FPTHQ在制备治疗卵巢癌的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及化合物FPTHQ（4-(4-fluorophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，4-（4-氟苯基）-2-苯基-5,6,7,8-四氢喹啉，简称FPTHQ）在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

背景技术：

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，是仅次于宫颈癌和子宫内膜癌列居第三位的恶性疾病。卵巢癌主要分为上皮性、粘液型、子宫内膜型、透明细胞型和未分化型卵巢癌。其中上皮性肿瘤占原发性卵巢肿瘤的70%左右，其恶性类型占卵巢恶性肿瘤的85%-90%。由于卵巢癌病灶深居盆骨，早期临床症状极不明显，很难被发现，患者往往一经发现就已经属于晚期，这极大的威胁着妇女的生命。目前，治疗卵巢癌的药物主要有紫杉醇、铂类、贝伐单抗、曲贝替定等，这些药物的单独用药和联合用药并没有有效的改善患者的生存期和总生存期，同时具有较强的副作用。目前的标准治疗方案为手术配以化疗，这种治疗方案对早期患者比较受益，但对于晚期患者而言，并没有多大的帮助尽管很多病人都对手术和由铂剂及紫杉醇组成的标准化疗有响应，但大多数病人都会经历复发并最终对多种化疗试剂产生抗性而无药可治。到目前为止卵巢癌仍缺乏有效的治疗方法和手段。

细胞衰老是一个不可逆的细胞周期停滞的生理过程，在抑制肿瘤进程以及治疗肿瘤方面具有重要作用。正常细胞在某种致瘤因素的刺激下，失去自身生长的限制，从而具有无限增殖的能力而丧失了衰老的功能，形成肿瘤。因此，通过诱导癌细胞衰老来稳定的抑制癌细胞的生长，也许能够作为一种治疗肿瘤的方式。传统肿瘤的治疗方式如放疗、化疗等，主要是通过使肿瘤细胞死亡而实现治疗目标，其优势在于具有较好的近期疗效，即肿瘤包块的迅速缩小，但由于转移与复发等不良情况的发生，使得传统肿瘤治疗模式的疗效并不尽如人意。与此相应，衰老的肿瘤细胞并不立即死亡，甚至可以在较长的时间内仍具有存活力，但却失去了增殖与转移的能力，这样的特性使得以细胞衰老为靶标的治疗在缩小肿瘤方面的作用并不是很强，但却可以带瘤生存的方式显著延长肿瘤患者的生存时间，而且不良反应没有传统化疗与放疗那么大。因此，恢复肿瘤细胞的衰老通路，诱导肿瘤细胞的衰老是一个很有研究前景的新的肿瘤终极治疗靶标，寻找能够特异性诱导癌细胞衰老的药物来治疗癌症也是众多研究者努力的方向。

本发明所涉及的化合物FPTHQ是一种吡啶类衍生物，已于2016年报道于Tetrahedron杂志上。吡啶类衍生物的研究应用范围十分广泛，主要运用于医药、农药、饲料、染料等领域，其中在医药领域内的应用十分重要，如结核病药异烟肼，中枢兴奋药尼可刹米等。本发明所涉及的化合物FPTHQ为白色固体，熔点为131-132 ℃，呈弱碱性。本发明所述化合物FPTHQ在抗卵巢癌活性方面的相关生物学效应研究，在国内外尚未见相关报道。经研究表明，FPTHQ能够显著的抑制卵巢癌细胞系A2780和SKOV3的生长。细胞周期检测的结果表明，FPTHQ能够影响卵巢癌细胞的细胞周期，使其阻滞在G1期，发生细胞周期停滞。衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色结果表明，FPTHQ处理后的细胞β-半乳糖苷酶的活性明显增强，而正常的人成纤维细胞无明显变化。这些数据表明，FPTHQ能够特异性的诱导卵巢癌细胞衰老，而对正常的人成纤维细胞没有作用。因此，本发明涉及的吡啶衍生物在抗卵巢癌活性方面具有非常大的作用，并且在今后卵巢癌的治疗方面具有很大的潜在价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，为更好的治愈或为治疗卵巢癌提供一种可行的选择，本发明的发明人经过大量创造性的劳动，筛选出一种化合物FPTHQ，在抗卵巢癌活性方面具有很好的抑制作用，进而为治疗卵巢癌或诱导卵巢癌细胞的凋亡提供了新的疗法或手段。

本发明首先提供一种吡啶类衍生物在制备治疗癌症药物中的应用，其中所述的吡啶类衍生物为4-(4-fluorophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，4-（4-氟苯基）-2-苯基-5,6,7,8-四氢喹啉，简称FPTHQ，其化学结构式如下：

。

其中，上面所述的癌症为卵巢癌；

所述应用为抑制癌细胞生长或促进癌细胞衰老；具体的，所述的应用为阻滞癌细胞周期。

本发明还提供一种治疗癌症的药物，所述药物中的有效成分为吡啶类衍生物为4-(4-fluorophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，4-（4-氟苯基）-2-苯基-5,6,7,8-四氢喹啉，简称FPTHQ。

其中所述的药物还包括药学上可接受的载体或辅料，所述载体和/或辅料为本领域技术人员所知晓，在此不做赘述。

所述的药物为抑制癌细胞生长或促进癌细胞衰老的药物；具体的，所述的药物为阻滞癌细胞周期的药物。

本发明通过对一类已报道的吡啶类化合物进行生物学活性筛选，筛选出候选化合物，并研究其在抗卵巢癌活性方面的相关作用,实验所用细胞为卵巢癌SKOV3、A2780细胞和人正常成纤维IMR90细胞。通过筛选，得到化合物FPTHQ。进一步通过检测细胞生长，细胞周期以及衰老相关的β-半乳糖苷酶活性来测定其诱导衰老的能力，从而确定该化合物在抗卵巢癌方面活性非常显著。

结果表明：细胞增殖实验验证了该化合物对卵巢癌细胞A2780和SKOV3的生长抑制，这种作用呈浓度依赖性；细胞周期检测结果表明，该化合物可使大量细胞停留在G1期，使其细胞周期停滞。体外SA-β-gal染色实验证实该化合物能够诱导卵巢癌A2780和SKOV3细胞衰老，但在同等实验条件下，不能诱导正常人成纤维IMR90细胞衰老；以上研究得出化合物FPTHQ具有明显的诱导卵巢癌细胞衰老的活性，在对抗卵巢癌的研究和治疗方面具有非常大的潜质，可以进一步对其进行治疗卵巢癌药物的制备。

本发明的有益效果：本发明所涉及的化合物可以选择性促进卵巢癌细胞的衰老，并且对正常细胞影响较小或没有影响。这相较于传统的抗卵巢癌药物所引起的极大的毒副作用，具有十分明显的优势。本发明所涉及的化合物可以对卵巢癌细胞的细胞周期进行阻滞，使细胞周期S期受阻，细胞停滞于G1期，从而诱导卵巢癌细胞进入细胞衰老状态。本发明所涉及的化合物具有明显抗卵巢癌活性，在制备抗卵巢癌药物和治疗卵巢癌方面有很大的潜力，为今后的研究应用提供新的选择。

附图说明

图1. 4-FPTHQ的合成示意图。

图2. A2780细胞增殖曲线图，图中**代表p值小于0.01，具有统计学意义。

图3. SKOV3细胞增殖曲线图，图中**代表p值小于0.01， ***代表p值小于0.001，具有统计学意义。

图4. 不同作用浓度的FPTHQ处理卵巢癌细胞细胞系A2780 48h后的细胞周期统计图（上图）和流式细胞仪检测图（下图，作用浓度从左至右依次为0μM、20μM、60μM）。图中*代表p值小于0.05， **代表p值小于0.01，具有统计学意义。

图5.不同作用浓度的FPTHQ处理卵巢癌细胞系SKOV3 48h后的细胞凋亡统计图（上图）及流式细胞仪检测图（下图，作用浓度从左至右依次为0μM、20μM、60μM）。图中#代表p值大于0.05，无统计学意义， *代表p值小于0.05，具有统计学意义。

图6. A2780细胞系SA-β-gal染色图。

图7. A2780细胞系 SA-β-gal染色阳性细胞统计图，图中**代表p值小于0.05， ***代表p值小于0.01，具有统计学意义。

图8. SKOV3细胞系 SA-β-gal染色图，SA-β-gal染色的阳性细胞呈绿色，绿色程度和面积表明细胞衰老的程度。

图9. SKOV3 SA-β-gal染色阳性细胞统计图，图中**代表p值小于0.05， ***代表p值小于0.01，具有统计学意义。

图10. IMR90细胞系 SA-β-gal染色图。

图11. IMR90细胞系 SA-β-gal染色阳性细胞统计图，图中#代表p值大于0.05，无统计学意义， *代表p值小于0.05，具有统计学意义。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步详细的说明，下述非限制性实施例不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。

本发明所涉及的具体化合物4-FPTHQ的制备方法请参见Chunyin Zhu*, Benwei Bi, Ya Ding, Te Zhang and Qiu-Yun Chen.Iodine-catalyzed aerobic oxidative formal [4+ 2] annulation for the construction of polyfunctionalized pyridines[J]. Tetrahedron, 2015, 71(49): 9251-9257.

实施例1. 化合物4-FPTHQ的制备方法

在10 mL单口烧瓶中，将4-氟查尔酮（0.5mM）溶于甲醇中（1.5mL），再加入环己酮（0.6mM）、碘（0.1mM）、吡咯烷（0.1mM）和乙酸铵（0.6mM），反应在30 ℃条件下，氧气的氛围中搅拌，经过TLC板监测反应，8 h反应完全，再用乙酸乙酯和水萃取三次，合并有机相，再用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋转蒸出溶剂，得到混合物，再用硅胶柱层析，得到纯的吡啶衍生物FPTHQ。

实施例2. 细胞的培养和传代

卵巢癌A2780、SKOV3细胞(购于American type culture collection)体外分别培养于含10% 胎牛血清，100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM(购于Life Technologies公司，美国)培养基和含10% 胎牛血清及100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的RMPI-1640(购于Life Technologies公司，美国)培养基中；人成纤维IMR90细胞(购于American type culture collection)培养于含10% 胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM(购于Life Technologies公司，美国)培养基中。每天定期观察细胞生长状态，待长满培养皿时及时传代（一般在贴壁细胞表面积占80% 及以上时传代）。当细胞培养和传代效果良好时进行下一步实验。

实施例3. 细胞生长曲线检测细胞生长抑制

第一步：在底面直径为6cm的培养皿中培养卵巢癌A2780、SKOV3细胞，传代良好后，弃原培养液，用2 mL PBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10%胎牛血清，100U/mL 青霉素及100 μg/mL链霉素DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，取200 g溶液离心5 min，弃上清，加含10%胎牛血清，100U/mL 青霉素及100 μg/mL链霉素DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，取0.5 mL到EP管，用枪吸取10 µL于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。每孔种5×10⁴个细胞，一共3组孔，每组3个复孔，将细胞种到6孔板中,每孔吹打混匀。放入二氧化碳恒温培养箱（Thermo scientific，37℃）静止培养12h，使其贴壁。

第二步：将FPTHQ按不同比例稀释于DMSO（国际集团化学试剂有限公司)中，将稀释后的作用浓度为0μM、40μM、60μM或者0μM、60μM 、120μM的FPTHQ溶液加入6孔板中，保持每孔所加体积等量，放入二氧化碳恒温培养箱（37℃）静止培养36h，以不加FPTHQ为对照组。

第三步：将6孔板中的细胞重新消化下来，用血球计数器计数后，将其全部种回6孔板，重复第一、二两步操作3次，绘出不同化合物作用浓度下的细胞生长曲线。

如图2和图3，随着时间的延长，FPTHQ处理组与对照组的细胞数的差距明显增大，说明处理组的细胞生长受到抑制，并且随着FPTHQ浓度的增加，这种趋势就越明显。实验结果表明FPTHQ能够有效的抑制卵巢癌细胞A2780以及SKOV3的生长。

实施例4.流式细胞仪检测细胞周期

第一步：取培养和传代良好得底面直径6cm培养皿的卵巢癌A2780和SKOV3细胞后，弃原培养液，用2 mLPBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10% 胎牛血清，100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，200 g离心5 min，弃上清，加含10% 胎牛血清100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，取0.5 mL到EP管，用枪吸取10 µL于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。取底面直径6cm的培养皿，每个培养皿种4×10⁵细胞，放入二氧化碳恒温培养箱（37℃）静止培养24h，使其贴壁。

第二步：将FPTHQ按不同比例稀释于DMSO中，分别加作用浓度为0μM、20μM、60μM的FPTHQ溶液，加到上面所述的培养皿中，放入二氧化碳恒温培养箱（37℃）静止培养48h。

第三步：将培养48h后的细胞取出，吸去培养基，分别取2mL的PBS清洗，吸去PBS，加0.5mL胰酶消化，加0.5mL相应培养基终止消化，延孔壁吹洗，转至EP管，重复用0.5mL培养基洗一次，减少细胞残余。转至4℃冰盒，并在4℃冷冻离心机中300g离心5min，吸去上清，刮匀。每管加300μL 4℃预冷的PBS，混匀，4℃冷冻离心机中300g离心5min，吸去上清，刮匀。每管加0.5mL-20℃预冷的70%的乙醇，混匀，放入4℃冰箱保存至少24h。

第四步：从4℃取出待处理的细胞，4℃冷冻离心机中300g离心5min，弃上清，刮匀。每管加300μL4℃预冷的PBS，混匀，4℃冷冻离心机中300g离心5min。弃上清，刮匀，每管加500μL PI染色液（485Μlpbs+10μL1mg/mL的PI+5μL1mg/mL的RNASE），吹打4-5次混匀，转至周期检测管，避光中37℃水浴锅中孵育1h。流式细胞仪检测细胞周期。

如图4和图5所示，相对于未处理组组，实验组S期的细胞比例明显降低，而G1期的细胞比例在升高。60μM浓度条件下，A2780细胞的G1期比例增长了18.49%。SKOV3细胞的G1期比例增长了10.54%。实验结果显示：相比于对照组，实验组的细胞周期明显受到阻滞，并且细胞停滞于G1期。

实施例5. SA-β-gal检测诱导细胞衰老

第一步：取圆形玻片浸泡于95%的乙醇中，点燃酒精灯灼烧玻片，将玻片放入24孔板中，静置放凉备用。底面直径6cm培养皿的卵巢癌A2780、SKOV3细胞和人成纤维IMR90细胞培养和传代良好后，弃原培养液，用2 mL PBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10% 胎牛血清00U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，200 g离心5 min，弃上清，加含10% 胎牛血清及100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，取0.5 ml到EP管，用枪吸取10 µL于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。A2780、SKOV3和IMR90每孔种4×10⁴个细胞，分别将细胞种到24孔板中，吹打混匀。放入二氧化碳恒温培养箱（Thermo scientific，37℃）静止培养24h，使其贴壁。

第二步：将FPTHQ按不同比例稀释于DMSO中，分别加作用浓度为0μM、20μM、60μM、180μM的FPTHQ溶液到24孔板中，保持每孔所加体积等量，放入二氧化碳恒温培养箱（37℃）静止培养48h。

第三步：将培养48h后的细胞取出，吸去培养基，加入0.5 mL的PBS清洗玻片，轻轻晃动，吸去PBS，重复三次。加入0.5mL的固定液（1 mL =54μL甲醛+80μL 2.5%戊二醛+866μL PBS），室温下固定5min。吸去固定液，再用PBS清洗3次。每孔加入0.5mL染色液（1mL =798μL H₂O+30μL 5M NaCl+2μL 1M MgCl+10μL 0.5M K₃Fe(CN)₆+10μL 0.5M K₄Fe(CN)₆+100μL 0.4M Na₂HPO₄+50μL 20mg/mL X-gal），置于37℃恒温培养箱中孵育10h左右。取出，蒸馏水洗2遍，弃去。无水乙醇洗2遍，水洗三遍。取载玻片，滴5μL水于载玻片上，取出玻片，将其倒扣于水上，切勿产生气泡，用指甲油将四周固封好。待指甲油干掉后，在玻片上加一滴水，用真空泵洗掉。在400倍倒置显微镜下拍照。

如图6和图8所示，利用SA-β-gal染色方法来检测细胞衰老的情况。相对于未处理组，实验组细胞明显染成了绿色，而且绿色的程度随着浓度的增加而增强，绿色程度和面积表明细胞衰老的程度。如图7和图9所示，随着浓度的增加，SA-β-gal阳性细胞数显著增加，阳性细胞数目越多，说明细胞衰老程度越高。如图10和图11所示，化合物FPTHQ处理，对人正常成纤维IMR90细胞则无明显作用。实验结果表明化合物FPTHQ可以特异性诱导卵巢癌细胞衰老，而对正常的人成纤维细胞没有作用。