本发明属于临床医学技术领域，尤其涉及一种高血氨影响大鼠脑内凋亡基因表达的模型及其构建方法。
背景技术：
大量研究表明，凋亡(即程序性死亡)参与多种原因导致的神经系统损害病理过程，如脑缺血、缺氧性损害等。氨中毒学说在肝性脑病的发病机制中占重要地位，氨对中枢神经系统的毒性作用主要是通过干扰脑的能量代谢实现，且课题组前期工作证实其导致一定程度的认知功能的障碍。但目前已有的研究集中在氨对大脑代谢及功能影响方面，而关于氨对大脑内神经元细胞凋亡的影响鲜有报道，Bcl-2和Bax是传统的凋亡相关因子，在其他脑病方面的研究较多，已有大量实验证实，Bcl-2和Bax在一些病理状态下如缺血、缺氧时神经元细胞凋亡过程中起重要作用。由于关于氨中毒时脑组织细胞凋亡的研究较少，因此针对该模型的这两个凋亡相关因子的研究可以完善氨中毒时脑组织细胞凋亡相关理论，为后续的治疗方面提供理论支持。
综上所述，目前已有的研究集中在氨对大脑代谢及功能影响方面，而关于氨对大脑内神经元细胞凋亡的影响属于技术空白。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高血氨影响大鼠脑内凋亡基因表达的模型及其构建方法，旨在解决目前已有的研究集中在氨对大脑代谢及功能影响方面，而关于氨对大脑内神经元细胞凋亡的影响属于技术空白的问题。
本发明是这样实现的，一种高血氨影响大鼠脑内凋亡基因表达的模型，所述高血氨影响大鼠脑内凋亡基因表达的模型为：40只雄性SD大鼠，随机分为两组，每组20只：正常对照组，高血氨模型组；水迷宫试验评价大鼠学习记忆功能，大鼠麻醉后，分离血浆检测血氨，大鼠脑组织一部分4％多聚甲醛固定，一部分-80℃保存；Tunel试剂盒检测大鼠脑组织凋亡情况；RT-qPCR检测大鼠脑组织Bcl-2、Bax基因的表达。
本发明的另一目的在于提供一种所述高血氨影响大鼠脑内凋亡基因表达的模型的构建方法，所述高血氨影响大鼠脑内凋亡基因表达的模型的构建方法包括以下步骤：
步骤一，40只实验动物按照随机原则分为2组：A组，正常对照组；B组，高血氨模型组，每组20只；B组：每只大鼠腹腔内注射5％氯化铵，剂量为0.5ml/100g，每周前4天每天1次。A组：作为对照，腹腔内注射生理盐水0.5ml/100g；实验动物给药四周建立高血氨模型；
步骤二，第五实验周开始水迷宫实验，实验前后均称量体重；每天上、下午两段固定时间进行水迷宫实验，一共5天；
步骤三，将大鼠面向水池壁，从4个象限固定的入水点按顺序分别放入池中，之后立即采用遮光帘和间接光源，摄像头及视频图像采集系统可自动记录大鼠寻找平台过程中的游泳轨迹及时间；
步骤四，水迷宫实验结束后，经腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，下腔静脉采到的血标本放入肝素抗凝试管颠倒几次，迅速置入冰浴；脑组织分离皮层与海马组织，一部分置入4％多聚甲醛溶液。一部分超低温冰箱保存；
步骤五，经肝素抗凝的大鼠全血置入加盖EP管低温3500rpm离心5min，分离得血浆，强生VITRO S350生化分析仪检测血氨。
进一步，当大鼠爬上平台时，水迷宫视频分析系统能够立即计算出Time值和distance值；每次大鼠到达平台后，让其在平台上停留30秒；如果在训练中大鼠超过120s不能找到平台，引导至平台，并停留30秒钟；将水迷宫实验的最后一次训练的学习记忆参数作为水迷宫的最终结果。
进一步，高血氨模型大鼠脑组织神经元凋亡增加，由于脑组织内多因子作用的结果，Bcl-2、Bax凋亡基因表达平衡失调所致为重要机制。
本发明提供的高血氨影响大鼠脑内凋亡基因表达的模型及其构建方法，探讨高血氨大鼠脑内神经元凋亡的的分子机制；方法：40只雄性SD大鼠，随机分为两组，每组20只：正常对照组(A组)，高血氨模型组(B组)。水迷宫试验评价大鼠学习记忆功能，大鼠麻醉后，分离血浆检测血氨，大鼠脑组织一部分4％多聚甲醛固定，一部分超低温(-80℃)保存；Tunel试剂盒检测大鼠脑组织凋亡情况；RT-qPCR检测大鼠脑组织Bcl-2、Bax基因的表达。结果：与正常对照组比较，高血氨模型组大鼠血氨水平明显升高，行为学试验表现为平均逃避潜伏期延长(P<0.05)和游泳总路程增加(P<0.05)，提示学习记忆能力下降。高血氨模型组大鼠脑组织凋亡指数升高(P<0.05)，并且该组大脑皮层、海马Bcl-2基因表达均下降(P<0.05)，而Bax基因表达亦均升高(P<0.05)。结论：高血氨模型大鼠脑组织神经元凋亡增加，可能是由于脑组织Bcl-2、Bax等凋亡基因表达平衡失调所致。
附图说明
图1是本发明实施例提供的高血氨影响大鼠脑内凋亡基因表达的模型的构建方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的高血氨影响大鼠脑内凋亡基因表达的模型的构建方法包括以下步骤：
S101：40只实验动物按照随机原则(统计学随机数字表法)分为2组：A组(正常对照组)、B组(高血氨模型组)，每组20只。B组：每只大鼠腹腔内注射5％氯化铵，剂量为0.5ml/100g，每周前4天每天1次。A组：作为对照，腹腔内注射生理盐水0.5ml/100g。实验动物给药四周建立高血氨模型；
S102：第五实验周开始水迷宫实验，实验前后均称量体重。每天上、下午两段固定时间进行水迷宫实验，一共5天；
S103：将大鼠面向水池壁(水池含墨色颜料)，从4个象限固定的入水点按顺序分别放入池中，之后立即采用遮光帘和间接光源(避免光对图像采集时的干扰)，摄像头及视频图像采集系统可自动记录大鼠寻找平台过程中的游泳轨迹及时间，当大鼠爬上平台时，水迷宫视频分析系统能够立即计算出Time值(平均逃避潜伏期)和distance值(游泳总距离)，此两种指标反映学习记忆功能用两个参数。每次大鼠到达平台后，让其在平台上停留30秒；如果在训练中大鼠超过120s不能找到平台，就引导其至平台，并停留30秒钟。将水迷宫实验的最后一次训练的学习记忆参数作为水迷宫的最终结果。注意要操作轻柔，避免不必要的应激刺激。每天水迷宫结束后尽量将大鼠的毛发干燥；
S104：水迷宫实验结束后，经腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，下腔静脉采到的血标本放入肝素抗凝试管轻轻颠倒几次(避免剧烈摇晃，防止溶血)，迅速置入冰浴(尽快送检)。脑组织分离皮层与海马组织，一部分置入4％多聚甲醛溶液。一部分超低温冰箱保存；
S105：经肝素抗凝的大鼠全血置入加盖EP管低温3500rpm离心5min，分离得血浆，强生VITRO S350生化分析仪检测血氨。
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
本实验拟观察高血氨大鼠脑内凋亡因子的的表达变化，并进一步探讨脑内神经元凋亡与学习记忆能力下降的联系，具体步骤如下：
1 材料和方法
1.1 主要材料
40只大鼠(雄性，清洁级，体重180～200克，Sprague-Dawley系)，由温州医学院动物中心提供(实验动物许可证SCXK浙2010-0150)；氯化铵粉剂(分析纯级，无锡市民丰试剂厂)。Tunel试剂盒购自罗氏公司；RNA提取试剂(Trizo)购自Sigma公司；bcl-2和bax引物对(PAGE纯化方式)由北京擎科新业生物技术有限公司合成，cDNA逆转录试剂盒购自fermantas公司，荧光PCR试剂(产品型号SYBR GreenⅠMaster)购自罗氏公司。
1.2 动物分组和高血氨模型制造
40只实验动物按照随机原则(统计学随机数字表法)分为2组：A组(正常对照组)、B组(高血氨模型组)，每组20只。B组：每只大鼠腹腔内注射5％氯化铵，剂量为0.5ml/100g，每周前4天每天1次。A组：作为对照，腹腔内注射生理盐水0.5ml/100g。实验动物给药四周建立高血氨模型。
1.3 Morris水迷宫实验
第五实验周开始水迷宫实验，实验前后均称量体重。每天上、下午两段固定时间进行水迷宫实验，一共5天。操作方法：将大鼠面向水池壁(水池含墨色颜料)，从4个象限固定的入水点按顺序分别放入池中，之后立即采用遮光帘和间接光源(避免光对图像采集时的干扰)，摄像头及视频图像采集系统可自动记录大鼠寻找平台过程中的游泳轨迹及时间，当大鼠爬上平台时，水迷宫视频分析系统能够立即计算出Time值(平均逃避潜伏期)和distance值(游泳总距离)，此两种指标反映学习记忆功能用两个参数。每次大鼠到达平台后，让其在平台上停留30秒；如果在训练中大鼠超过120s不能找到平台，就引导其至平台，并停留30秒钟。将水迷宫实验的最后一次训练的学习记忆参数作为水迷宫的最终结果。注意要操作轻柔，避免不必要的应激刺激。每天水迷宫结束后尽量将大鼠的毛发干燥。
1.4.动物标本收集及血氨的检测
水迷宫实验结束后，经腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，下腔静脉采到的血标本放入肝素抗凝试管轻轻颠倒几次(避免剧烈摇晃，防止溶血)，迅速置入冰浴(尽快送检)。脑组织分离皮层与海马组织，一部分置入4％多聚甲醛溶液。一部分超低温冰箱保存。
经肝素抗凝的大鼠全血置入加盖EP管低温3500rpm离心5min，分离得血浆，强生VITRO S350生化分析仪检测血氨。
1.5 神经细胞凋亡检测
脑组织用4％的多聚甲醛固定24小时，常规梯度酒精慢脱水后石蜡包埋。蜡块连续冠状切片，厚4μm，载玻片预先用多聚-L-赖氨酸处理。
脑组织凋亡检测按照TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒说明操作。
光学显微镜观察凋亡细胞：凋亡细胞核中有棕黄色颗粒。高倍视野(×400)下观察凋亡细胞数，随机计算5个视野，每个视野数100个细胞，凋亡细胞所占的百分率为凋亡指数(apoptosis index，AI)。
1.6 RT-qPCR
1.6.1 取低温保存的大鼠脑组织20-30mg。Trizol法提取总RNA(超净工作台内操作，台面用DEPC水处理过)。根据总RNA浓度的公式计算RNA样品浓度。
1.6.2 RT(逆转录反应)
按照cDNA逆转录试剂盒说明方法将mRNA逆转成cDNA。
1.6.3 引物合成
登录Ensemble网站，分别找到bcl-2基因的cDNA序列(编号ENSRNOT00000016561)、bax基因cDNA序列(编号ENSRNOT00000028328)的，genetool软件设计引物，bcl-2和bax引物对(PAGE纯化方式)合成自北京擎科新业生物技术有限公司。
bcl-2引物对：正链5-ccggcatctgcacacctgga-3，负链5-ccagagtgatgcaggccccc-3，产物为152bp。
bax引物对：正链5-ggacccccacatggcagacagt-3，负链5-gcctttccccgttccccattcat-3，产物为164bp。
1.6.4 qPCR(Real time quantative PCR)
按两步法在ABI 7900实时定量PCR仪上进行，以β-actin为内参照。20ul反应体系，加入384孔板中冰上操作，每个样品重复3次。PCR反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃复性及延伸30s，45个cycle。ABI 7900HT型荧光定量PCR仪自带SDS2.4分析软件，得到域值循环数Ct值(threshold cyCle number，)，计算目的基因相对内参表达量。
1.7 统计学处理和分析
实验数据均以(±S)表示，使用SPSS 17.0统计软件进行分析，采用t检验分析数据，P<0.05时组间差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血氨检测结果
与A组(正常对照组)比较，B组(高血氨模型组)大鼠血氨水平明显升高(P<0.05)(见表1)。
表1血氨水平和学习记忆参数(±S)
2.2 各组大鼠学习记忆参数
Morris水迷宫试验中，B组大鼠较A组平均逃避潜伏期延长(P<0.05)和游泳总路程增加(P<0.05)(见表1)，可见高血氨模型组大鼠学习记忆能力下降。
2.3 大鼠脑内神经元凋亡检测结果(见表2)
光镜下TUNEL阳性细胞表现为细胞核内见到棕黄色颗粒，各组大鼠脑组织未见明显坏死病灶。
与A组(正常对照组)比较，B组(高血氨模型组)大鼠脑海马组织、皮层组织细胞凋亡明显增多(P<0.05)；
表2两组大鼠脑内凋亡情况比较(±S)
2.4 RT-qPCR检测大鼠脑组织bcl-2基因mRNA结果(见表3)
B组(高血氨模型组)海马组织、皮层组织bcl-2基因mRNA表达较A组(正常对照组)均明显下降(P<0.05)。
表3两组大鼠脑组织bcl-2基因表达情况(±S)
2.5 RT-qPCR检测bax基因mRNA结果(见表4)
B组(高血氨模型组)海马组织、皮层组织bax基因mRNA表达较A组(正常对照组)均明显升高(P<0.05)。
表4两组大鼠脑组织bax基因表达情况(±S)
氨对中枢神经系统具有毒性作用，既往研究表明氨主要是通过干扰脑的能量代谢发挥作用。在本发明Morris水迷宫试验中，高血氨模型组大鼠平均逃避潜伏期延长(P<0.05)和游泳总距离增加(P<0.05)。证实了高血氨可导致大鼠空间学习记忆能力的下降。凋亡是神经元死亡的另一种重要形式，神经元凋亡对其功能的变化的影响也备受关注。脑组织在缺血缺氧等病理情况下，学习记忆功能受影响，而且其脑组织神经元凋亡增加。在本发明中，采用末端转移标记技术(TUNEL法)检测大鼠脑组织的凋亡情况。研究结果显示，高血氨模型组大鼠脑海马组织、皮层组织细胞凋亡都较正常对照组明显增多(P<0.05)。由此可见，已被明确干扰脑组织能量代谢的氨，也影响着脑组织中的神经元的凋亡发生。因此明确其机制有重要意义。Bcl-2基因目前被认为是一种重要的内源性抗凋亡因子，通过多种途径抑制细胞凋亡：包括维持细胞钙稳态、抗氧化作用、抑制凋亡蛋白酶的激活、保持线粒体膜的稳定性等[9]。有学者建立低O2高CO2模型探讨Bcl-2基因表达与细胞凋亡的关系，结果发现Bcl-2表达下降，未能有效的抑制凋亡，则细胞继而发生凋亡，说明Bcl-2基因表达对阻止低氧引起的神经元凋亡起重要作用。本发明发现在凋亡发生增加的高血氨模型组，脑组织中无论是海马组织，还是皮层组织，bcl-2基因表达较正常对照组均明显下降。可见在的氨影响下，凋亡发生的机制与抗凋亡因子bcl-2表达下降有关。Bax是Bcl-2家族中最重要的死亡促进基因，其可能促凋亡机制为：不仅使抗凋亡蛋白丧失对细胞凋亡的抑制作用，而且引起各种促凋亡因子的释放，此外，还能够增加靶细胞对凋亡信号的敏感性，从而导致引起细胞器功能的丧失和细胞凋亡。本发明对脑组织中的bax基因mRNA表达做了检测，结果显示在凋亡发生增加的高血氨模型组，脑组织中无论是海马组织，还是皮层组织，bax基因表达较正常对照组均明显增加，也证实，在凋亡增加的组织内，促凋亡因子bax的表达起了重要作用。
因此，综上所述，高血氨模型大鼠脑组织神经元凋亡增加，是由于脑组织内多因子作用的结果，Bcl-2、Bax等凋亡基因表达平衡失调所致为其重要机制。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。