊传染性胸膜肺炎。本发明采用液体培养基发酵培养工艺生产山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗，较原组织灭活疫苗具有明显的优势，即大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险、降低了生产成本，且所制备的疫苗不易出现过敏反应，安全性更高。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明要求保护的技术方案构成限制。
实施例1
——疫苗制备及检验
按照确定的生产工艺，制备了3批山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗，现将结果报告如下。
1.材料
(1)菌种 生产用菌种：山羊传染性胸膜肺炎支原体C87001株，F8代，活菌滴度为1×109.0CCU/ml；检验用菌种：山羊传染性胸膜肺炎C87002株组织冻干毒，代号87002，代次：52代，规格：1.0g/支，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
(2)培养基 EZH液体培养基及无菌检验用培养基、由中国兽医药品监察所培养基组提供。
所述EZH液体培养基，由如下组分(W/W)制成:水解乳蛋白3.5％、酵母粉1.5％、葡萄糖1.5％、PPLO肉汤粉10.5％、1％酚红0.1％，余量为注射用水；用灭菌1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.8，经0.22μm过滤除菌。
(3)油佐剂 Montanide ISA 50V佐剂，法国SEPPIC公司生产。
(4)实验动物 试验用山羊，1岁龄，健康，无皮肤病、寄生虫感染，经山羊传染性胸膜肺炎支原体F38株、绵羊肺炎支原体Y98株及布鲁氏杆菌病等血清学检验均为阴性，来自甘肃省某养羊厂。家兔，体重1.5～2.0kg、健康，来自中牧实业股份有限公司兰州生物药厂实验动物场。
(5)过滤器(Polygard CR，0.22μm)：反应罐(福州福尔特公司)；超滤浓缩设备(Millipore公司产品，Pellicon2盒式滤器，采用Biomax 2万截留分子量，改良聚醚砜材料，0.5m2膜面积膜堆)；乳化设备(德国产IKA 2000/4型乳化机)。
2.抗原制备与检验
(1)将山羊传染性胸膜肺炎支原体C87001株生产种子按培养基总量2％的比例接种含15％的马血清EZH液体培养基中，于37℃培养，待培养物pH值下降至7.0左右，收获培养物，收获菌液。采用此方法连续制备3批菌液，同时抽样进行纯粹检验、活菌滴度测定。
(2)抗原检验
1)纯粹检验 按《中国兽药典》附录方法检验，均纯粹。
2)活菌滴度测定 将待测样品用含15％马血清的EZH液体培养基进行10倍系列稀释至10-12，同时设未加菌液的含15％马血清EZH液体培养基作为阴性对照。置37℃培养7日，培养基颜色改变的最高稀释度即为待测样品的滴度。用3份样品的平均滴度，作为菌液滴度(CCU/ml)。检验结果见表1。
表1 实验室3批制品培养菌液的纯粹检验和活菌滴度检验结果
注：“-”表示纯粹检验结果为纯粹。
从表1可以看出，实验室3批制品均纯粹，浓缩前菌液活菌滴度达7×109.0～1×1010.0CCU/mll。
(3)制苗抗原的浓缩
将3批检验合格的抗原培养物，分别以2万分子量内压式超滤膜堆浓缩超滤15倍，浓缩后抗原量为原液量的1/15。
(4)菌液的灭活
按0.01％比例将硫柳汞加入浓缩菌液，充分混匀，分别在室温20℃灭活10小时，期间搅拌5次。灭活后，2～8℃保存，并无菌抽样进行半成品检验。
(5)半成品检验
1)无菌检验 每批灭活抗原按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，均无细菌及霉菌生长。
2)灭活检验 取灭活抗原接种含15％马血清的EZH液体培养基2支，每支0.2ml，置37℃培养5日，均无支原体生长。检验结果见表2。
表2 3批制品的半成品检验结果
注：“-”表示无细、菌霉菌生长。
从表2可以看出，实验室3批制品的抗原灭活完全。
(6)疫苗制备
1)抗原稀释 据灭活前活菌滴度测定结果，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)将浓缩后的抗原稀释并调节浓度，使每1ml含1m109.0CCU菌体。
2)油相准备 将SEPPIC Montanide ISA 50V2油佐剂经121℃灭菌30min，备用。
3)疫苗乳化 按油相：水相为1:1的比例加入乳化罐内，以90r/min的转速充分搅拌，再通过转速为5600r/min的剪切机进行剪切，使疫苗乳化成油包水剂型。
4)分装 疫苗充分混合后，在无菌条件下定量分装，密封瓶口，2～8℃保存。
(7)成品检验
1)性状检测
外观：试制的3批疫苗均为乳白色乳剂。
剂型：每批疫苗抽样分别用一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，均呈云滴状不扩散。
黏度：按现行《中国兽药典》附录方法进行检测，黏度均小于200cP。
2)稳定性检查：每批疫苗吸取10ml加入离心管中，以3000转/分钟离心15分钟，管底析出的水相均未超过0.5ml。
3)装量检查：按现行《中国兽药典》附录方法进行检测，均应不低于100ml/瓶。
4)无菌检验：每批产品随机抽取10瓶，按现行《中国兽药典》方法进行检验，无细菌，霉菌等生长。
5)汞类防腐剂残留量测定：按现行《中国兽药典》进行，均符合兽用生物制品检验的一般规定。
6)安全检验
用体重1.5～2.0kg健康家兔5只，肌肉注射1.0ml/只；用1岁龄的健康易感山羊(山羊支原体山羊肺炎亚种抗体IHA效价不高于1∶4)2只，分点肌肉注射4.0ml/只。均观察10日，全部健活。
7)效力检验
用体重20kg以上，1岁的健康易感山羊4只，各颈部皮下或肌肉注射2.0ml。21日后，连同条件相同的对照山羊3只，各气管注射山羊支原体山羊肺炎亚种强毒C87002株肺组织剂4.0ml(含15个最小发病量)，观察30日。对照山羊3/3发病，免疫山羊均4只全部保护。
实施例2
——与同类制品比较研究报告
为了比较山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗与同类制品在安全性、效力及免疫产生期等方面差异，取实验室试制的3批山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗制品和国产同类制品按1头份/只接种1岁龄山羊，比较两种疫苗接种的安全性和21日后攻毒保护率等。
1.试验材料
(1.)试验疫苗 3批山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗：批号为201001001、201001002和201001003。
(2)对照疫苗 山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗，批号为200901，由哈药集团生物疫苗有限公司生产；山羊支原体山羊肺炎亚种C87002组织冻干毒
(3)山羊支原体山羊肺炎亚种强毒C87002株，代号87002，代次：52代，规格：1.0g/支，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
(4)实验动物 1)试验用山羊，1岁龄，购自某养殖场，体重20～40kg，健康，无皮肤病、寄生虫感染，经山羊支原体山羊肺炎亚种F38株、绵羊肺炎支原体Y-98株及布鲁氏杆菌病等血清学检验均为阴性。2)豚鼠，体重350～450g、健康；兔，体重1.5～2.0kg、健康，北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司、中牧实业股份有限公司兰州生物药厂。
2.安全检验
(1)对山羊的安全性
将实验室试制的3批山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗(批号为201001001、201001002和201001003)分别以2.0ml/只皮下接种1岁龄山羊，同时取哈药集团生物疫苗有限公司的同类制品按1头份/只皮下接种1岁龄山羊，观察10日，是否出现局部和全身反应。
(2)对非靶动物(豚鼠和兔)的安全性
将实验室试制的3批山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗(批号为201001001、201001002和201001003)和哈药集团生物疫苗有限公司生产的同类制品分别肌肉注射豚鼠和兔各2只，2.0ml/只，观察10日，观察是否出现局部和全身反应。
3批实验室制品和哈药集团生物疫苗有限公司生产的同类制品对试验山羊、豚鼠和兔注射当日均有压痛，次日后消失，无其它局部和全身反应，表3。
表3 实验室制品和同类制品注射豚鼠和兔7日内的局部反应观察结果
注：“/”表示未注射疫苗。
3.免疫产生期试验
将实验室试制的3批山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗(批号为201001001、201001002和201001003)分别以2.0ml颈部皮下接种1岁龄山羊，同时取哈药集团生物疫苗有限公司生产的同类制品按1头份/只颈部皮下接种1岁龄山羊，接种后第14日和21日攻毒。见表4。
4.本动物攻毒保护试验
免疫21日后，免疫羊与对照羊同时以山羊支原体山羊肺炎亚种强毒C87002株肺组织乳剂气管接种4.0ml(含15个最小发病量)，临床观察30日。
表4 本发明的疫苗与国产同类制品的免疫产生期测定结果
从表4可以看出，接种3批制品和哈药集团生物疫苗有限公司生产的同类制品后第14日，所有山羊攻毒保护达到3/4以上，第21日攻毒保护达到4/4；攻毒对照组山羊3/3发病。
实验室3批制品的生产是采用EZH液体培养基培养山羊支原体山羊肺炎亚种C87001株菌种，收获菌液浓缩15倍、硫柳汞灭活、与进口50V油佐剂按1:1(v/v)混合乳化后分装制成的。通过进行两种制品安全性、效力及免疫产生期等方面比较，结果显示：实验室产品与哈药集团生物疫苗有限公司生产的同类制品在效力和免疫产生期方面均相当。
实施例3
——最小免疫剂量确定
为了检验山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗不同剂量对靶动物的免疫效果，取实验室试制的3批山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗按不同剂量接种1岁龄山羊，21日后进行攻毒保护试验，确定该制品的最小免疫剂量。现将结果报告如下。
1.材料
(1)疫苗 3批山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗，批号为201001001、201001002和201001003批，由本实验室制备。
(2)山羊传染性胸膜肺炎C87002组织冻干毒 山羊支原体山羊肺炎亚种强毒C87002株，代号87002，代次：52代，规格：1.0g/支，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
(3)实验动物 甘肃省内一养殖厂山羊，1岁龄，健康、无传染病、皮肤病和寄生虫感染，经山羊支原体山羊肺炎亚种F38株、绵羊肺炎支原体Y98株及布鲁氏杆菌病等血清学检验均为阴性。
2.攻毒保护
实验室3批制品(批号为201001001、201001002和201001003批)分别按0.5、1.0、1.5、2.0ml的免疫剂量对山羊注射，注射后21日进行攻毒，不同免疫剂量攻毒保护率测定结果见表5、6。
表5 疫苗不同免疫剂量接种后攻毒保护率
表6 攻毒对照组山羊攻毒保护率
从表3和表4可以看出，3批制品按1.0、1.5、2.0ml免疫剂量接种山羊后21日攻毒保护率均达到3/4(75％)以上；攻毒对照组山羊3/3(100％)发病。
3.临床症状观察结果
攻毒后，每日观察免疫组和对照组山羊的临床症状，连续观察30天。201001001批免疫组2号、4号、7号山羊均出现咳嗽、减食、体温升高，201001002批免疫组18号、19号24号、27号山羊出均现咳嗽、减食、体温升高；201001003批免疫组34号山羊出现咳嗽、减食、体温升高，免疫组其余山羊临床表现正常；对照组3只羊均出现咳嗽、减食、体温升高等症状，其中C1号山羊于攻毒后24天死亡。
4.剖检结果
攻毒后30天，对所有试验山羊进行解剖，结果201001001批出现临床症状的3只山羊解剖后发现肺部有不同程度的特征性病变；201001002批出现临床症状的4只山羊解剖后发现肺部有不同程度的特征性病变；2010011003批出现临床症状的34号山羊解剖后左肺膈叶2/3肝变，剖面呈大理石状。其余免疫山羊左右肺均正常；对照组C1号死亡解剖后左肺尖叶2/3肝变，剖面呈大理石状；其余2只对照山羊到期解剖均出现不同程度的肺部大理石样特征性病变。
本试验结果表明，采用0.5ml免疫剂量不能产生可靠的保护效果；采用1.0、1.5与2.0ml免疫剂量无显著差异，3批疫苗1次接种21日后攻毒均可对山羊起到保护作用，证明本疫苗以1.0ml接种1岁龄山羊，21日后攻毒均能保护，为本疫苗最小免疫剂量。因此，为确保免疫效果，免疫剂量建议为2.0ml/只。
实施例4
——疫苗的免疫期测定
本试验通过测定实验室3批制品对1月龄山羊接种后不同时间的攻毒保护率，来评定疫苗对靶动物的免疫效力。
1.材料 同实施例3。
疫苗1头份的使用剂量为：2.0ml/只，采用颈部皮下或肌肉注射。
2.攻毒保护率
实验室3批制品(批号为201001001、201001002和201001003批)1头份免疫程序对山羊注射，注射后第6、9、12和15个月攻毒，不同时间点攻毒保护率测定结果见表7、8。
表7 不同免疫程序接种后攻毒保护率(1)
表8 不同免疫程序接种后攻毒保护率(2)
从表3、表4结果可以看出，3批制品一次接种和两次接种1头份免疫山羊后6、9、12、15月攻毒保护率均达到3/4(75％)以上；各时间点攻毒对照组山羊3/3发病，经剖检肺部有典型山羊传染性胸膜肺炎病变。证明采用两种免疫程序接种的山羊，15月内攻毒的保护率均达到《中国兽药典》的规定。
3.临床症状观察结果
攻毒后，每日观察免疫组和对照组山羊的临床症状，连续观察30天。山羊攻毒保护试验组临床表现正常；201001003批1针法分别在免疫后9、12个月攻毒后各有1只山羊出现咳嗽、减食、体温升高，201001002批1针法免疫后12个月攻毒有1只山羊出现咳嗽、减食、体温升高，201001001批2针法免疫后15个月攻毒有1只山羊出现咳嗽、减食、体温升高，其余山羊临床表现正常，对照组山羊均出现咳嗽、减食、体温升高等症状。
4.剖检结果
攻毒后30天，对所有出现咳嗽、减食、体温升高的山羊及攻毒对照组山羊进行解剖，结果，肺部均出现不同程度大理石状病变，未出现临床症状山羊左右肺均正常。1针法山羊免疫疫苗6、9、12、15个月后攻毒保护试验发病判定结果分别见表6、表8、表10和表12，2针法山羊免疫疫苗后的攻毒保护试验发病判定结果分别见表9、表10、表11。
表9 疫苗免疫6个月山羊攻毒保护试验发病判定结果
表10 疫苗免疫12个月山羊攻毒保护试验发病判定结果
表12 疫苗免疫15个月山羊攻毒保护试验发病判定结果
实施例5
——疫苗稳定性(保存期)试验
试验结果见表表12-16.
表12 三批疫苗在2-8℃保存不同时间性状检验、无菌检验、装量和汞类防腐剂残留量测定结果
表13 三批疫苗在2～8℃保存不同时间安全检验结果
表14 实验室制品2～8℃保存0、3和6个月攻毒保护率
表15 实验室制品2～8℃保存9、12和18个月攻毒保护率
表16 疫苗2～8℃保存21、24和30个月攻毒保护率
从表14、15和16可以看出，3批制品保存30个月按2.0ml免疫剂量接种山羊后21日攻毒保护率虽均达到3/4(75％)以上，但保护率与保存21个月相比有明显降低；攻毒对照组山羊3/3(100％)发病，经剖检肺部有典型山羊传染性胸膜肺炎病变。