一种医治恶性肿瘤的中药组合物及其应用的制作方法

本发明属于肿瘤用药物及其应用领域，具体涉及一种医治恶性肿瘤的中药组合物及其应用。

背景技术：

众所周知，恶性肿瘤是危害人类生命和健康最为严重的疾病之一，其死亡率仅次于心脑血管疾病，且呈逐年上升趋势。在临床治疗过程中，手术、放疗以及化疗成为当今治疗肿瘤的基本手段，寻找有效的抗肿瘤方法及药物是世界医学界面临的重要课题。近年来，随着分子生物学理论研究的不断深入，中医药治疗肿瘤的研究取得了长足发展，中药可作用于肿瘤发生、发展的多个环节，拥有安全性高、价格低廉、不良反应少等优点，在抗肿瘤方面取得了可喜的成就。中药治疗恶性肿瘤，无论是在减轻临床症状、防止复发转移、延长生存期、提高生存质量，还是在与放化疗配合、增效减毒等方面都呈现出较好的疗效。

对于恶性肿瘤的治疗，西医以外科手术、放疗、化疗目前为三大基本手段。然而外科手术不但给病人带来巨大的生理和心理上的痛苦，而且其远期疗效也不尽人意。放疗和化疗的非特异性杀灭肿瘤细胞的作用导致正常细胞和脏器损害无法避免，以至于有些患者并非死于癌症本身，而是间接的死于放疗和化疗药物所带来的毒副反应。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术中存在的不足，提供一种医治恶性肿瘤的中药组合物及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明的一种医治恶性肿瘤的中药组合物，所述的中药组合物按质量份数由30-40份北豆根、35-45份黄芪、20-25份当归、15-25份冬凌草及10-20份桃仁制成。

本发明的一种医治恶性肿瘤的中药组合物的应用，它用于治疗恶性肿瘤。

本发明相对于现有技术的有益效果是：

（1）本发明的组合物全方具有活血化瘀、软坚散结、祛瘀止痛、清热解毒及补气固表的功效，经临床验证疗效满意；

（2）北豆根清热解毒、消肿止痛；黄芪补气固表、利尿生肌、抗毒排脓；当归补血活血、调经止痛、润燥滑肠；冬凌草清热解毒，活血止痛，能祛风通络止痛；桃仁活血祛瘀，润肠通便，诸药配伍共奏具有清热解毒、补气固表、活血止痛之效。

（3）通过研究该中药组合物对体外肿瘤模型的抗肿瘤作用及作用机制，为进一步研发治疗恶性肿瘤的中药新药提供客观依据，为研发出作用机制明确安全有效的抗肿瘤中药新药奠定基础,具有重要的理论意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1为Shh mRNA RT-PCR溶解曲线图；

图2为Shh mRNA RT-PCR扩增曲线图；

图3为Ptch1 mRNA RT-PCR溶解曲线图；

图4为Ptch1 mRNA RT-PCR扩增曲线图；

图5为各组中Shh、GAPDH蛋白的表达图；

图6为各组中Ptch1、GAPDH蛋白的表达图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

具体实施方式一：本实施方式记载的是一种医治恶性肿瘤的中药组合物，所述的中药组合物按质量份数由30-40份北豆根、35-45份黄芪、20-25份当归、15-25份冬凌草及10-20份桃仁制成。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种医治恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由32-38份北豆根、38-43份黄芪、22-24份当归、18-24份冬凌草及12-18份桃仁制成。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：本实施方式的一种医治恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由34份北豆根、40份黄芪、23份当归、22份冬凌草及15份桃仁制成。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种医治恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由30份北豆根、35份黄芪、20份当归、15份冬凌草及10份桃仁组成。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种医治恶性肿瘤的中药组合物，所述的中药组合物按质量份数由40份北豆根、45份黄芪、25份当归、25份冬凌草及20份桃仁组成。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种医治恶性肿瘤的中药组合物制成水煎剂，具体方法是：按下述质量份数取30-40份北豆根、35-45份黄芪、20-25份当归、15-25份冬凌草和10-20份桃仁，将上述原料药用蒸馏水浸泡1 h后，煎煮2次，每次加入1L蒸馏水且每次煎煮30 min，两次水煎药液混匀后，利用旋转蒸发仪浓缩至100mL，制成水煎剂，并用 4℃保存。

具体实施方式七：本实施方式记载的是一种医治恶性肿瘤的中药组合物的应用，它用于治疗恶性肿瘤。

本发明中的各原料药粉碎后加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常规方法还可以做成临床上适宜的各种制剂，譬如胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。上述制剂的制备方法属于常规制剂方法，在此无需赘述。

实施例1：

临床研究

所用的中药组合物按照以下方法制备：

按以下质量份数称取各原料药：30-40份北豆根、35-45份黄芪、20-25份当归、15-25份冬凌草及10-20份桃仁。将上述原料药用蒸馏水浸泡1 h后，煎煮2次，每次加入1L蒸馏水且每次煎煮30 min，两次水煎药液混匀后，利用旋转蒸发仪浓缩至100mL，制成水煎剂，并用 4℃保存，用于以下研究：

1.资料与方法

1.1 入选标准；77例病人均为2013年9月-2015年8月在黑龙江中医药大学附属医院住院治疗的消化道恶性肿瘤病人。全部病例患者就诊时绝大多数为西医诊断确切，手术、化疗后复发者。

1.2 一般资料；设置对照组和治疗组。见表1

表1 两组临床资料

1.3 临床分期；按照国际抗癌联盟(UICC)1987年关于恶性肿瘤的TNM标准进行临床分期。77例恶性肿瘤患者中，多数是中期(占83％)，并有不同情况的转移，如淋巴结肿大，胃、脑、腹腔转移，伴胸、腹水及发烧，出血，疼痛等。

1.4 临床诊断标准；根据现代医学检查，凡为阳性者可确诊肿瘤：①胸片、x线、cr、MRI、干板等仪器检查阳性(+)；②纤维支气管镜检查阳性(+)；③活体组织取材经病理组织检查阳性(+)；④分泌物脱落细胞学检查阳性(+)；⑤体腔积液抽水检查阳性(+)；⑥凡远端器官或部位有转移者；⑦临床症状表现与上述有关诊断相结合的明确诊断。

1.5 治疗方法；治疗组应用中药组合物1剂/日, 20 天为一疗程，共3个疗程；对照组未用中药组合物。两组均同时进行辅助治疗，如祛胸水、腹水、止痛、止血、增进食欲和通便等。

1.6 疗效标准；根据病情进行血、尿、便常规化验和特异性指标化验，x线拍片、B超、CT等检查，观察临床症状，如体重、咳嗽、进食、疼痛、出血、体温、呼吸、心率、胸水、腹水、肿瘤大小等。

2.观察结果，见表2

表2 两组患者临床总疗效比较

经Ridit分析，两组间有显著性差异（概率P<0.05）。

实施例2：

药理学实验

所用的中药组合物按照以下方法制备：

按以下质量份数称取各原料药：30-40份北豆根、35-45份黄芪、20-25份当归、15-25份冬凌草及10-20份桃仁。将上述原料药用蒸馏水浸泡1 h后，煎煮2次，每次加入1L蒸馏水且每次煎煮30 min，两次水煎药液混匀后，利用旋转蒸发仪浓缩至100mL，制成水煎剂，并用 4℃保存，用于以下研究：

对人胰腺癌BxPC-3细胞进行体外培养，以中药组合物终浓度为80μg/mL、40μg/mL（中药组合物高剂量组、低剂量组），5-FU终浓度为50μg/mL（5-FU组）的培养液进行干预，对照组（C组）用正常培养液培养，进行以下实验：1.利用台盼蓝染色测定各组中BxPC-3细胞生长周期并绘制生长曲线；2.运用MTT法检测各组中BxPC-3细胞的增殖情况； 3.利用RT-PCR以及Western Blot技术检测各组BxPC-3细胞中Shh、Ptch1的mRNA及蛋白的表达，以此探讨中药组合物抗肿瘤作用机理，具体通过以下实验进行：

1.实验材料

中药组合物由北豆根、黄芪、当归、冬凌草及桃仁等组成, 按常规方法浓缩煎液成2g/mL 的生药浓度，灭菌后冷藏备用制备水煎液，4 ℃保存备用。人原位胰腺癌细胞株BxPC-3，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司；培养液: RPMI1640、IMDM购自Gibco 公司；胎牛血清: 杭州四季青生物工程公司产品。

2.主要仪器设备

CO₂ 培养箱（TC 2323 型），超净工作台，数显电热恒温干燥箱（202-2A型），倒置相差显微镜 （LH50A 型），酶联免疫检测仪 （DG3022A型），高速台式离心机 （TGL－16C型），离心机（LD42型），凝胶成像分析系统（美国Alpha Innotech公司），垂直电泳仪及转膜系统（美国Bio Rod公司），实时荧光定量PCR检测仪（美国伯乐公司）。

3实验方法

3.1 人胰腺癌BxPC-3细胞培养

3.1.1 细胞的复苏：从液氮中取出冻存管，迅速将冻存管放入已经预热至37℃水浴锅中解冻，并不断摇动，使冻存管内液体于1～2min内迅速融化。用75%酒精消毒冻存管外壁后移入超净工作台内。将管内液体吸入已灭菌的15mL EP管中，1000rpm/min离心3min，弃上清，加10mL培养基，将其吹打成单细胞悬液，细胞计数，调整细胞浓度为5×10⁵/mL接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中进行培养，次日换液。

3.1.2 细胞的传代：细胞贴壁80%左右可进行细胞传代，小心吸取原培养基，用PBS磷酸盐缓冲液冲洗两次，弃去PBS，加入适量胰蛋白酶，轻轻摇晃培养瓶，使瓶底充分接触胰蛋白酶，盖紧瓶盖，置于37℃培养箱内3～5min后，发现细胞皱缩，变亮变圆并有少量脱落时，弃去胰蛋白酶，加入2mL培养基终止消化，吹打瓶内细胞使其全部脱落，收集液体于EP管中，1500 rpm/min离心3min，弃上清，加入培养基将细胞吹打为单细胞悬液并调整细胞浓度为1×10⁵个/mL接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中继续培养。

3.1.3 细胞的冻存：细胞换液24h后将其冻存，依细胞传代操作，将细胞浓度调整为(3～9)×10⁶个/mL，1500 rpm/min离心3min，弃上清，加入适量冻存液（10%DMSO与90%FBS胎牛血清充分混合，每管1mL，现用现配），使细胞混合均匀，分装于已标记的冻存管中。然后将细胞依次置于4℃10min，-20℃30min，-80℃过夜，最后放于液氮中长期保存。

3.1.4 细胞的计数：将胰酶消化后的细胞，制成单细胞悬液，取100μL细胞悬液，与100μL 0.4%台盼蓝染液充分混匀。取一套洁净血球计数板，将盖玻片覆盖在血球计数槽上，吸取10μL上述细胞计数液沿盖玻片边缘打入，倒置显微镜下记录四个象限中未被染色的细胞数。

细胞悬液的细胞浓度=(四个象限细胞数总和/4)×2×10⁴

3.1.5 药物干预：取对数生长期人胰腺癌BxPC-3细胞，胰蛋白酶消化，PBS清洗3次，制成单细胞悬液，将细胞浓度调整为1×10⁵ 个/mL，接种于25cm²培养瓶中，放入37℃、5%CO₂培养箱培养24h，弃去原培养基，分别加入含中药组合物终浓度为80μg/mL、40μg/mL的培养基，含5-FU终浓度为50μg/mL的培养基，以及正常等体积培养基，将各组细胞置于37℃、5%CO₂培养箱培养48h。

3.1.6 实验分组

对照组：以正常培养基培养的BxPC-3细胞；

5-FU组：含5-FU终浓度为50μg/mL的培养基培养的BxPC-3细胞；

中药组合物高、低剂量组：含中药组合物终浓度分别为80μg/mL、40μg/mL的培养基培养的BxPC-3细胞。

3.2 MTT法检测细胞增殖

取对数生长期BxPC-3细胞，常规消化，制成单细胞悬液，将细胞浓度调整为2×10⁵个/mL，以100μL每孔接种于96孔培养板。培养箱中培养24h后，更换培养基，分别加入含中药组合物终浓度为80μg/mL、40μg/mL的培养基，含5-FU终浓度为50μg/mL的培养基，以及等体积正常培养基，每孔100μL，每组设6个复孔，继续培养48h，培养结束前4h，加10μL MTT于各培养孔中，继续培养4h后，小心吸取培养基，每孔加入100μL DMSO，37℃摇床震荡10min，用酶标仪于490nm波长处检测各孔的吸光度(OD)值。实验重复3次，收集数据，计算药物对BxPC-3细胞的增殖抑制率。

细胞的增殖抑制率（%）=（1—）×100%

3.3采用实时定量PCR技术检测BxPC-3细胞中Shh、Ptch1 mRNA表达水平

Trizol试剂分别提取各组细胞总RNA。总RNA经紫外线分光光度计定量后,按基因公司逆转录试剂盒操作步骤逆转录反应合成cDNA，-80℃保存备用。应用Primer5.0软件进行待测基因及内参基因的引物设计。应用SYBR Green I嵌合荧光法进行实时定量PCR，反应体系及条件参考试剂盒说明书。

3.4采用Western blot技术检测BxPC-3细胞中Shh、Ptch1的蛋白表达水平

药物处理一定时间后,提取细胞总蛋白。 型号为BCA-100蛋白质定量测定试剂盒测定样品总蛋白含量。每泳道加总蛋白20μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜上,用5%的脱脂奶粉TBST液浸泡3h,加入相应的Ⅰ抗孵育4℃过夜,用TBST液洗膜5min×3次。与相应的Ⅱ抗室温下孵育1h,用TBST液洗膜5min×3次,将膜放在1mL ECL发光试剂混合液中孵育约1min,吸掉混合液,保鲜膜固定,X线胶片曝光1～10min,显影、定影。定影及DAB显色,将反应的显影条带扫描,图像保存入计算机,用Bandscan 5.0软件对图像进行分析。

3.5 统计分析

使用统计学软件SPSS 13.0进行数据处理，所获数据均符合正态分布和方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。实验数据以“均数±标准差（）”表示，P < 0.05差异具有统计学意义，P <0.01极显著差异具有统计学意义。

4实验结果

4.1胰腺癌BxPC-3细胞增殖

表3 中药组合物对BxPC-3细胞增殖的影响

注：与对照组比较，P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

结果如表3所示，中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组和5-FU组的细胞增殖抑制率分别为72.35%、44.62%、56.07%。与对照组比较，中药组合物高、低剂量组的细胞增殖抑制率均有显著性差异（P<0.01），有统计学意义。中药组合物高剂量组的抑制作用高于5-FU组，中药组合物低剂量组的抑制作用低于5-FU组。

4.2 RT-PCR方法检测中药组合物对BxPC-3细胞Shh mRNA表达的影响

如图1、图2所示

表4 中药组合物对BxPC-3细胞Shh mRNA表达的影响（,n=5）

注：与对照组比较：P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

从表4及图1、图2结果看出，中药组合物高、低剂量组和5-FU组与对照组相比，Shh mRNA的表达均下降，差异显著（P<0.01），具有统计学意义。

4.3 中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞中Ptch 1 mRNA表达的影响

如图3、图4所示

表5 中药组合物对BxPC-3细胞Ptch 1 mRNA表达的影响（,n=5）

注：与对照组比较：P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

从表5和图3、图4结果看出，与对照组比较，中药组合物高、低剂量组和5-FU组的Ptch1 mRNA表达均降低，显著差异（P<0.01），具有统计学意义。

4.4 中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞中Shh蛋白表达的影响

如图5所示

注：C 、P80、P40、F分别代表对照组、中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组、5-FU组。

表6 中药组合物对BxPC-3细胞中Shh蛋白表达的影响

注：与对照组比较P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

结果如表6及图5表明，中药组合物高、低剂量组、5-FU组与对照组比较，Shh蛋白的表达量降低，差异显著（P＜0.01），具有统计学意义。

4.5 中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞中Ptch1蛋白表达的影响

如图6所示

表7 中药组合物对BxPC-3细胞中Ptch1蛋白表达的影响

注：与对照组比较，P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

结果如表7，图6所表明，中药组合物高、低剂量组、5-FU组与对照组比较，Ptch1蛋白的表达量降低，差异显著（P＜0.01），具有统计学意义。