透明质酸钠／β‑磷酸三钙多孔复合材料的制备方法与流程

本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合材料的制备方法。

背景技术：

组织工程作为一种替代传统治疗各类骨损伤及器官修复的方法，近年来得到了研究者的重视和不断发展。组织工程的核心内容为：建立细胞和生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用来对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代的目的。组织工程三维支架材料也成为组织工程研究的热点之一。

天然高分子材料由于具有与组织类似的基质成分以及优异的生物相容性、生物可降解性能，因而使其成为组织工程中应用较早的支架材料。透明质酸是一种由D-葡萄糖酸醛和N-乙酰胺基葡聚糖重复二糖单元组成的线性阴离子多糖，具有极佳的生物相容性、降解性和非免疫原性，在细胞迁移、黏附、增殖、分化等方面发挥着重要作用，已广泛应用于美容填充、伤口敷料、关节润滑、药物靶向递送等方面，更是组织工程良好的支架材料。然而透明质酸存在水溶性高、对自由基及透明质酸酶敏感、容易发生降解、吸收迅速、体内保留时间短，在水体系中缺乏力学强度等问题。

为了解决上述问题，对透明质酸进行改性以提高其抗降解性和力学强度显得十分重要。透明质酸钠(HA)分子链上的改性位点包括羧基、羟基及乙酰胺基基团等，可利用透明质酸钠分子内或者分子间的自交联反应在不引入其它基团的前提下实现对其改性，提高天然高分子材料的抗降解性能和生物稳定性。β-磷酸三钙(β-TCP)成分与骨组织相似，具有良好的生物相容性、容易降解吸收、具有骨传导性并且无毒副作用，被视为优良的骨替代材料，且其与天然高分子材料如明胶、壳聚糖的复合能够显著的提高复合支架的机械强度和细胞粘附性能。然而β-磷酸三钙本身脆性大、难于成型、易于溃散，这些缺陷限制了其在承重部位的使用。目前透明质酸钠与β-磷酸三钙的复合主要是以复合水凝胶的形式出现，对三维多孔支架的研究不多。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服目前透明质酸钠、β-磷酸三钙应用在组织工程材料领域所存在的上述问题，提供一种透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合材料的制备方法，采用该方法制备得到的三维多孔支架材料具有良好的生物相容性、可降解性、力学性能，并且制备过程简单。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合材料的制备方法，包括以下步骤：(a)将透明质酸钠溶解在纯水中，配制成透明质酸钠溶液；(b)将β-磷酸三钙粉末溶解在纯水中，配制成β-磷酸三钙悬液；(c)将β-磷酸三钙悬液与透明质酸钠溶液按照一定比例混合，搅拌均匀得混合溶液；(d)将混合溶液注入模具中静置除气泡，接着经冷冻成型、干燥得到多孔复合支架；(e)将多孔复合支架置于交联溶液中，接着洗涤、再次冷冻干燥，最后得到透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。

上述方案中，所述透明质酸钠溶液的浓度为1.25-3.75％(w/v)。

优选的，所述透明质酸钠分子量在100万道尔顿以上。

上述方案中，所述β-磷酸三钙悬液的浓度为4.3-35％(w/v)。

优选的，所述β-磷酸三钙粉末通过固相反应法制得，其粒径分布在2-5μm之间，所得β-磷酸三钙悬液需在100W功率下超声震荡20min。

上述方案中，β-磷酸三钙悬液与透明质酸钠溶液混合时的体积比为1:4，采用将β-磷酸三钙悬液逐滴加入到透明质酸钠溶液中的方式进行混合。

上述方案中，混合溶液注入模具后在4℃下静置1h去除气泡，冷冻成型温度为-20℃或-50℃或-80℃，冷冻干燥温度为-50℃，冷冻干燥的真空度为20Pa，冷冻干燥时间为48h。

上述方案中，所述交联溶液中所含交联剂为2-氯-1-甲基碘代吡啶，溶剂为体积比80:20的无水乙醇-超纯水混合液。

上述方案中，交联溶液中交联剂与透明质酸钠中羧基的摩尔比为0.2-1.25:1。

上述方案中，所述洗涤包括先用体积分数为80％的乙醇溶液洗涤三次，再用超纯水洗涤三次。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)利用异相交联法对透明质酸钠/β-磷酸三钙复合支架进行交联，通过活化透明质酸钠链上的羧基，实现透明质酸钠分子内或分子间的交联反应，在不引入其他基团的情况下，实现透明质酸钠的自身交联，提高支架的抗降解性能。(2)制作工艺简单可控，在使用较少交联剂的情况下即可实现透明质酸钠的交联，且在交联过程中不会破坏支架的宏观形貌和微观结构，因此可预先设计所需的支架形状。(3)通过改变β-磷酸三钙的用量，可以调节支架的机械强度和抗水解能力。(4)通过本发明方法，可充分利用天然高分子和生物陶瓷材料自身的优点，将两者有机的结合在一起，制备出用于组织工程的生物支架材料。

附图说明

图1为本发明所使用的原料β-磷酸三钙粉末的扫描电镜图；

图2为本发明实施例1中β-磷酸三钙、交联透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架以及未交联透明质酸钠的红外光谱图；

图3为本发明实施例1中β-磷酸三钙、交联透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架的XRD图；

图4为本发明实施例1中交联透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架的扫描电镜图。

图5为本发明实施例1-3及对比例1制备的多孔支架材料抗压强度对比图。

具体实施方式

为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例及附图进行进一步详细说明。本领域普通技术人员应当明白，以下实施例仅用于说明本发明，并不对其构成任何限定。

一种透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合材料的制备方法，包括以下步骤：(a)将分子量在100万道尔顿以上的透明质酸钠溶解在纯水中，配制成浓度为1.25-3.75％(w/v)的透明质酸钠溶液；(b)将粒径分布在2-5μm之间的β-磷酸三钙粉末(固相反应法制得)溶解在纯水中，100W功率下超声震荡20min，配制成浓度为4.3-35％(w/v)的β-磷酸三钙悬液；(c)将β-磷酸三钙悬液与透明质酸钠溶液按照1：4的体积比进行混合，搅拌均匀得混合溶液；(d)将混合溶液注入模具中，在4℃下静置1h去除气泡，接着在-20℃或-50℃或-80℃冷冻成型，然后在-50℃、20Pa的真空度下干燥48h得到多孔复合支架；(e)将多孔复合支架置于2-氯-1-甲基碘代吡啶的乙醇溶液(乙醇与纯水体积比80:20)中交联，接着用体积分数为80％的乙醇溶液洗涤三次，再用超纯水洗涤三次，再次冷冻干燥，最后得到透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。交联时交联剂2-氯-1-甲基碘代吡啶与透明质酸钠中羧基的摩尔比为0.2-1.25:1。

本发明原料之一透明质酸钠的分子量在100万道尔顿以上。另一原料β-磷酸三钙粉末通过固相反应法制得，其微观结构如图1所示，从图1可得其粒径分布在2-5μm之间。交联剂2-氯-1-甲基碘代吡啶(CMPI)为普通市售。

实施例1

取0.3g透明质酸钠粉末溶解在8mL超纯水中，室温条件下搅拌至透明质酸钠完全溶解，形成浓度为3.75％(w/v)的透明质酸钠溶液。将0.3gβ-磷酸三钙加入到2mL超纯水中形成浓度为15％(w/v)的悬液，将悬液超声(功率100W)震荡20min，接着将其逐滴加入到透明质酸钠溶液中，搅拌均匀。将所得均匀混合溶液注入到24孔板模具中，4℃下静置1h去除气泡，接着在-20℃下冷冻24h成型。之后利用真空冷冻干燥机对样品进行干燥，冷冻干燥温度为-50℃，真空度为20Pa，冷冻干燥时间为48h，得到未交联的透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。将未交联的复合多孔支架浸没在交联溶液中24h进行交联。交联完成后将样品用体积分数为80％的乙醇溶液洗涤三遍，再用超纯水洗涤三遍，最后再次冷冻干燥得到交联后的透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。此处所用交联溶液为含10mM的2-氯-1-甲基碘代吡啶溶质(CMPI与透明质酸钠中羧基的摩尔比为0.4:1)，溶剂为体积比80:20的乙醇/水混合溶液。

分别对实施例1中的原料β-磷酸三钙、产物交联透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架以及原料未交联透明质酸钠进行了红外分析，对原料β-磷酸三钙和产物交联透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架进行了XRD测试，对产物交联透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架进行了扫描电镜分析，结果分别如图2-4所示。图2显示，交联后透明质酸钠位于1620cm^-1的羧基峰消失，位于1420cm^-1处的羟基峰减弱，并在1655cm^-1处形成一个新峰，说明羟基和羧基之间发生了酯化反应，交联反应实现了。从图3可知该交联方法并不影响β-磷酸三钙的结晶度；从图4可得知β-磷酸三钙颗粒均匀的分布在透明质酸钠基体上，复合支架的孔径在140μm左右，气孔率为91.82％。

实施例2

取0.3g透明质酸钠粉末溶解在8mL超纯水中，室温条件下搅拌至透明质酸钠完全溶解，形成浓度为3.75％(w/v)的透明质酸钠溶液。将0.7gβ-磷酸三钙加入到2mL超纯水中，形成浓度为35％(w/v)的悬液，将悬液超声(功率100W)震荡20min，然后将其逐滴加入到透明质酸钠溶液中，搅拌均匀。将所得均匀混合溶液注入到24孔板模具中，4℃下静置1h去除气泡，接着在-20℃下冷冻24h成型。之后利用真空冷冻干燥机对样品进行干燥，冷冻干燥温度为-50℃，真空度为20Pa，冷冻干燥时间为48h，得到未交联的透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。将未交联的复合多孔支架浸没在交联溶液中24h进行交联。交联完成后将样品用体积分数为80％的乙醇溶液洗涤三遍，再用超纯水洗涤三遍，最后再次冷冻干燥得到交联后的透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。此处所用交联溶液为含10mM的2-氯-1-甲基碘代吡啶溶质(CMPI与透明质酸钠中羧基的摩尔比为0.4:1)，溶剂为体积比80:20的乙醇/水混合溶液。

实施例3

取0.3g透明质酸钠粉末溶解在8mL超纯水中，室温条件下搅拌至透明质酸钠完全溶解，形成浓度为3.75％(w/v)的透明质酸钠溶液。将0.1268gβ-磷酸三钙加入到2mL超纯水中，形成浓度为6.34％(w/v)的悬液，将悬液超声(功率100W)震荡20min，然后将其逐滴加入到透明质酸钠溶液中，搅拌均匀。将所得均匀混合溶液注入到24孔板模具中，4℃下静置1h去除气泡，接着在-20℃下冷冻24h成型。之后利用真空冷冻干燥机对样品进行干燥，冷冻干燥温度为-50℃，真空度为20Pa，冷冻干燥时间为48h，得到未交联的透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。将未交联的复合多孔支架浸没在交联溶液中24h进行交联。交联完成后将样品用体积分数为80％的乙醇溶液洗涤三遍，再用超纯水洗涤三遍，最后再次冷冻干燥得到交联后的透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。此处所用交联溶液为含10mM的2-氯-1-甲基碘代吡啶溶质(CMPI与透明质酸钠中羧基的摩尔比为0.4:1)，溶剂为体积比80:20的乙醇/水混合溶液。

对比例1

取0.3g透明质酸钠粉末溶解在10mL超纯水中，室温条件下搅拌至透明质酸钠完全溶解，形成浓度为3％(w/v)的透明质酸钠溶液。将所得透明质酸钠溶液注入到24孔板模具中，4℃下静置1h去除气泡，接着在-20℃下冷冻24h成型。之后利用真空冷冻干燥机对样品进行干燥，冷冻干燥温度为-50℃，真空度为20Pa，冷冻干燥时间为48h，得到未交联的透明质酸钠多孔支架。将未交联的多孔支架浸没在交联溶液中24h进行交联。交联完成后将样品用体积分数为80％的乙醇溶液洗涤三遍，再用超纯水洗涤三遍，最后再次冷冻干燥得到交联后的透明质酸钠多孔支架。此处所用交联溶液为含10mM的2-氯-1-甲基碘代吡啶溶质(CMPI与透明质酸钠中羧基的摩尔比为0.4:1)，溶剂为体积比80:20的乙醇/水混合溶液。

为充分了解不同β-磷酸三钙用量对支架强度的影响，我们对本发明实施例1-3及对比例1制备的多孔支架进行了抗压强度测试。测试用仪器为抗压强度试验机，转头速度为1mm/min，将试样压缩至其原有高度的50％，得到抗压强度值。每组样品测试五个，取平均值，结果如图5所示。图5表明在透明质酸钠浓度相同的情况下，随着β-磷酸三钙含量的增多，多孔支架的抗压强度不断提高。

实施例5

取0.1g透明质酸钠粉末溶解在8mL超纯水中，室温条件下搅拌至透明质酸钠完全溶解，形成浓度为1.25％(w/v)的透明质酸钠溶液。将0.086gβ-磷酸三钙加入到2mL超纯水中形成浓度为4.3％(w/v)的悬液，将悬液超声(功率100W)震荡20min，接着将其逐滴加入到透明质酸钠溶液中，搅拌均匀。将所得均匀混合溶液注入到24孔板模具中，4℃下静置1h去除气泡，接着在-50℃下冷冻24h成型。之后利用真空冷冻干燥机对样品进行干燥，冷冻干燥温度为-50℃，真空度为20Pa，冷冻干燥时间为48h，得到未交联的透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。将未交联的复合多孔支架浸没在交联溶液中24h进行交联。交联完成后将样品用体积分数为80％的乙醇溶液洗涤三遍，再用超纯水洗涤三遍，最后再次冷冻干燥得到交联后的透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。此处所用交联溶液为含5mM的2-氯-1-甲基碘代吡啶溶质(CMPI与透明质酸钠中羧基的摩尔比为0.2:1)，溶剂为体积比80:20的乙醇/水混合溶液。

实施例6

取0.2g透明质酸钠粉末溶解在8mL超纯水中，室温条件下搅拌至透明质酸钠完全溶解，形成浓度为2.5％(w/v)的透明质酸钠溶液。将0.7gβ-磷酸三钙加入到2mL超纯水中形成浓度为35％(w/v)的悬液，将悬液超声(功率100W)震荡20min，接着将其逐滴加入到透明质酸钠溶液中，搅拌均匀。将所得均匀混合溶液注入到24孔板模具中，4℃下静置1h去除气泡，接着在-80℃下冷冻24h成型。之后利用真空冷冻干燥机对样品进行干燥，冷冻干燥温度为-50℃，真空度为20Pa，冷冻干燥时间为48h，得到未交联的透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。将未交联的复合多孔支架浸没在交联溶液中24h进行交联。交联完成后将样品用体积分数为80％的乙醇溶液洗涤三遍，再用超纯水洗涤三遍，最后再次冷冻干燥得到交联后的透明质酸钠/β-磷酸三钙多孔复合支架。此处所用交联溶液为含30mM的2-氯-1-甲基碘代吡啶溶质(CMPI与透明质酸钠中羧基的摩尔比为1.25:1)，溶剂为体积比80:20的乙醇/水混合溶液。