化合物4‑BPT在制备治疗卵巢癌药物中的应用的制作方法

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及化合物4-BPT（4-(2-bromophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氢喹啉，简称4-BPT）在制备治疗卵巢癌药物中的应用。

背景技术：

卵巢恶性肿瘤（卵巢癌）在女性常见恶性肿瘤中占2.4%～6.5%，在女性生殖系统癌瘤中占第3位，次于宫颈癌和宫体癌。近几年来，由于对宫颈癌及宫体癌的防治，取得了一定的成效，而有关卵巢癌的防治方面收效相对较小。所以在妇女生殖系统癌瘤中，卵巢癌是造成死亡原因最高的一种肿瘤。造成其病死率居高不下的原因是由于卵巢恶性肿瘤生长部位隐蔽，无法直接看到，早期卵巢恶性肿瘤症状不明显，仍缺乏简便实用的诊断方法。

临床上治疗卵巢癌采用的是手术切除并辅助化疗的综合治疗方法,紫杉醇与铂类药物(顺铂或卡铂)联合化疗是卵巢癌治疗的标本化疗方案，拓扑替康、阿霉素、依托泊普以及吉西他滨等作为二线治疗药物被用于卵巢癌患者的治疗。铂类药物(顺铂或卡铂)清除卵巢癌细胞的作用机制主要是通过P53及JNK等分子发挥作用，临床资料显示，约60%一80%的卵巢癌患者含有P53基因的突变或缺失，该基因的突变或缺失直接削弱了以铂类为基础的化疗疗效；另外，还有约30%的卵巢癌患者对铂类药物与紫杉醇类药物结合的治疗方法不敏感；同时，常规治疗方法在有效剂量范围内对机体能造成较大的伤害,耐药复发问题是卵巢癌治疗中常发生的问题，基于当前化疗药物对卵巢癌治疗存在非特异性和耐药性，因此，寻找无毒副作用且高效的新型抗癌药物是是医药卫生领域急需解决的问题。

近十年，出现了另一种治疗肿瘤重要途径----细胞衰老。细胞衰老是指细胞从一个活性的生长状态转变为不可逆转的生长停滞状态，是正常细胞的必然归宿，在恶性转化过程中缺失。细胞衰老被认为是抑制肿瘤细胞生长的重要机制。最近研究表明不同类型的抗癌药物在低剂量时可以诱导肿瘤细胞产生衰老样表型，进入永久生殖停滞。细胞衰老能在药物浓度明显低于传统治疗浓度的情况下被诱导，为降低药物毒性提供了可能性。因此，在肿瘤治疗中诱导肿瘤细胞衰老是一种非常有希望的治疗方法。

本发明涉及的化合物 4-BPT 是在2016年在Tetrahedron杂志上已报道的一种吡啶类化合物，吡啶及其衍生物是性能优良的溶剂，能溶解多种无机物和有机物；广泛应用于合成橡胶、染料，饲料工业添加剂；由于吡啶环对生物体的活性高，又可应用于医药、农药等。本发明所涉及的化合物为白色固体，熔点为87-88 ℃，呈弱碱性。本发明所涉及的化合物的生物学活性还未见报道，本发明研究了其在抗卵巢癌活性方面的生物学效应。经研究表明，β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色实验证明该化合物可诱导卵巢癌细胞衰老，但对正常的人成纤维细胞无影响或影响很小。细胞增殖曲线表明，该化合物够显著的抑制卵巢癌细胞系A2780的增殖。细胞周期检测的结果表明，4-BPT够影响卵巢癌细胞的细胞周期，使其阻滞在S期，发生细胞周期停滞；因此，本发明涉及的杂环化合物4-BPT在抗卵巢癌活性方面具有非常大的作用，并且在日后卵巢癌的治疗方面具有很大的潜在价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，为更好的治愈或为治疗卵巢癌提供一种可行的选择，本发明的发明人经过大量创造性的劳动，筛选出一种化合物4-BPT，在抗卵巢癌活性方面具有很好的抑制作用，进而为治疗卵巢癌或诱导卵巢癌细胞的凋亡提供了新的疗法或手段。

本发明首先提供一种吡啶类衍生物在制备治疗癌症药物中的应用，其中所述的吡啶类衍生物为4-(2-bromophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氢喹啉，简称4-BPT，其化学结构式如下：

。

其中，上面所述的癌症为卵巢癌；

所述应用为抑制癌细胞增殖或诱导衰老；具体的，所述的应用为阻滞细胞周期。

本发明还提供一种治疗癌症的药物，所述药物中的有效成分为吡啶类衍生物为4-(2-bromophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氢喹啉，简称4-BPT。

其中所述的药物还包括药学上可接受的载体或辅料，所述载体和/或辅料为本领域技术人员所知晓，在此不做赘述。

所述的药物为抑制细胞增殖或诱导衰老的药物；具体的，所述的药物为阻滞细胞周期的药物。

本发明通过体外β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色实验，表明4-BPT对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3具有显著诱导衰老的作用，而对正常人成纤维细胞IMR90几乎无影响。且通过测定不同浓度下细胞生长曲线、细胞周期及凋亡检测，确定该化合物对细胞的增殖有抑制作用，并通过调控细胞周期的方式抑制卵巢癌细胞的增殖，在抗卵巢癌方面活性非常显著，在抗卵巢癌药物制备方面有良好的开发应用前景。

本发明通过试验表明：体外SA-β-gal染色实验证实该化合物对诱导卵巢癌A2780和SKOV3细胞的衰老作用十分明显，但在同等实验条件下，对正常人成纤维IMR90细胞几乎没有影响；细胞增殖实验验证了该化合物对卵巢癌A2780细胞具有抑制作用，这种作用呈浓度依赖性；细胞周期检测结果表明，该化合物使大量卵巢癌A2780细胞周期的S期受阻，细胞堆积在G0/G1期，使其细胞周期改变。

本发明的有益效果：

本发明所涉及的化合物可以选择性促进卵巢癌细胞的衰老，并且对正常细胞影响较小或没有影响。这相较于传统的抗卵巢癌药物所引起的极大的毒副作用，具有十分明显的优势。本发明所涉及的化合物可以对卵巢癌细胞的细胞周期进行阻滞，使细胞周期S期受阻，G0/G1期细胞大量堆积，从而诱导卵巢癌细胞进入细胞衰老状态。本发明所涉及的化合物具有明显抗卵巢癌活性，在制备抗卵巢癌药物和治疗卵巢癌方面有很大的潜力，为今后的研究应用提供新的选择。

附图说明

图1. 化合物4-BPT的化学结构式。

图2. A2780细胞系SA-β-gal染色结果（上图）及阳性细胞统计结果图（下图）。

图3. SKOV3细胞系SA-β-gal染色结果（上图）及阳性细胞统计结果图（下图）。

图4. IMR90细胞系SA-β-gal染色结果（上图）及阳性细胞统计结果图（下图）。

图5. A2780细胞增殖曲线图。

图6. 不同作用浓度的4-BPT处理卵巢癌A2780细胞96 h后的流式细胞仪检测图（上图）及平行3次后的细胞周期统计图（下图）。

图7. 不同作用浓度的4-BPT处理卵巢癌A2780细胞96 h后的流式细胞仪检测图（上图）及平行3次后的细胞凋亡统计图（下图）。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步详细的说明，下述非限制性实施例不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。

本发明所涉及的具体化合物4-BPT的制备方法请参见：Chunyin Zhu*, Benwei Bi, Ya Ding, Te Zhang, Qiu-Yun Chen. Iodine-catalyzed aerobic oxidative formal [4+2] annulation for the construction of polyfunctionalized pyridines. Tetrahedron.2016, 72(5), 779.本发明涉及的化合物由该论文作者提供。

实施例1. 细胞的培养和传代

卵巢癌A2780和SKOV3细胞 (购于American type culture collection)体外分别培养于含10% 胎牛血清及青霉素（100U/mL）-链霉素(100 μg/mL）的DMEM(Life Technologies公司，美国)培养基和含10% 胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基中；人成纤维IMR90细胞(购于American type culture collection) 培养于含10% 胎牛血清及青霉素-链霉素的专用DMEM培养基中。每天定期观察细胞生长状态，待长满培养皿时及时传代（一般在贴壁细胞表面积占80% 及以上时传代）。当细胞培养和传代效果良好时进行下一步实验。

其中所述的专用DMEM培养基500 mL =1 mL维生素( 100 × ，购于Life Technologies，美国 ) + 5 mL丙酮酸酯(100 nM ，购于Life Technologies，美国) + 2mL氨基酸( 50 × ，购于Life Technologies，美国 ) + 1 mL非必需氨基酸(100 × ，购于Life Technologies，美国 )+491 mL DMEM培养基。

实施例2. SA-β-gal实验检测细胞衰老

第一步：取圆形玻片浸泡于95 % 的乙醇中，点燃酒精灯灼烧玻片，将玻片放入24孔板中，静置放凉备用。底面直径6 cm培养皿的卵巢癌A2780和SKOV3细胞及人成纤维IMR90细胞培养和传代良好后，弃原培养液，用2 mLPBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 ml含10% 胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM(或RMPI-1640,IMR90专用DMEM)培养基吹打混匀，200 g离心5 min，弃上清，加含10 % 胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM(或RMPI-1640，IMR90专用DMEM)培养基吹打混匀，取0.5 mL到EP管，用枪吸取10 µl于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。A2780 、SKOV3和IMR90每孔种4×10⁴个细胞，分别将细胞种到24孔板中，吹打混匀。放入CO₂恒温培养箱（Thermo scientific，37℃）静止培养24 h，使其贴壁。

第二步：将4-BPT按不同比例稀释于无菌干净的DMSO溶液中，分别加作用浓度为0 μM（即为对照组）、10 μM、20 μM、40 μM 的4-BPT溶液到24孔板中，保持每孔所加的化合物稀释液的体积保持不变，放入CO₂恒温培养箱（37 ℃）静止培养48 h。

第三步：将培养48 h后的细胞取出，吸去培养基，加入0.5 mL 的PBS清洗玻片，轻轻晃动，吸去PBS，重复三次。加入0.5 mL的固定液（1 mL =54 µL甲醛+80 µL 2.5 %戊二醛+866 µL PBS），室温下固定5 min。吸去固定液，再用PBS清洗3次。每孔加入0.5 mL染色液（1 mL=798 µLH₂O+30 µL5 M NaCl+2 µL1 M MgCl+10 µL 0.5 M K₃Fe(CN)₆+10 µL 0.5 M K₄Fe(CN)₆+100 µL0.4 M Na₂HPO₄+50 µL 20 mg/mL X-gal）,置于37℃的CO₂培养箱中孵育10 h左右。取出，蒸馏水洗2遍，弃去。无水乙醇洗2遍，水洗三遍。取载玻片，滴5 µL水于载玻片上，取出玻片，将其倒扣于水上，切勿产生气泡，用指甲油将四周固封好。待指甲油干掉后，在玻片上加一滴水，用真空泵洗掉。在400倍倒置显微镜下拍照。

实验结果显示：使用SA-β-gal方法检测化合物4-BPT在细胞培养液中，诱导卵巢癌A2780和SKOV3细胞及人正常成纤维IMR90细胞诱导衰老的能力。如图2-4所示，不同作用浓度的4-BPT处理卵巢癌细胞后，进行SA-β-gal染色，SA-β-gal染色的阳性细胞呈绿色，绿色程度和面积表明细胞衰老的程度。

图2中体外SA-β-gal染色实验结果显示，相对于对照组，实验组细胞具有明显的衰老特征，并且这一特征呈浓度依赖性。

图3中的体外SA-β-gal染色实验结果显示，随着浓度的升高，绿色的程度和面积都有所增加。说明4-BPT能够诱导卵巢癌SKOV3细胞衰老，并且随4-BPT浓度增加而显著。

图4中的体外SA-β-gal染色实验结果显示，人成纤维细胞IMR90对4-BPT不敏感，细胞呈绿色的程度及面积都较低，无明显的细胞衰老特征。

结果表明，化合物4-BPT能够对检测的A2780和SKOV3细胞具有较明显的诱导衰老作用，而对人正常成纤维IMR90细胞则无明显作用。SA-β-gal实验在细胞水平上证明，化合物4-BPT可以特异性针对卵巢癌细胞发挥诱导卵巢癌衰老作用。

实施例3. 细胞增殖曲线检测细胞生长抑制。

第一步：在底面直径为6 cm的培养皿中培养卵巢癌A2780、SKOV3细胞，传代良好后，弃原培养液，用2 mLPBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10%胎牛血清，青霉素及链霉素DMEM培养基吹打混匀，取200 g溶液离心5 min，弃上清，加含10%胎牛血清，青霉素及链霉素DMEM培养基吹打混匀，取0.5 mL到EP管，用枪吸取10 µL于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。每孔种2×10⁴个细胞，一共3组孔，将细胞种到6孔板中,每孔吹打混匀。放入二氧化碳恒温培养箱（Thermo scientific，37 ℃）静止培养24 h，使其贴壁。

第二步：将4-BPT按不同比例稀释于DMSO（国际集团化学试剂有限公司)中，分别加作用浓度为0 μM（即为对照组）、40 μM、80 μM的4-BPT溶液到6孔板中，保持每孔所加体积等量，放入二氧化碳恒温培养箱（37 ℃）静止培养48 h。

第三步：将6孔板中的细胞重新消化下来，用血球计数器计数后，将其全部种回6孔板，重复第一、二两步操作3次，绘出不同化合物作用浓度下的生长曲线。

实验结果显示：如图5所示，图中表明，对照组的细胞生长呈指数方式，处理组的生长则相对缓慢，随着4-BPT浓度的增加，这种趋势越明显，说明4-BPT能够有效的抑制卵巢癌细胞A2780的生长。

实施例4. 流式细胞仪检测细胞周期

第一步：底面直径6 cm培养皿的卵巢癌A2780细胞培养和传代良好后，弃原培养液，用2 mLPBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10 % 胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM培养基吹打混匀，200 g离心5 min，弃上清，加含10 % 胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM培养基吹打混匀，取0.5 mL到EP管，用枪吸取10 µL于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。取底面直径6 cm的细胞培养皿，每碟种1×10⁵个细胞,共2碟。放入 CO₂恒温培养箱（37 ℃）静止培养24 h，使其贴壁。

第二步：分别取0 µM（即为对照组）、80 µM化合物4-BPT剂量加入实验组细胞中，对照组加入等体积的DMSO和培养基。放入CO₂恒温培养箱（37 ℃）静止培养96 h。

第三步：将培养96 h后的细胞取出，吸去培养基，分别取0.5 mL的PBS清洗，吸去PBS，加0.5 mL胰酶消化，加0.5 mL相应培养基终止消化，延孔壁吹洗，转至EP管，重复用0.5 mL培养基洗一次，减少细胞残余。转至4 ℃冰盒，并在4 ℃冷冻离心机中300 g离心5 min，吸去上清，刮匀。每管加300 μL 4℃预冷的PBS，混匀，4 ℃冷冻离心机中300 g离心5 min，吸去上清，刮匀。每管滴加0.5 mL-20 ℃预冷的70%的乙醇，混匀，放入4 ℃冰箱保存至少24 h。

第四步：从4 ℃取出待处理的细胞，4 ℃冷冻离心机中500 g离心5 min，弃上清，刮匀。每管加300 μL 4 ℃预冷的PBS,混匀，4 ℃冷冻离心机中500 g离心5 min。弃上清，刮匀，每管加500 μL PI染色液（485 μL PBS+10 μL 1 mg/mL的PI+5 μL 1 mg/mL的RNASE），吹打4-5次混匀，转至周期检测管，避光中37 ℃水浴锅中孵育1 h。流式细胞仪检测细胞周期。

实验结果显示：如图6所示，相对于对照组，卵巢癌细胞A2780在80 µM的化合物作用浓度下，处于G1期的数量明显增多，S期明显受阻，说明该细胞的细胞周期产生阻滞，细胞进入衰老状态。

实施例5. 流式细胞检测细胞凋亡检测

第一步、第二步同实施例4。

第三步：将A2780细胞从6孔板消化离心，收集所有的上清液。转至4 ℃冰盒，并在4 ℃冷冻离心机中300 g离心5 min，吸去上清，刮匀。将上清离心后的细胞和相应消化下来的细胞全部合并，用0.5 mL 预冷PBS洗涤，4 ℃冷冻离心机中300 g离心5 min，吸去上清，刮匀。每管加500 μL 4 ℃预冷的PBS，混匀，重复上述操作。加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，轻轻摇匀(细胞凋亡试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司)。避光，室温反应10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀，1 h内送流式细胞仪检测。

实验结果如图7显示，化合物4-BPT对卵巢癌A2780细胞无诱导凋亡作用。说明化合物引起细胞衰老的原因主要还是细胞周期的改变。