本发明涉及一种药物的制药用途，具体涉及五味子甲素的制药用途。
背景技术：
五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.或华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果实。前者习称“北五味子”，后者习称“南五味子”。秋季果实成熟时采摘，晒干或蒸后晒干，除去果梗及杂质。唐等《新修本草》载“五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味”，故有五味子之名。五味子分为南、北二种。古医书称它荎蕏、玄及、会及，最早列于神农本草经上品中药，能滋补强壮之力，药用价值极高，有强身健体之效，与琼珍灵芝合用治疗失眠。由五味子果仁中可以提取出的一类木脂素类，其中包含了五味子甲素。
在不孕不育的治疗中，一半以上患者的病因是男性精子活力不足，精子活力(sperm motility)是指精液中呈前进运动精子所占的百分率。由于只有具有前进运动的精子才可能具有正常的生存能力和受精能力，所以活力与雌性受胎率密切相关，从而它是目前评定精液品质优劣的常规检查的主要指标之一。
目前针对生精能力的研究持续展开，但还未发现一种低毒且高活性的药物。
技术实现要素：
本发明提供了五味子甲素在制备生精的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素在制备促进生精的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素在制备促进精子生长的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素在制备抑制精子数量减少的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素在制备抑制精子活力减少的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素在制备提高精子活力的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素在制备提高睾丸间质细胞增殖的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素在制备治疗少精症的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素在制备治疗弱精症的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素在制备提高精子运动性的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素组合物，用于制备食品、保健品、药品；其用途包括而不限于：提高精子活力、提高睾丸间质细胞增殖、治疗少精症、治疗弱精症、提高精子运动性、生精。
本发明提供了五味子甲素组合物，用于制备食品、保健品、药品；其剂型包括而不限于：片剂，胶囊，缓释片，缓释胶囊，缓释颗粒、冻干粉、溶液等剂型。
本发明提供了至少一种高分子聚合物为缓释骨架材料，优选羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、聚氧乙烯、羟乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸共聚物等。
本发明提供了至少一种药用辅料作填充剂，优选乳糖，甘露醇，微晶纤维素或磷酸氢钙。
本发明提供了润滑剂，优选硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸。
本发明提供微粉硅胶作助流剂，
具体实施方式
本发明采用的材料和仪器
实验细胞：睾丸间质细胞系(TM3)，购自北京协和医学院细胞资源中心。
主要器材：CO2培养箱(NAPCO)；倒置显微镜(Olympus)；酶标仪(BioRad)。
主要试剂：DMEM/F12高糖培养基(Hyclone)；优级马血清(TBD21HY，北京协和医学院细胞资源中心提供)；澳洲胎牛血清(GIBICO)；胰酶(Hyclone)；PBS(Hyclone)WST-8(钮因华信)；DMSO(Sigma)。
实施例1
睾丸间质细胞的培养和处理
1睾丸间质细胞的培养方法
(1)将冻存的TM3细胞从液氮罐中取出，立即投入到37℃的恒温箱中水浴，孵育冻存管2-3分钟，直到完全融化。
(2)在超净工作台内打开螺盖，将TM3细胞吸入高压蒸汽灭菌的离心管中，加入2ml DMEM/F12高糖培养基于冻存管，冲洗细胞并转入离心管中，然后再加入2ml DMEM/F12高糖培养基于离心管中，800rpm离心5分钟，弃上清，加入3ml培养基，用吸管反复吹打使细胞悬浮。
(3)再次在超净工作台内将细胞悬液转移到一次性的塑料培养瓶中，然后再加入2ml左右的培养基，轻轻摇晃使细胞均匀地平铺培养瓶底部，放入细胞培养箱内，在37℃，5％的CO2的条件下培养。次日再换液一次，继续培养。
(4)每2-3天换培养基一次，待细胞生长至80％融合时，弃除培养液，加入2-3ml的高压蒸汽灭菌的PBS溶液漂洗细胞，去除残留血清及衰老脱落细胞。
(5)加入0.25％的胰蛋白酶溶液1ml入培养瓶，37℃消化2-5分钟，倒置相差显微镜下观察细胞形态，待细胞成片收缩变圆，细胞间隙变大，大部分细胞悬浮时，加入含血清的DMEM/F12高糖培养基2ml终止消化。收集细胞悬液，然后800rpm离心5分钟，弃上清。
(6)以4ml的DMEM/F12高糖培养基将离心管内的细胞反复吹打成细胞悬液，然后按1∶2的传代比例接种到两个新的培养瓶中，再分别补充3ml的DMEM/F12高糖培养基后继续培养。以后每4-5天左右根据细胞生长情况传代一次。
2、细胞的冻存
(1)配制冻存液(70％无血清培养基+20％血清+10％DMSO)。
(2)取对数生长期细胞，倒掉旧培养液，用无菌PBS清洗后加入0.25％胰蛋白酶消化至细胞从培养皿上脱落。加入含血清培养基终止消化。
(3)800rpm离心5分钟后，弃去培养基，加入冻存液，制成细胞悬液(计数达5×106/ml密度)，分装入冻存管。
(4)4℃，30分钟，转入-20℃，1-2h，冻存管放入-70℃冰箱(可过夜)。
(5)取出冻存管放入-160℃液氮罐中，操作完毕。
3细胞培养
(1)睾丸间质细胞培养液：取DMEM/F12培养基47ml，加入马血清2.5ml，胎牛血清1.25ml后，混匀使用。
(2)细胞
取对数生长期的细胞用胰酶消化之后按0.8x104重悬细胞并将细胞加入96孔培养板中，37℃，5％CO2培养箱中培养5h，待细胞铁壁后。收集未贴壁细胞进行实验。
实施例2
五味子甲素对睾丸间质细胞活力的影响
实验分为正常组、DMSO组、五味子甲素各剂量组。五味子甲素剂量设置如下：10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L、80μmol/L。其中五味子甲素以DMSO溶解。
药物作用24h后，弃上清液，PBS洗细胞3次，96孔板每孔加入10μl WST-8溶液，培养箱内孵育1h后，酶标仪450nm波长处检测OD值。
统计方法
使用SPSS 20.0软件对正态分布数据进行ONE-WAY ANOVA检验，均值用平均值±标准差表示，P＜0.05为显著性差异，具有统计学意义。
实验结果
与正常组比较，5‰DMSO可抑制睾丸间质细胞的增殖活性(p＜0.05)。与5‰DMSO组相比，五味子甲素10～40μmol/L范围均可明显提高睾丸间质细胞的活力(p＜0.05)。10μmol/L剂量时，与5‰DMSO组比较有显著差异(p＜0.001)，且与正常组比较亦有显著差异(p＜0.001)。五味子甲素剂量在50μmol/L以上可显著降低睾丸间质细胞的活性(p＜0.01)。
实施例3
少弱精子症模型大鼠的建立
将造模大鼠用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CP)35mg/kg进行腹腔注射，每天一次，连续5天，造成少弱精子症大鼠模型。
实验动物分组及给药：SD大鼠70只，随机分为7组，即正常组1组、模型组1组、五味子甲素高中低剂量3组，五子衍宗丸对照组1组和左卡尼汀对照组1组，每组10只。适应性饲养3天。
正常组(NS)：用生理盐水代替CP等量腹腔注射5天，从第6天起给予生理盐水进行灌胃。连续灌胃2周。
模型组(CP)：用CP 35mg/kg给予腹腔注射5天，自第6天起采用生理盐水进行灌胃。连续灌胃2周。
五味子甲素组(WWZJS)：分为高中低三个剂量组。用CP35mg/kg给予腹腔注射5天，自第6天起分别予五味子甲素(1％羧甲基纤维素钠溶解)1.24g/kg·d、0.62g/kg·d、0.31g/kg·d进行灌胃。连续灌胃2周。
左卡尼汀组(Levocarnitine)：用CP 35mg/kg给予腹腔注射5天，自第6天起予左卡尼汀2.1ml/kg·d进行灌胃。连续灌胃2周。
灌胃期间，每5天为大鼠称重一次，根据最新体重调整灌胃剂量，每天观察并记录各组实验动物的精神状态，活动程度，毛色及皮肤变化，排泄情况等。
实施例4
实验大鼠取材
所有大鼠最后一次给药24h后，先用摘两侧眼球的方法，取静脉血，取血后麻醉处死实验动物，迅速摘取睾丸、附睾，以备实验之用。2.3.1血清制备及检测
将取得的静脉血，静置一小时后离心，吸取析出的血清，冻存于-80℃冰箱备用。实施例5睾丸、附睾及精子的获取
实验大鼠取血后用10％水合氯醛，0.3ml/100g予腹腔注射麻醉，腹主动脉抽血处死大鼠，迅速摘取睾丸及附睾。
根据参考文献方法稍加改进，应用扩散法收集附睾尾精子。给药结束后处死动物，取附睾尾部放入3m137℃生理盐水(需要提前预热)中，剪碎，放置1分钟，取50μl精子混悬液，加入ImlM199中，37℃恒温水浴5分钟，取13μl加到预温的血细胞计数板用于精子质量分析。
实施例5
精液质量分析
采用WL-9000型精子质量检测系统(CASA)，测试温度37℃，将经处理的精子混悬液涂于计数板上，选取5个视野，于2min内完成测试。主要测试指标：精子密度(×106/ml)、精子活力(％)、精子活率(％)、A级精子、B级精子。
统计方法
使用SPSS20.0软件对正态分布数据进行ONE-WAY ANOVA检验，均值用平均值±标准差表示，P＜0.05为显著性差异，具有统计学意义。
实验结果
1.大鼠的基本情况
造模完成至实验结束，CP组至第10天，体重增加不明显，精神状况不佳，第10天以后，体重略有增加，体毛光泽度增加，活动状况改善，但较其他组整体状况差。其余各组，从第8天开始，大鼠体重增加，体毛出现光泽，活动逐渐增加，出现打斗的现象。
2.大鼠睾丸及附睾指数
经药物干预后，睾丸、附睾指数差别没有统计学意义，可能与干预时间短，大鼠自愈能力有关。(见表1)
表1睾丸、附睾指数
注：与NS组比较：＊P＜0.05；与CP组比较：#P＜0.05。
3.a级、b级精子及精子密度
造模后CP组大鼠a、b级精子以及精子密度均明显减少，其中b级精子、精子密度与NS组相比有明显差异(P＜0.05)，说明造模成功。给药干预后，精子活力及密度均有不同程度的改善。其中WWZJS高剂量组a、b级精子以及精子密度与CP组比较无显著差异(P＞0.05)，但从其均值来看，仍有改善的趋势；WWZJS中剂量组、WWZJS低剂量组的a级、b级精子与CP组比较有明显差异(P＜0.05)，精子密度与CP组比较无显著差异(P＞0.05)，但有改善趋势。Levocarnitine组b级精子与CP组比较有显著性差异(P＜0.05)。(如表2)
表2各组a级精子、b级精子、精子密度检测值
注：与NS组比较：＊P＜0.05；与CP组比较：#P＜0.05。
4.精力活力与活率
从表中可以看出，造模后CP组大鼠精子活力和活率均明显下降，与正常组比较有明显差异(P＜0.05)，说明造模成功；给药干预后，各组精子活力和活率均有不同程度改善，与CP组比较，WWZJS中剂量组、WWZJS低剂量组精子活力和活率明显高于CP组(P＜0.05)；WWZJS高剂量组、Levocarnitine组与CP组比较无明显差异(P＞0.05)，但有改善的趋向。(如表3)
表3各组精子活力、精子活率结果
注：与NS组比较：＊P＜0.05；与CP组比较：#P＜0.05。
5结论
CP造模后，CP组大鼠精子密度、活力和活率均较NS组大鼠显著下降，说明制备大鼠少弱精子症模型成功。经五味子甲素治疗后，中剂量组和低剂量组大鼠精子活力和活率均有不同程度的改善，与CP组比较有明显差异，高剂量组虽然无明显差异，但仍有改善趋势，说明五味子甲素能明显改善并恢复少弱精症模型大鼠的精子质量。
实施例6
本发明涉及一种五味子甲素组合物，由如下组分组成：五味子甲素与生理盐水；五味子甲素的含量是0.1μM，1μM，10μM，20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、80μM。
实施例7
本发明涉及一种五味子甲素组合物，由如下组分组成：五味子甲素与DMSO；五味子甲素的含量是0.1μM，1μM，10μM，20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、80μM。
实施例8
本发明涉及一种五味子甲素组合物，由如下组分制备而成：五味子甲素(1mg)、羧甲基纤维素钠(100mg)：
其制备方法包括如下步骤中任一：
五味子甲素、羧甲基纤维素钠，加入适量注射用水溶解。
五味子甲素、羧甲基纤维素钠，加入适量注射用水溶解，在冷冻干燥机中冻干。
实施例9
本发明涉及一种五味子甲素组合物，由如下组分组成：五味子甲素(1mg)、羧甲基纤维素钠(100mg)、乳糖(250mg)、海藻糖(210mg)。
其制备方法包括如下步骤：
五味子甲素、羧甲基纤维素钠，加入适量注射用水溶解，接着加入乳糖、海藻糖，所得混合物再次混合直至溶解，在冷冻干燥机中冻干。
实施例10
本发明涉及一种五味子甲素组合物，由如下组分组成：五味子甲素(1mg)、羧甲基纤维素钠(100mg)、乳糖(250mg)、海藻糖(210mg)、半胱氨酸(4mg)。
其制备方法包括如下步骤：
五味子甲素、羧甲基纤维素钠，加入适量注射用水溶解，接着加入乳糖、海藻糖、半胱氨酸，所得混合物再次混合直至溶解，在冷冻干燥机中冻干。
实施例11
本发明涉及一种五味子甲素组合物，由如下组分组成：五味子甲素(1mg)、聚维酮(150mg)、乙基纤维素(30mg)、微晶纤维素微丸(100mg)、欧巴代(20mg)
其制备方法包括如下步骤：
1)五味子甲素和聚维酮采用50％乙醇溶剂进行溶解，包裹于微晶纤维素微丸丸芯表面，
2)采用乙基纤维素水分散体进行微丸包衣，
3)将欧巴代加水配置成8％浓度的水溶液，作为隔离层包裹于微丸表面，
4)微丸灌装胶囊。
实施例12
本发明涉及一种五味子甲素组合物，由如下组分组成：五味子甲素(1mg)、聚维酮(150mg)、乙基纤维素(30mg)、乳糖(100mg)、羧甲基淀粉钠(20mg)、硬脂酸镁(5mg)
其制备方法包括如下步骤：
制备工艺：将主药和除硬脂酸镁之外的辅料混合均匀，以80％乙醇制软材，200目制粒，60℃干燥，加入硬脂酸镁，压片。
实施例13
实施例6-12的一种五味子甲素组合物的如下用途：
在制备生精的组合物中的用途。
在制备促进生精的组合物中的用途。
在制备促进精子生长的组合物中的用途。
在制备抑制精子数量减少的组合物中的用途。
在制备抑制精子活力减少的组合物中的用途。
在制备提高精子活力的组合物中的用途。
在制备提高睾丸间质细胞增殖的组合物中的用途。
在制备治疗少精症的组合物中的用途。
在制备治疗弱精症的组合物中的用途。
在制备提高精子运动性的组合物中的用途。
本发明提供了五味子甲素组合物，用于制备食品、保健品、药品；其用途包括而不限于：提高精子活力、提高睾丸间质细胞增殖、治疗少精症、治疗弱精症、提高精子运动性、生精。