小口径生物人工血管的3D打印制备方法和人工血管与流程

本发明属于医疗器械中植入器械技术领域，具体地说，是涉及一种小口径生物人工血管的3D打印制备方法和人工血管。

背景技术：

目前，临床上应用的人工血管多为涤纶制品和聚四氟乙烯等不可降解的聚合物材料。对于大血管的置换，这些人工血管在一定程度上满足临床需求。然而对于直径小于6mm的小血管的置换，这种材料的人工血管主要通过在内表面涂层抗凝或者抑制血栓形成的药物，可以在早期实现较好的通畅效果，然而在移植后期药物逐渐释放完毕后，很容易形成血栓最终导致血管移植的失败。

内皮细胞具有抗血栓形成、抑制血小板聚焦和平滑肌的病理增生等作用，被认为是最终解决血栓形成及内膜增生的最有效方法。通过使用表征内皮细胞的特异性抗体促进组织工程血管的快速内皮化的手段，在移植的早期取得了较好的通畅效果，然而在移植后期出现不同程度的内膜增生；究其原因，主要是组织工程血管的微环境不适合细胞的生存和功能的发挥。人工血管的孔隙率和孔径与组织工程材料内细胞的存活、增殖和分化紧密相关。如何优化局部微环境和实现生物人工血管的重塑是目前研究的难题。

近年来，三维打印技术在制备组织工程用三维支架与细胞打印输出方面得到了快速发展和应用，为制备具有良好细胞生存微环境的小口径生物人工血管创造了条件，但是因为血管需要打印输出多层细胞及细胞附着的支架，而支架材料的打印温度通常远高于细胞的存活温度，这会造成在打印支架的过程中因为高温而导致细胞死亡的技术问题。

技术实现要素：

本申请提供了一种小口径生物人工血管的3D打印制备方法和人工血管，解决现有使用3D技术打印小口径生物人工血管过程中，存在的支架材料的打印温度高于细胞的存活温度导致细胞死亡的技术问题。

为解决上述技术问题，本申请采用以下技术方案予以实现：

提出一种小口径生物人工血管的3D打印制备方法，包括：在旋转收集器表面打印内皮细胞；将第一支架组装于打印有内皮细胞的旋转收集器上；在所述第一支架表面打印平滑肌细胞；在所述打印有平滑肌细胞的第一支架外围组装第二支架；在所述第二支架上打印胶原纤维；将所述旋转收集器置入细胞培养也中浸泡并脱模获得小口径生物人工血管；其中，所述第一支架和所述第二支架均采用3D打印方法预先制备。

进一步的，在旋转收集器表面打印内皮细胞之前，所述方法还包括：在所述旋转收集器表面喷涂水溶性生物脱模剂；则所述在旋转收集器表面打印内皮细胞，具体为：在所述喷涂有水溶性生物脱模剂的旋转收集器表面打印内皮细胞。

进一步的，所述旋转收集器为中空的金属或非金属棒，其直径为0.2-6mm；且所述旋转收集器两端固定于缓冲轴承上。

进一步的，所述第一支架和所述第二支架均采用3D打印方法预先制备，具体为：控制所述旋转收集器以其自体为轴心顺时针或逆时针转动；控制打印喷头从所述旋转收集器的第一端沿第一方向边移动边打印，直至所述旋转收集器的第二端；控制打印喷头从所述旋转收集器的第二端沿第二方向边移动边打印，直至所述旋转收集器的第一端；将打印出的网孔结构的第一支架或第二支架从所述旋转收集器上剥离备用；其中，所述第一方向和所述第二方向相反，且与所述旋转收集器的轴向平行。

进一步的，所述第一支架和所述第二支架均采用3D打印方法预先制备，包括：根据所述旋转收集器的转速、所述旋转收集器的直径、所述打印喷头的打印材料挤出速度、所述第一支架或所述第二支架的孔径和孔隙率，设定所述打印喷头的移动速度。

进一步的，所述第一支架和所述第二支架均采用3D打印方法预先制备，包括：打印所述第一支架的外径比所述旋转收集器的外径大0.4mm，且所述第一支架的厚度为0.2mm；打印所述第二支架的外径比所述第一支架的外径大0.4mm，且所述第二支架的厚度为0.2mm。

进一步的，将所述旋转收集器置入细胞培养也中浸泡并脱模获得小口径生物人工血管，具体为：将所述旋转收集器置入生物反应器内，所述生物反应器内盛有细胞培养液；所述旋转收集器在所述细胞培养液中浸泡30分钟后脱模获得小口径生物人工血管。

提出一种人工血管，采用上述小口径生物人工血管的3D打印制备方法制备而成。

与现有技术相比，本申请的优点和积极效果是：本申请提出的小口径生物人工血管的3D打印制备方法和人工血管中，采用第一支架和第二支架预先打印制备，然后再通过打印内皮细胞、逐一组装两个支架以及采用3D打印方法种植细胞于支架中的方式制备小口径生物人工血管的方式，将支架打印和细胞种植的步骤分开执行，在采用3D打印方法种植细胞时，支架已经降温，在保证细胞分层均匀种植的同时，避免了支架材料打印温度高于细胞的存活温度造成的细胞死亡的技术问题。并且，打印过程中采用的旋转收集器采用中空结构，并将其两端安装在缓冲轴承上，减缓了打印过程中旋转收集器转动产生的抖动情况，提高了打印质量。

结合附图阅读本申请实施方式的详细描述后，本申请的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1 为本申请提出的小口径生物人工血管的3D打印制备方法流程图。

图2为本申请提出的小口径生物人工血管的剖视图；

图3为本申请提出的采用旋转收集器打印小口径生物人工血管的示意图；

图4为本申请中打印第一支架或第二支架的打印过程示意图；

图5为本申请中打印第一支架或第二支架的打印过程示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请的具体实施方式作进一步详细地说明。

本申请提出的小口径生物人工血管的3D打印制备方法，如图1所示，包括如下步骤：

步骤S11：在旋转收集器表面喷涂水溶性生物脱模剂。

如图2所示，打印人工血管之前，在旋转收集器31的表面喷涂水溶性生物脱模剂21，能够解决打印出的人工血管不易脱模的问题。水溶性生物脱模剂例如水溶性壳聚糖、水溶性乳酸等，不影响生物相容性。

如图3所示，旋转收集器31为打印人工血管的主体承载物，为中空的金属或非金属棒，直径范围0.2-6mm，其两端固定于缓冲轴承32上，这种中空结构加缓冲轴承的设计方式，能够缓解旋转收集器在后续制备人工血管的旋转过程中产生的抖动，保证人工血管制备的质量。

步骤S12：在旋转收集器表面打印内皮细胞。

如图3所示，采用压电喷头33在喷涂有水溶性生物脱模剂的旋转收集器表面采用3D打印方法来回反复打印内皮细胞22，直到内皮细胞厚度为0.2mm。

步骤S13：将第一支架组装于打印有内皮细胞的旋转收集器上。

第一支架23为预先制备的，其制备过程如图4和图5所示，首先控制旋转收集器31以其自体为轴心顺时针或逆时针转动；以从b端看为顺时针转动为例，控制打印喷头34，例如电动微注射喷头，从旋转收集器31的第一端a沿第一方向S1边移动边打印，直至旋转收集器的第二端b；接着，保持旋转收集器顺时针转动，再控制打印喷头34从旋转收集器的第二端b沿第二方向S 2边移动边打印，直至旋转收集器的第一端a；由此，打印出的是如图所示的网状结构， 最后将打印出的网孔结构的第一支架从旋转收集器上剥离备用。这其中，第一方向S1和第二方向S2与旋转收集器的轴向平行，且相互反向。孔径和孔隙率为根据实际应用设定的值；而打印喷头34的移动速度是根据旋转收集器的转速、旋转收集器的直径、打印喷头的打印材料挤出速度、第一支架的孔径和孔隙率设定的。

打印材料例如壳聚糖、胶原蛋白、透明质酸、聚乳酸、聚L-乳酸、聚羟基乙酸中的一种，控制第一支架的打印温度比打印材料的熔点高出5℃-10℃，打印喷头的打印材料挤出速度为1-5ml/分钟，旋转收集器的转速为10-50转/分钟，打印出的第一支架的外径比旋转收集器的外径大0.4mm，且第一支架的厚度为0.2mm。

由于打印材料的打印温度远高于细胞的存活温度，因此本申请中，第一支架采用预先制备的方式，也即在步骤S11之前制备完成，预备好的第一支架待降温后再组装在打印有内皮细胞的旋转收集器上，相比于在打印有内皮细胞的旋转收集器上直接打印第一支架，能够避免打印第一支架过程中的高温导致内皮细胞死亡的问题。

步骤S14：在第一支架表面打印平滑肌细胞。

如图2所示，在第一支架表面打印平滑肌细胞24（干细胞）的厚度为0.2mm，填充第一支架的网状结构。

步骤S15：在打印有平滑肌细胞的第一支架外围组装第二支架。

第二支架25于第一支架23同为预先制备的，其制备过程于第一支架相同，此处不予赘述。将打印出的网孔结构的第二支架外径比第一支架的外径大0.4mm，且厚度为0.2mm， 从旋转收集器上剥离备用。

由于打印材料的打印温度远高于细胞的存活温度，因此第二支架采用预先制备的方式，也即在步骤S11之前制备完成，预备好的第二支架待降温后再组装在打印有平滑肌细胞的第一支架外围，相比于在打印有平滑肌细胞的第一支架上直接打印第二支架，能够避免打印第二支架过程中的高温导致平滑肌细胞死亡的问题。

步骤S16：在第二支架上打印胶原纤维。

采用电动微注射喷头在第二支架25上打印胶原纤维26厚度为0.1mm-0.2mm，填充第二支架的网状结构。

步骤S17：将旋转收集器置入细胞培养也中浸泡并脱模获得小口径生物人工血管。

将旋转收集器置入生物反应器内，生物反应器内盛有细胞培养液；旋转收集器在细胞培养液中浸泡30分钟后脱模获得小口径生物人工血管。

基于上述提出的小口径生物人工血管的3D打印制备方法，本申请还提出一种人工血管，采用上述小口径生物人工血管的3D打印制备方法制备而成。

上述本申请提出的小口径生物人工血管的3D打印制备方法和人工血管中，采用第一支架和第二支架预先打印制备，然后再通过打印内皮细胞、逐一组装两个支架以及采用3D打印方法种植细胞于支架中的方式制备小口径生物人工血管的方式，将支架打印和细胞种植的步骤分开执行，在采用3D打印方法种植细胞（内皮细胞、平滑肌细胞）时，第一支架或第二支架已经降温，在保证细胞分层均匀种植的同时，避免了支架材料打印温度高于细胞的存活温度造成的细胞死亡的技术问题。

并且，打印过程中采用的旋转收集器采用中空结构，并将其两端安装在缓冲轴承上，减缓了打印过程中旋转收集器转动产生的抖动情况，提高了打印质量。

打印人工血管前在旋转收集器表面喷涂水溶性生物脱模剂，在不影响生物相容性前提下，解决在旋转收集器上打印人工血管不易脱模的问题。

应该指出的是，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。