本发明涉及组织工程支架材料领域，特别是一种柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料的制备方法。
背景技术：
组织工程是将可降解生物材料制成特定形状和孔径的支架，在生长因子的作用下，结合特定组织来源的活细胞，经体外培养后预先构建一个有生物活性的种植体，然后植入机体，修复或替代缺损组织或器官，最终形成相应的组织或器官并行使相应的工程。因此，组织工程的核心是活细胞和可供细胞进行生命活动的支架材料，以及它们之间的相互总用。支架材料是组织工程化组织的最基本构架，为细胞提供了获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所，也是形成新的具有形态和功能的组织、器官的物质基础，与传统的二维结构（如细胞培养）有着本质的区别。支架材料的产业化是组织工程产业化的前提条件。
组织工程对生物材料的要求越来越高：（1）生物安全性好，对人体无毒无致敏性和无致癌性。（2）生物相容性良好，对人体、组织、血液和免疫系统无不良反应。（3）应具有良好的细胞粘附能力，能尽可能模拟适合细胞生长、增生、分化的生理环境。（4）必须可生物降解，降解产物应无毒，能被机体代谢或清除，降解时间应与愈合过程和再生过程相匹配，有适于操作的力学特性，降解后的力学特性改变应与愈合或再生进程匹配。（5）应有合适的渗透性和预期的可加工性，可按组织、器官的形成任意塑形，有特定的三维几何形状，有一定的孔径和相互连接的三维结构。（6）支架要有一定的柔韧性，可与机体有机的紧密结合在一起。
组织工程皮肤是治疗皮肤创伤和缺损的医疗方法之一。其材料来源广泛，临床使用效果良好。材料选择上有纯天然支架材料、合成支架材料，也有两者复合的支架材料。但总体来说，更占优势和主导地位的仍然是纯天然支架材料。
蚕分为家蚕（桑蚕）和野蚕(柞蚕、天蚕、蓖麻蚕等)两类，迄今被工业化利用的只有家蚕茧和柞蚕茧两种，在绝大部分的丝素蛋白材料的研究或报道中，所用原料都是家蚕丝。
柞蚕丝是由18种氨基酸组成，但近年来的研究表明：柞蚕丝苏蛋白中含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）三肽序列，RGD序列作为细胞整合素受体与细胞外配体相结合的识别位点，街道细胞与细胞外基质以及细胞之间的相互作用，能够促进支架对细胞的粘附，使得细胞在柞蚕丝素膜上的附着率和增值率远优于桑蚕丝素膜上的附着率和增值率，被视为新型的可用于人体的生物医学材料。由于柞蚕丝素蛋白的一级结构中含有较多的细胞特异性粘附序列RGD，而家蚕中不含有RGD序列，因此柞蚕丝素蛋白基组织工程支架材料的生物学性能可能比家蚕丝素蛋白更好。
公开号为CN101274109A的专利文献公开一种发泡法制备柞蚕丝素蛋白-高聚物多孔互传网格状支架材料的方法，但该方法由于使用了合成高聚物，从而导致支架在人体中的降解周期难以控制和调节，不利用临床广泛应用。合成聚合物在生物学上呈惰性，有更大的可预测特性，批间的一致性，特定用途上独特的先进性，使得这些植入物通常在患者与患者之间，部位与部位之间的差异比酶解性聚合物植入物更小，但存在疏水性和细胞粘附性差等缺陷，掺和有生物活性的某些生物信号链到合成聚合物形成杂合材料可在一定程度上改善这些缺陷。但合成聚合物材料的物理、化学、生物学和生物力学性质会随时间而改变，产生的降解产物与原材料的组织相容水平也有差异，因此，合成聚合物的生物相容性也需要时间的检验。
公开号为100551449A的专利文献公开了一种柞蚕丝素蛋白生物医学材料的制备方法，该发明利用柞蚕丝素蛋白溶液通过静电纺丝法制备成三维无纺网状结构材料，虽然支架的通透性利于细胞的生长，但由于纤维状的丝素蛋白的取向度和结晶度一般偏高，导致体内降解周期可能较长，不利于应用于降解周期较短的组织工程皮肤支架。并且该方法使用静电纺丝法，对纺丝液和设备工艺条件要求较高，不利于灵活调节产品的性能。
对于皮肤支架来言，要充分考虑所用材料的特性。支架材料显著不同于一般工程材料，因其具有新陈代谢功能，皮肤替代物的临床试验已证明，最理想的支架材料应当是与人体皮肤结构和组成成分一致的有生理活性的蛋白质复合材料，以便更好地适应皮肤复杂的生理要求。
麦芽糊精是一种低分子量的淀粉衍生物，经常用于食品行业和药用辅料中，其具有良好的保湿性、营养价值和促进免疫细胞趋化的作用，可以促进细胞与材料间的相容和伤口的免疫调节（参见专利文献CN104027346A），利于细胞生长和伤口愈合。将麦芽糊精与柞蚕丝素蛋白复合在一起，不仅可以促进细胞的粘附和创伤的康复，而且制备过程中组分麦芽糊精起到了致孔剂的作用，通过超声沥滤溶出致孔技术可调节组分含量、孔隙率和柞蚕丝素蛋白结晶度，使复合支架的性能调节简单、灵活。
在公告号为103223192A的专利文献中，介绍了一种桑蚕丝素蛋白与环糊精通过共混后进行冷冻干燥的方法制备了一种用于骨组织工程的复合材料，然该材料并未证明环糊精具有免疫趋化活性。
制备组织工程多孔材料的方法很多，有冷冻干燥法、致孔剂法（盐析法、沥滤法）、发泡法、静电纺丝法、相分离法等。但是，这些致孔方法都是一次致孔，灵活性差；而且，目前所报道的致孔剂法中所制备成品中不含有致孔剂，且往往不可环境降解，增加环保负担。如：公开号为CN105457096A的专利文献公开了一种生物相容性好、可降解的柞蚕丝素蛋白组织工程支架材料的制备方法，该发明介绍了冷冻干燥法、致孔剂法和静电纺丝法三种制备方法，但都是一次致孔，灵活性差，且其与丝素蛋白共混的可降解高聚物以合成聚合物居多，不仅无营养和促进免疫活性，而且降解周期的可调控性很难满足临床需求。因此，提供一种具有降解性且易于调控的用于人工皮肤的复合支架材料已成为本领域亟待解决的技术难题。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种柞蚕丝素蛋白降解性能易于调控的用于组织工程皮肤支架的活性多孔复合材料及其相分离成型、致孔和超声沥滤二次致孔相结合的制备方法，本发明是这样实现的：
一种柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（a）配制复合制备液：
将脱胶后的柞蚕茧壳溶于氯化钙和甲酸的复合水溶液中，经过去离子水透析后，浓缩质量浓度为8-10%的柞蚕丝素蛋白水溶液，然后在溶液中再加入麦芽糊精，室温搅拌溶解后获得复合制备液；
其中，复合制备液中柞蚕丝素蛋白与麦芽糊精的质量比为5:1-4；
（b）相分离成型致孔：
将复合制备液浸入相变成型剂中浸没4-8h，使复合制备液固化成型，然后置于40℃的真空干燥箱中进行真空干燥，获得多孔状的支架材料；
所述相变成型剂为乙醇、丙酮、丙醇中的一种；
（c）超声沥滤二次致孔：
将多孔状的支架材料浸没于体积浓度20-50%的乙醇水溶液中超声浸泡10-60s，使部分麦芽糊精溶出，实现多孔复合支架的第二次成孔，并降低材料的结晶度，然后将材料置于40℃的真空干燥箱中进行真空干燥，即获得所述柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料。
（d）保存：将所述柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料置于真空封口袋密封，置于0~8℃的冰箱中保存，并降低材料的结晶度，
进一步，本发明所述柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料的制备方法中，步骤（a）中柞蚕丝素蛋白水溶液中的柞蚕丝素蛋白平均分子量为20-200KDa。
进一步，本发明所述柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料的制备方法中，步骤（a）中麦芽糊精的DE值为10-20。
进一步，本发明所述柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料的制备方法中，步骤（a）所述复合制备液中柞蚕丝素蛋白与麦芽糊精的质量比为11-171:9。
进一步，本发明所述柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料的制备方法中，步骤（a）所述麦芽糊精为药用麦芽糊精。
进一步，本发明所述柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料的制备方法中，步骤（c）超声功率为25-40KHz。。
进一步，本发明所述柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料的制备方法中，步骤（c）获得的柞蚕丝素蛋白基活性复合支架材料的孔隙率为孔隙率为75-95%。
进一步，本发明所述柞蚕丝素蛋白复合麦芽糊精活性支架材料的制备方法中，步骤（c）获得的柞蚕丝素蛋白基活性复合支架材料的孔径为10-500mm。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明在柞蚕丝素蛋白基支架材料中复合有低分子量的麦芽糊精。麦芽糊精是一种多糖类淀粉衍生物，也是一种中性粒细胞趋化剂。通过控制其用量和致孔溶出量，既可以调节复合支架的组成和性能，又能够起到致孔剂的作用，还具有一定的细胞营养作用和免疫调节作用。
2、本发明步骤（a）复合制备液在有机凝固浴中相分离成型为多孔状材料后，使用了超声波沥滤的二次致孔技术。该方法有利于提高支架材料的孔隙率和通透性；同时，该方法可通过超声沥滤时间长短来调节半成品复合支架中柞蚕丝素蛋白的结晶度，既有利于支架材料的降解周期与伤口愈合周期相匹配，又可灵活调节支架性能，缩短了传统制备方法从溶液配制到成品制造的生产周期。
3、本发明的复合支架材料的组分均来源于天然大分子，均可以体内降解吸收，生物相容性好。且作为组分之一的致孔剂麦芽糊精是淀粉衍生物，易于环境降解，无环保负担。
4、本发明的制备工艺较简单、环保、低毒、低能耗、生产周期短，有利于进行工业化批量生产和应急生产。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明技术思想做进一步说明，实施例中所涉及的试剂和材料，除非特别说明，均是由商业途径购买获得。
实施例中使用的药用麦芽糊精购自山东西王药业有限公司，DE值为10-20。
实施例1
1、配制复合制备液：
将柞蚕干茧壳经过0.02M的碳酸钠煮沸脱除丝胶，然后将脱胶茧壳溶解于摩尔比依次为1：3:15的氯化钙、甲酸、水的三元混合溶液中，在截留分子量为12000的透析膜中经去离子水透析后，过滤去除不溶性杂质，经浓缩得到质量比为8%的柞蚕丝素蛋白水溶液；然后，将药用麦芽糊精粉溶解于上述溶液中，搅拌均匀获得复合制备液。
复合制备液中柞蚕丝素蛋白与药用麦芽糊精的质量比为11：9。
2、相分离成型、致孔：
将10mL复合制备液倒入Φ35mm×12mm（直径x高度）模具中，然后置于乙醇中成型、致孔6h，然后置于40℃真空干燥箱中干燥，即获得多孔状的支架材料。
3、超声二次沥滤致孔：
将多孔状的支架材料浸入体积浓度为50%的乙醇水溶液中，超声60s,频率25kHz，以溶解部分麦芽糊精，提高孔隙率，降低结晶度；然后置于40℃真空干燥箱中干燥，即获得所述柞蚕丝素蛋白基活性复合支架材料。
4、将获得的即获得所述柞蚕丝素蛋白基活性复合支架材料，密封于真空袋中，冰箱低温保存。
实施例2
1、配制复合复合制备液：
将柞蚕干茧壳经过0.02M的碳酸钠煮沸脱除丝胶，然后将脱胶茧壳溶解于摩尔比为1：2:12的氯化钙、甲酸、水的三元混合溶液中，在截留分子量为12000的透析膜中经去离子水透析后，过滤去除不溶性杂质，经浓缩得到质量分数为8%的柞蚕丝素蛋白水溶液。然后，将麦芽糊精粉溶解于上述溶液中，制备成复合制备液。
复合制备液中柞蚕丝素蛋白与药用麦芽糊精的质量比为100：9。
2、相分离成型、致孔：
将10mL复合制备液倒入Φ35mm×12mm模具中，然后置入丙酮中成型、致孔4h，40℃真空干燥。
3、超声二次沥滤致孔：
将40℃真空干燥后获得的多孔状的支架材料，浸入体积浓度为30%的乙醇水溶液中，超声30s,超声频率28kHz，溶解出部分麦芽糊精，然后将材料置于40℃真空干燥箱中干燥，即获得所述柞蚕丝素蛋白基活性复合支架材料。
实施例3
1、配制复合复合制备液：
将柞蚕干茧壳经过0.02M的碳酸钠煮沸脱除丝胶，然后将脱胶茧壳溶解于摩尔比为1：3:12的氯化钙、甲酸、水的三元混合溶液中，在截留分子量为3500的透析膜中经去离子水透析后，过滤去除不溶性杂质，经浓缩得到质量比为10%的柞蚕丝素蛋白水溶液；然后，将麦芽糊精粉溶解于上述溶液中，则制备成复合制备液。
复合制备液中柞蚕丝素蛋白与药用麦芽糊精的质量比为171：9。
2、相分离成型、致孔：
将5mL复合制备液倒入Φ35mm×12mm模具中，然后置入丙醇中成型、致孔8h，然后40℃真空干燥后获得多孔状的支架材料。
3、超声二次沥滤致孔：
将获得的多孔状的支架材料浸入体积浓度为20%的乙醇水溶液中，超声10s,频率40kHz，溶解出部分麦芽糊精，然后置于40℃真空干燥，即获得所述柞蚕丝素蛋白基活性复合支架材料。
具体操作过程中，复合制备液中柞蚕丝素蛋白与麦芽糊精的质量比也可以在11-171:9的范围内选择，均可实现本发明之目的。