一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物及其应用的制作方法

本发明属于肿瘤用药物及其应用领域，具体涉及一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物及其应用。

背景技术：

恶性肿瘤是严重危害人类健康的大敌，己经成为我国城乡居民死亡的第一杀手，并呈逐年上升趋势。防治肿瘤是当代医学界的重大课题，广泛受到国内外医学界的关注。在临床治疗过程中，手术、放疗以及化疗成为当今治疗肿瘤的基本手段，寻找有效的抗肿瘤方法及药物是世界医学界面临的重要课题。近年来，随着分子生物学理论研究的不断深入，中医药治疗肿瘤的研究取得了长足发展，中药可作用于肿瘤发生、发展的多个环节，拥有安全性高、价格低廉、不良反应少等优点，在抗肿瘤方面取得了可喜的成就。中药治疗恶性肿瘤，无论是在减轻临床症状、防止复发转移、延长生存期、提高生存质量，还是在与放化疗配合、增效减毒等方面都呈现出较好的疗效。

对于恶性肿瘤的治疗，西医以外科手术、放疗、化疗目前为三大基本手段。然而外科手术不但给病人带来巨大的生理和心理上的痛苦，而且其远期疗效也不尽人意。放疗和化疗的非特异性杀灭肿瘤细胞的作用导致正常细胞和脏器损害无法避免，以至于有些患者并非死于癌症本身，而是间接的死于放疗和化疗药物所带来的毒副反应。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术中存在的不足，提供一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明的一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物，所述的中药组合物按质量份数由35-45份北豆根、30-40份党参、20-25份川芎、15-25份丹参及15-25份甘草制成。

本发明的一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物的应用，它用于治疗恶性肿瘤。

本发明相对于现有技术具有的有益效果是：

（1）本发明的组合物其全方具有活血化瘀、软坚散结、消肿祛瘀散瘀、补中益气、补益脾胃、通经止痛的功效，经临床验证疗效满意；

（2）北豆根清热解毒、消肿止痛，党参补中益气，健脾益肺，川芎行气开郁，祛风燥湿，活血止痛，丹参活血祛瘀，通经止痛，凉血消痈，甘草除邪热，缓正气，养阴血，补脾胃，诸药配伍共奏具有补中益气、活血化瘀、补益脾胃、通经止痛之功；

（2）通过研究该中药组合物对体内肿瘤模型的抗肿瘤作用及作用机制，为进一步研发治疗恶性肿瘤的中药新药提供客观依据；为研发出作用机制明确安全有效的抗肿瘤中药新药奠定基础,具有重要的理论意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1为透射电镜观察对照组的人胰腺癌BxPC-3细胞超微结构的情况（×8800）图；

图2为透射电镜观察5-FU对人胰腺癌BxPC-3细胞超微结构的影响（×8800）图；

图3为透射电镜观察低剂量中药组合物对人胰腺癌BxPC-3细胞超微结构的影响（×8800）图；

图4为透射电镜观察高剂量中药组合物对人胰腺癌BxPC-3细胞超微结构的影响（×8800）图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

具体实施方式一：本实施方式记载的是一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物，所述的中药组合物按质量份数由35-45份北豆根、30-40份党参、20-25份川芎、15-25份丹参及15-25份甘草制成。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由38-43份北豆根、32-38份党参、21-24份川芎、18-23份丹参及18-23份甘草制成。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：本实施方式的一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由40份北豆根、35份党参、23份川芎、20份丹参及20份甘草制成。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由35份北豆根、30份党参、20份川芎、15份丹参及15份甘草制成。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由45份北豆根、40份党参、25份川芎、25份丹参及25份甘草制成。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物制成水煎剂，具体方法是：按下述质量份数取35-45份北豆根、30-40份党参、20-25份川芎、15-25份丹参和15-25份甘草，将上述原料药用蒸馏水浸泡1 h后，煎煮2次，每次加入1L蒸馏水且每次煎煮30 min，两次水煎药液混匀后，利用旋转蒸发仪浓缩至100mL，制成水煎剂，并用 4℃保存。

具体实施方式七：本实施方式记载的是一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物的应用，它用于治疗恶性肿瘤。

本发明中的各原料药粉碎后加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常规方法还可以做成临床上适宜的各种制剂，譬如胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。上述制剂的制备方法属于常规制剂方法，在此无需赘述。

实施例1：

临床研究

所用的中药组合物按照以下方法制备：

按以下质量份数称取各原料药：35-45份北豆根、30-40份党参、20-25份川芎、15-25份丹参及15-25份甘草。将上述原料药用蒸馏水浸泡1 h后，煎煮2次，每次加入1L蒸馏水且每次煎煮30 min，两次水煎药液混匀后，利用旋转蒸发仪浓缩至100mL，制成水煎剂，并用 4℃保存，用于以下研究：

1.资料与方法

1.1 入选标准：54例病人均为2015年8月-2016年11月在黑龙江中医药大学附属医院住院治疗的消化道恶性肿瘤病人。全部病例患者就诊时绝大多数为西医诊断确切，手术、化疗后复发者。

1.2 一般资料：设置对照组和治疗组。见表1

表1 两组临床资料

1.3 临床分期：按照国际抗癌联盟(UICC)1987年关于恶性肿瘤的TNM标准进行临床分期。54例恶性肿瘤患者中，多数是中期(占83％)，并有不同情况的转移，如淋巴结肿大，胃、脑、腹腔转移，伴胸、腹水及发烧，出血，疼痛等。

1.4 临床诊断标准：根据现代医学检查，凡为阳性者可确诊肿瘤：①胸片、x线、cr、MRI、干板等仪器检查阳性(+)；②纤维支气管镜检查阳性(+)；③活体组织取材经病理组织检查阳性(+)；④分泌物脱落细胞学检查阳性(+)；⑤体腔积液抽水检查阳性(+)；⑥凡远端器官或部位有转移者；⑦临床症状表现与上述有关诊断相结合的明确诊断。

1.5 治疗方法：治疗组应用中药组合物1剂/日, 20 天为一疗程，共3个疗程；对照组未用中药组合物。两组均同时进行辅助治疗，如祛胸水、腹水、止痛、止血、增进食欲和通便等。

1.6 疗效标准：根据病情进行血、尿、便常规化验和特异性指标化验， x线拍片、B超、CT等检查，观察临床症状，如体重、咳嗽、进食、疼痛、出血、体温、呼吸、心率、胸水、腹水、肿瘤大小等。

2.观察结果，见表2

表2 两组患者临床总疗效比较

经Ridit分析，两组间有显著性差异（概率P<0.05）。

实施例2：

药理学实验

所用的中药组合物按照以下方法制备：

按以下质量份数称取各原料药：35-45份北豆根、30-40份党参、20-25份川芎、15-25份丹参及15-25份甘草。将上述原料药用蒸馏水浸泡1 h后，煎煮2次，每次加入1L蒸馏水且每次煎煮30 min，两次水煎药液混匀后，利用旋转蒸发仪浓缩至100mL，制成水煎剂，并用 4℃保存，用于以下研究：

对人胰腺癌BxPC-3细胞进行体外培养，以中药组合物终浓度为80μg/ml、40μg/ml（中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组），5-FU终浓度为50μg/ml（5-FU组）的培养液进行干预，对照组（C组）用正常培养液培养，进行以下实验：1.利用台盼蓝染色测定各组中BxPC-3细胞生长周期并绘制生长曲线；2.运用MTT法检测各组中BxPC-3细胞的增殖情况；3.利用透射电镜观察中药组合物对BxPC-3细胞病理形态的变化；4.采用流式细胞术检测各组中BxPC-3细胞的细胞凋亡情况；5.利用RT-PCR以及Western Blot技术检测各组BxPC-3细胞中Smo、Gli-1 mRNA及蛋白的表达，以此探讨中药组合物抗肿瘤作用机理，具体通过以下实验进行：

体外实验：

1.实验材料

中药组合物由北豆根、党参、川芎、丹参、甘草等组成, 按常规方法浓缩煎液成2g/ ml 的生药浓度, 灭菌后冷藏备用制备水煎液, 4 ℃保存备用。人原位胰腺癌细胞株BxPC-3，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司；培养液: RPMI1640、IMDM 购自Gibco 公司；胎牛血清: 杭州四季青生物工程公司产品。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测定试剂盒 南京建成生物研究所。

2.主要仪器设备

CO₂ 培养箱（TC 2323 型），超净工作台，数显电热恒温干燥箱（202-2A型），倒置相差显微镜 （LH50A 型），酶联免疫检测仪 （DG3022A型），高速台式离心机 （TGL－16C型），离心机（LD42型），研究用显微镜（BH－2型）等。

3.实验方法

3.1 胰腺癌细胞株BxPC-3的体外培养

3.1.1细胞传代

吸出旧的培养液，加入PBS洗涤两次。加入胰蛋白酶，确保消化胰酶和细胞充分作用。放于细胞培养箱内消化3-5分钟，在发现少量细胞脱落时，加培养液终止反应。收集细胞后以1500rpm离心5分钟，除去上清液后PBS液两次清洗。加入培养液后多次吹打，将单细胞悬液的浓度调到1×10⁵个/m1。最后接种于培养瓶，放入37℃、5%CO₂培养箱继续培养。

3.1.2细胞冻存

提前配置冻存液（10%DMSO和90%FBS混合），加入传代后的浓度调到3-9×10⁶个/ml的细胞。装入多个准备好的冻存管里，先放入4℃。10分钟后取出，放入-20℃中。半小时后取出，放入-80℃。第二天取出，放入液氮内长期储存。

3.1.3细胞复苏

自液氮（-196℃）取出冻存管，立即投入37℃水浴。轻柔摇动，争取在2分种内融解管内液体。在放入超净工作台之前，以75%酒精擦拭管壁。将解冻的细胞悬液吸入EP管，以1000rpm离心3分种。再加入培养基，吹打成单细胞悬液。进行细胞计数，将浓度调为5×10⁵个/ml。将培养瓶放于37℃、5%CO₂培养箱内，第二天更换培养液。

3.1.4药物干预

应用胰蛋白酶对处于对数生长期的人胰腺癌细胞株BxPC-3进行消化。再用PBS液清洗三次，并且制成浓度为1×10⁵个/ml 的单细胞悬液。分别接种于四个培养瓶，间隔24小时后从培养箱取出。弃去培养液分组给药：中药组合物高剂量组为终浓度48μg/ml的中药组合物培养液；中药组合物低剂量组为终浓度24μg/ml的中药组合物培养液；5-FU组为终浓度50μg/ml的5-FU培养液；Control组为常规培养液。给药后放于细胞培养箱中48小时。

3.1.5 细胞的计数

将盖玻片置于血细胞计数板凹槽，并擦拭干净。均匀吹打细胞，确保为单细胞悬液。吸取100μl加入等量的台盼蓝。将10μl混合液滴在并等其渗入盖玻片与计数板间隙，相差显微镜下计数。其活细胞浓度为：四个象限中存活（未染色）的细胞数之和/4×2×10⁴。

3.2 MTT法检测胰腺癌细胞株BxPC-3的细胞增殖

取用对数生长期的BxPC-3细胞，以胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液。调整其细胞浓度至2×10⁵个/ml，然后分别取100μl滴加于96孔培养板。常规培养24小时后，换液加药：中药组合物高剂量组为终浓度48μg/ml的中药组合物培养液；中药组合物低剂量组为终浓度24μg/ml的中药组合物培养液；5-FU组为终浓度50μg/ml的5-FU培养液；Control组为常规培养液。给药后放于37℃、5%CO₂培养箱48小时。每组各设6个复孔，每孔加液量为100μl。继续培养44小时后， 向各培养孔滴加10μl的MTT（5mg/ml）溶液。再次培养4小时后，终止培养。弃去培养液，向各孔滴加100μl 的DMSO。置于水平摇床震荡10分钟，使结晶物溶解。设置酶标仪波长在490nm，检测各孔的光密度（OD）值。重复进行三次，用结果分析中药组合物和5-FU对BxPC-3细胞的抑制率。其增殖抑制率为：（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

3.3 FCM法检测胰腺癌细胞株BxPC-3的细胞凋亡

将处于对数生长期的BxPC-3细胞株浓度调至2×l0⁵/ml，分别移入25cm²的培养瓶。每瓶均加入4ml，并放入细胞培养箱培养一天。分别给药：中药组合物高剂量组为终浓度48μg/ml的中药组合物培养液；中药组合物低剂量组为终浓度24μg/ml的中药组合物培养液；5-FU组为终浓度50μg/ml的5-FU培养液；Control组为常规培养液。给药后放入细胞培养箱中两天，取出后PBS洗两遍。胰蛋白酶消化3-5分钟后，加培养液终止反应。以1500rpm离心5分钟，之后由PBS洗涤两次。每管加Annexin V-FITC试剂5μl，混合后进行10分钟的室温（20-25℃）避光孵育。再以1000rpm离心5分钟，除去上清后，每管加Annexin V-FITC结合液190μl。每管加10μl的碘化丙啶（Propidium iodide，PI）进行染色，混合后冰浴，同时注意避光。使用流式细胞仪检测，在488nm激发波长处检测红色荧光，以及光散射的数据。以细胞仪自带的软件（CellQuest）收集所有数据，并进行处理和分析。

3.4采用实时定量PCR技术检测BxPC-3细胞中Smo、Gli-1mRNA表达水平

Trizol试剂分别提取各组细胞总RNA。总RNA经紫外线分光光度计定量后,按基因公司逆转录试剂盒操作步骤逆转录反应合成cDNA，-80℃保存备用。应用Primer5.0软件进行待测基因及内参基因的引物设计。应用SYBR Green I嵌合荧光法进行实时定量PCR，反应体系及条件参考试剂盒说明书。

3.6 Western Blot法检测BxPC-3细胞中Smo和 Gli-1蛋白的表达

药物处理一定时间后,提取细胞总蛋白。 BCA-100蛋白质定量测定试剂盒测定样品总蛋白含量。每泳道加总蛋白20μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜上,用5%的脱脂奶粉TBST液浸泡3h,加入相应的Ⅰ抗孵育4℃过夜,用TBST液洗膜5min×3次。与相应的Ⅱ抗室温下孵育1h,用TBST液洗膜5min×3次,将膜放在1ml ECL发光试剂混合液中孵育约1min,吸掉混合液,保鲜膜固定,X线胶片曝光1～10min,显影、定影。定影及DAB显色,将反应的显影条带扫描,图像保存入计算机,用Bandscan 5.0软件对图像进行分析。

3.7 统计分析

使用统计学软件SPSS 13.0进行数据处理，所获数据均符合正态分布和方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。实验数据以“均数±标准差（）”表示，P < 0.05差异具有统计学意义，P <0.01极显著差异具有统计学意义。

3.8 统计分析

使用统计学软件SPSS 13.0进行数据处理，所获数据均符合正态分布和方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。实验数据以“均数±标准差（）”表示，P < 0.05差异具有统计学意义，P <0.01极显著差异具有统计学意义。

4.实验结果

4.1台盼蓝染色法检测细胞的生长曲线

表3 不同时间各组活细胞数

注：与对照组比较，P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

如表3所示，中药组合物对BxPC-3细胞具有增殖抑制作用，并且随着药物浓度的增大和干预时间的延长，抑制作用增强。与对照组相比，中药组合物对BxPC-3细胞的增殖抑制作用显著增强，以中药组合物高剂量组最为明显，依次为5-FU组、中药组合物低剂量组，P＜0.01，显著性差异，具有统计学意义。

4.2 中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞增殖的影响

表4 中药组合物对BxPC-3细胞增殖的影响

注：与对照组比较，P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

结果如表4所示，中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组和5-FU组的细胞增殖抑制率分别为72.35%、44.62%、56.07%。与对照组比较，中药组合物高、低剂量组的细胞增殖抑制率均有显著性差异（P<0.01），有统计学意义。中药组合物高剂量组的抑制作用高于5-FU组，中药组合物低剂量组的抑制作用低于5-FU组。

4.3 透射电镜观察中药组合物对人胰腺癌BxPC-3细胞超微结构的影响

如图1、图2、图3、图4所示。

对照组：镜下观察细胞结构完整，核异型性及核仁明显，核膜较完整、细胞间隙正常，清晰的圆形或不规则形的肿瘤细胞，细胞内细胞器结构清晰，瘤细胞表面可见微绒毛。

5-FU组：镜下可见细胞表面微绒毛减少甚至消失；部分瘤细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，核周隙加宽，呈细胞早期凋亡状态；线粒体絮状变性、嵴断裂，呈空泡变性，内质网扩张成池，胞内游离核蛋白体丰富，可见脂滴堆积。

中药组合物低剂量组：细胞的体积明显变小，细胞间隙增大，细胞核固缩，细胞膜凹陷不完整，且核染色质高度凝集、固缩于核膜下，部分细胞核碎裂、崩解，细胞质密度增高，可见有凋亡小体样形成，微绒毛脱落。

中药组合物高剂量组：细胞核碎裂崩解，核染色质高度浓缩边集，线粒体空泡状改变等的胞浆内出现空泡，细胞器结构消失，细胞膜融合，细胞边界不清，细胞裂解碎片。

如图1、图2、图3、图4所示

4.4 中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞细胞凋亡率的影响

表5 中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞细胞凋亡率的影响

注：与对照组比较，P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

流式细胞仪测细胞凋亡的细胞图分为四个象限，分别是：左下象限为活细胞，左上象限为机械损伤细胞，右上象限是坏死细胞和晚期凋亡，右下象限是早期凋亡细胞。检测结果表明，中药组合物高、低剂量组、5-FU组细胞凋亡率分别为11.06%、5.70%、8.09%，对照组的细胞凋亡率为2.68%。与对照组相比，各给药组细胞凋亡率升高，显著性差异(P＜0.01)，有统计学意义。具体见表5和图2。

4.5 RT-PCR方法检测Smo mRNA表达的影响

表6 中药组合物对BxPC-3细胞Smo mRNA表达的影响（,n=5）

注：与对照组比较：P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

由表6结果看出，与对照组相比，中药组合物高、低剂量组和5-FU组的Smo mRNA的表达量均下降，差异显著（P＜0.01），具有统计学意义（P＜0.01）。

4.6 RT-PCR方法检测Gli-1 mRNA表达的影响

表7 中药组合物对BxPC-3细胞Gli-1 mRNA表达的影响（,n=5）

注：与对照组比较，P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

由表7结果看出，中药组合物高、低剂量组和5-FU组与对照组相比，Gli-1 mRNA的表达降低，极显著差异（P＜0.01），具有统计学意义。

4.7 中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞中Shh蛋白表达的影响

注：从左至右依次为对照组、中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组、5-FU组。

表8 中药组合物对BxPC-3细胞中Shh蛋白表达的影响

注：与对照组比较P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

结果如表8所表明，中药组合物高、低剂量组、5-FU组与对照组比较，Shh蛋白的表达量降低，差异显著（P＜0.01），具有统计学意义。

4.8中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞中Smo蛋白表达的影响

注：从左至右依次为对照组、中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组、5-FU组。

表9 中药组合物对BxPC-3细胞中Smo蛋白表达的影响

注：与对照组比较，P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

结果如表9所表明，中药组合物高、低剂量组、5-FU组与对照组比较，Smo蛋白的表达量降低，差异显著（P＜0.01），具有统计学意义。

4.9 中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞中Gli-1蛋白表达的影响

注：从左至右依次为对照组、中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组、5-FU组。

表10 中药组合物对BxPC-3细胞中Gli-1蛋白表达的影响

注：与对照组比较，P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

如表10结果表明，中药组合物高、低剂量组、5-FU组与对照组比较，Gli-1蛋白的表达量降低，差异显著（P＜0.01），具有统计学意义。