可降解硫醇‑烯聚合物及其制备方法与流程
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年2月9日提交的美国临时专利申请62/114,034的优先权，将其公开内容通过引用并入本文。
本发明涉及使用自由基硫醇-烯和硫醇-炔化学使多肽(包括肽和蛋白质)与另一部分连接的方法，包含所述经连接的多肽(例如，多肽缀合物和基于硫醇-烯的生物相容性水凝胶聚合物)的组合物，及其在生物材料领域中的用途。
背景技术：
生物材料领域在过去几十年中经历了戏剧性的演变。随着生物材料的新颖组合的发展，工程师在创建聚合物材料方面取得了长足的进步，以满足当今未满足的临床需求。已经用于制造这些生物材料的经典化学具有显著的局限性，从而推动了该领域，以鉴定用于构建生物相容性生物聚合物的新方法。点击化学(clickchemistry)的出现提供了克服经典化学的一些局限性的机制，但是在这些反应需要相当大的发展后方可用于生物医学工程。
自由基介导的硫醇-烯和硫醇-炔化学具有点击样(click-like)性质，为广泛的生物医学应用提供了多功能平台。bowman等人在美国专利7,288,608中首先描述了使用自由基介导的硫醇-烯化学形成可降解聚合物，将其通过引用并入本文。anseth等人在美国专利申请13/981,885中描述了使用自由基介导的硫醇-炔化学的用途，将其通过引用并入本文。通常认为，在活细胞和/或组织存在下，这种独特温和的化学可用于产生逐步生长(step-growth)聚合物网状物。术语“生物正交(bioorthogonal)”通常用于描述不改变聚合混合物内的生物活性组分(细胞、组织、蛋白质、肽)的化学，诸如本文所述的自由基介导的硫醇-烯化学。已经在许多应用中证明了基于硫醇-烯化学的材料，包括伤口愈合、软骨修复即细胞和药物递送。
在最近的一篇论文中，mccall和anseth评价了当包囊于通过在自由基介导的硫醇-烯反应中使peg-降冰片烯与peg-二硫醇反应而产生的水凝胶中时，溶菌酶和tgfβ的活性。该研究的结果表明“硫醇-烯点击反应能够在低引发剂浓度快速进行，而对原位蛋白质生物活性几乎没有影响”。
对于许多应用，将蛋白质或肽掺入聚合物骨架是有用的。例如，在anderson等人中，降冰片烯官能化的四臂peg大分子单体与侧面有半胱氨酸的基质金属蛋白酶(mmp)可降解肽交联，以产生由细胞分泌的mmp降解的水凝胶网状物。包囊在该水凝胶内的人类间充质干细胞似乎保持其活性并能够增殖。在另一实例中，mariner等人包囊重组骨形态发生蛋白(bmp)在类似的水凝胶中，而未观察到bmp活性的丧失。值得注意的是，尽管在后一个实例中交联的携带双半胱氨酸(dicysteine)的寡聚肽共价附接至聚合物骨架上，但是缺乏游离硫醇的bmp并不共价附接至水凝胶上，并且没有检测到bmp2的生物学活性丧失。经由半胱氨酸残基掺入或连接肽或蛋白质的这些方法是常用的，并且在本领域内被认为不会导致被包囊或掺入网状物内的生物组分的活性丧失。
然而，我们意外地发现，包囊在由与侧面有半胱氨酸的mmp可降解肽交联的降冰片烯官能化的四臂peg大分子单体形成的硫醇-烯水凝胶中的蛋白质通过该反应基本上被改性-即使当使用水凝胶聚合所需的最小量的自由基引发剂和暴露时间时。因此，仍然需要经由不需要产生高浓度的有害自由基的硫醇化学，将蛋白质或肽结合或附接至聚合物的方法。
技术实现要素：
本发明公开了使用自由基介导的硫醇-烯化学将多肽(包括肽和蛋白质)附接至另一部分的组合物和方法，例如，通过在促进自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔反应的条件下使附接至多肽的反应性硫醇基团(具有比半胱氨酸硫醇基团更高的活性)与烯烃或炔化合物反应。本发明还提供了通过这些方法生产的生物材料及其在医疗领域中的用途。
在一个方面，本发明提供了一种连接包含肽骨架和一种或多种反应性硫醇基团的多肽(包括肽和蛋白质)的方法，包括在促进自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔化学的条件下使一种或多种反应性硫醇基团与烯烃或炔化合物反应，其中所述硫醇基团在类似条件下比半胱氨酸硫醇基团具有更高的用于经历自由基硫醇-烯或硫醇-炔反应的反应活性。在一些实施方案中，多肽的反应性硫醇基团具有为半胱氨酸硫醇基团至少2倍、5倍或10倍的反应性。在一些实施方案中，多肽的反应性硫醇基团通过至少两个碳原子与肽骨架隔开。在一些实施方案中，反应是由自由基引发剂启动。在一些实施方案中，反应可由光启动。在一些实施方案中，反应可在降低的氧气环境中或在不存在氧的情况下进行。
在一个方面，提供了用于连接多肽的方法，其中所述多肽包含肽骨架和一种或多种反应性硫醇基团，所述方法包括使多肽的反应性硫醇基团与自由基引发剂和包含一种或多种反应性烯基团的烯化合物或包含一种或多种反应性炔基团的炔化合物，其中多肽的反应性硫醇基团通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开。
在一些实施方案中，多肽的反应性硫醇基团是经由接头诸如peg接头附接至赖氨酸残基的侧链氨基的硫醇基团。
在一些实施方案中，所述自由基引发剂为选自以下的光引发剂：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(lap)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸钠(nap)、2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(例如，
在一些实施方案中，所述硫醇-烯反应通过使光引发剂暴露于具有与光引发剂的激发波长相匹配的波长的光而引发。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括控制光引发剂的量、光的强度和/或光引发剂暴露于光的时间。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括从反应混合物中部分或全部除去氧气。
在一些实施方案中，所述硫醇-烯反应达到如所测量的约70％完成至约95％完成，作为非限制性实例，通过流变学或通过使用elman测定游离硫醇的消耗。在其它实施方案中，所述硫醇-烯反应达到约70％完成至100％完成。在其它实施方案中，所述硫醇-烯反应达到约95％完成至100％完成。
在一些实施方案中，所述多肽包含两个或更多个反应性硫醇基团，其各自通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开。
在一些实施方案中，所述烯化合物包含两个或更多个反应性烯基团。
在一些实施方案中，所述多肽包含n个反应性硫醇基团，所述烯化合物包含m个反应性烯基团，其中n和m独立地为≥2的整数且n+m≥5。
在一些实施方案中，所述烯化合物为烯改性的生物相容性单体且所述硫醇-烯反应提供生物相容性交联的聚合物基质。
在优选的实施方案中，所述烯化合物为降冰片烯改性的聚乙二醇(peg)。
在一些实施方案中，所述烯化合物为烯改性的非生物相容性单体且所述硫醇-烯反应提供非生物相容性交联的聚合物基质。
在前述实施方案的一些变型中，所述多肽进一步包含已知对蛋白酶敏感的肽序列，诸如可被基质金属蛋白酶降解的肽。在另一变型中，所述多肽为侧面有活性硫醇的纤溶酶可降解肽。在再一变型中，两种纤溶酶可降解序列包含在所述肽内。包含一种或多种可酶促降解的序列的其它变型将由本领域技术人员所理解。
在一些实施方案中，所述硫醇-烯反应提供生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物。
在一些实施方案中，所述硫醇-烯反应提供生物相容性交联的非可降解水凝胶聚合物。
在一些实施方案中，所述硫醇-烯反应提供非生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物。
在一些实施方案中，所述硫醇-烯反应提供非生物相容性交联的非可降解水凝胶聚合物。
在另一方面，所述烯化合物包含一个反应性烯基团。
在一些实施方案中，所述烯化合物包括聚合物(例如，peg)、捕获部分(例如，生物素)、标记物(例如，荧光标记)、碳水化合物、核酸或第二多肽。
在其它实施方案中，所述烯化合物包含生物活性组分(例如，药物、毒素或农药)。
在一些实施方案中，所述多肽包含通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开的一个反应性硫醇基团。
在一些实施方案中，所述多肽选自肽或蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗性蛋白、酶和结构蛋白。
在再一方面，所述多肽包含通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开的一个反应性硫醇基团，且所述烯化合物包含两个或更多个反应性烯基团。
在一些实施方案中，所述烯化合物包含两个或更多个反应性烯基团。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使第二硫醇化合物与包含两个或更多个反应性烯基团的烯化合物反应，其中所述第二硫醇化合物包含两个或更多个反应性硫醇基团。在一些实施方案中，所述烯化合物为非生物可降解的烯化合物。在一些实施方案中，所述第二硫醇化合物为非生物可降解的硫醇化合物。在一些实施方案中，所述烯化合物为非可降解的烯化合物。在一些实施方案中，所述第二硫醇化合物为非可降解的硫醇化合物。
在一些实施方案中，所述第二硫醇化合物包含j个反应性硫醇基团，所述烯化合物包含k个反应性烯基团，其中j和k独立地为≥2的整数且j+k≥5。
在一些变型中，所述第二硫醇化合物包含选自以下的聚合物部分：聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
在其它变型中，所述第二硫醇化合物包含肽骨架、可降解的肽和两个或更多个反应性硫醇基团，所述硫醇基团各自通过两个或更多个碳原子与肽骨架隔开。在其它变型中，所述第二硫醇化合物包含肽骨架、非可降解的肽和两个或更多个反应性硫醇基团，所述硫醇基团各自通过两个或更多个碳原子与肽骨架隔开。
在其它变型中，所述第二硫醇化合物包含已知对蛋白酶敏感的肽序列和位于肽序列侧翼的两个高半胱氨酸残基。
在其它变型中，所述第二硫醇化合物包含聚乙二醇和附接至聚乙二醇的两个末端硫醇基团。
在一些实施方案中，所述烯化合物包含选自以下的聚合物部分：聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
在所有前述方面的变型中，所述方法进一步包括产生包含一个或多个反应性硫醇基团的多肽。
在前述变型的一些实施方案中，产生包含一个或多个反应性硫醇基团的多肽包括使用经保护的含硫醇的氨基酸的多肽合成，其中所述硫醇基团通过两个或更多个碳原子与邻近羧基的碳原子隔开，所述经保护的含硫醇的氨基酸诸如经保护的高半胱氨酸或2-氨基-5-巯基戊酸，或经保护的含硫醇的氨基酸类似物或经保护的含硫醇的氨基酸模拟物。
在前述变型的一些实施方案中，产生包含一个或多个反应性硫醇基团的多肽包括使用硫醇化剂修饰多肽(例如，通过使肽中的氨基与硫醇化剂诸如n-琥珀酰亚胺基-3-(乙酰基硫基)丙酸酯(satp)、n-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯或nhs-peg-sh反应)。
在前述变型的一些实施方案中，产生包含一个或多个反应性硫醇基团的多肽包括将多肽中的甲硫氨酸残基进行化学或酶促转化为高半胱氨酸残基。
本发明还公开了通过前述方面、实施方案和变型中任一项的方法产生的连接多肽(linkedpolypeptide)。在一些实施方案中，所述连接的多肽连接至生物相容性交联的聚合物基质。在一些实施方案中，所述连接的多肽连接至非生物相容性交联的聚合物基质。
在另一方面，本发明公开了产生生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的方法，包括使反应性硫醇化合物与自由基引发剂和反应性烯化合物反应，其中所述反应性硫醇化合物包含肽骨架、可降解的肽和两个或更多个反应性硫醇基团，所述硫醇基团各自通过两个或更多个碳原子与肽骨架隔开；且所述反应性烯化合物是包含两个或更多个反应性烯基团的烯改性的生物相容性单体。在一些实施方案中，所述烯化合物含有任何合适的烯属不饱和基团，诸如但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基
在一些实施方案中，所述方法进一步包括从反应混合物中部分或全部除去氧气。
在一些实施方案中，所述多肽包含n个反应性硫醇基团，所述烯化合物包含m个反应性烯基团，其中n和m独立地为≥2的整数且n+m≥5。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将生物活性组分添加到反应混合物中，其中所述生物活性组分与生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质相关联(associate)(例如，包囊于或共价结合至(掺入或附接至其上))。
在一些实施方案中，所述硫醇化合物的反应性硫醇基团独立地选自多肽的高半胱氨酸残基的硫醇基团、多肽的2-氨基-5-巯基戊酸残基的硫醇基团和经由接头附接至赖氨酸残基的侧链氨基的硫醇基团。
在一些实施方案中，所述自由基引发剂为选自以下的光引发剂：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(lap)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸钠(nap)、2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(例如，
在一些实施方案中，所述反应性烯化合物包含选自以下的聚合物部分：聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
在一些实施方案中，所述烯化合物含有任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基或其任意组合。在优选的实施方案中，所述烯化合物为降冰片烯衍生的化合物，诸如包含降冰片-2-烯-5-基的烯化合物。在一些实施方案中，所述烯化合物的反应性烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基或其任意组合。在一些实施方案中，所述反应性烯基团为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，所述烯属不饱和基团可进一步取代有一个或多个合适的取代基，诸如作为非限制性实例，卤素、烷基、烷氧基或氧代。在一些实施方案中，所述烯化合物包含一个或多个降冰片-2-烯-5-基，诸如在个末端含有降冰片烯部分(例如，降冰片-2-烯-5-基)的直链或支链peg。对于硫醇-炔反应，所述炔化合物含有一个或多个炔基团，诸如一个或多个乙炔基、炔丙基、丙炔酸酯、环炔等或其任意组合。
在一些实施方案中，所述生物活性组分为组织、细胞、蛋白质、肽、小分子药物、核酸、包囊的核酸(例如包囊于脂质纳米颗粒中)、脂质、碳水化合物或农业化合物。
在前述实施方案的一些变型中，所述生物活性组分包囊于生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质中。
在前述实施方案的其它变型中，所述生物活性组分共价键合至[例如，掺入或附接至]生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质。
在前述实施方案的其它变型中，所述生物活性组分为经由通过使生物活性多肽的反应性硫醇基团与烯基团反应形成的硫醚连接键而共价键合至聚合物基质的生物活性多肽，其中硫醚连接键的硫基通过两个或更多个碳原子与生物活性多肽的骨架隔开。
本发明还公开了通过根据前述方面的实施方案中任一项的方法制备的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物。
本发明还公开了通过根据前述方面的实施方案中任一项的方法制备的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物，其进一步包含与生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质相关联(例如，包囊于或共价键合至(掺入或附接至))的生物活性组分。
如本领域技术人员所理解，在一些变型中，其实施方案和变型中任一项的前述方面的方法可与非生物相容性和/或非可降解的烯化合物和/或非生物相容性和/或非可降解的硫醇化合物应用。因此，本发明还公开了通过所述变型的方法生产的非生物相容性和/或非可降解的交联水凝胶聚合物。
本文公开了式(a)化合物：
p-[ct-s-c-c-q]x
其中p为多肽，t≥2，ct为包含至少两个碳原子的接头[即，p经由长度为两个碳原子或更长的接头连接至一个或多个硫醚部分]，x为1或大于1的整数[例如，2、3、4或更大]且q为生物活性组分[例如，药物、毒素或农药]、聚合物[例如，peg]、捕获部分[例如，生物素]、标记物[例如，荧光标记物]、碳水化合物、核酸或第二多肽。
如本领域技术人员所理解，式a中硫原子和q之间的c-c部分是由反应性硫醇基团(p-[ct-sh]x的sh部分)和反应性烯基(携带合适的烯属不饱和基团的q的-c＝c-部分)的硫醇-烯反应得到的部分。本文理解和描述的是，所述烯属不饱和基团(-c＝c-部分)可直接或经由接头部分结合至q，诸如作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。还应当理解，反应性烯基团可为末端未经取代的烯基团(例如，ch2＝ch-q)或可在一个或多于一个烯基碳处被取代，包括其中-c＝c-部分是掺合双键的环结构的一部分(例如，降冰片烯衍生的q或t-q)的取代。进一步理解和描述的是，式a的ct部分是长度为至少两个原子的接头，并且该部分可为未取代的或经取代的。
在一些实施方案中，式(a)化合物通过使式p-[ct-sh]x化合物和式ch2＝ch-q化合物及自由基引发剂反应产生，其中p、ct、x和q如针对式(a)所定义。在一些实施方案中，式(a)化合物在减少的氧气环境中或在不存在氧气的情况下产生。
在一些实施方案中，本发明还提供了式(a)化合物，其中c-c部分衍生自除末端未取代烯烃以外的烯烃，且可通过使式p-[ct-sh]x化合物和式ch2＝ch-q化合物及自由基引发剂(诸如本文所述的光引发剂)反应产生，其中p、ct、t、q和x如针对式(a)所定义且t表示除末端未取代烯烃部分以外的烯烃部分。在一个方面，t为环烯烃部分，其可为单环或二环环烯烃，其可具有至多两个选自o、s和n的环杂原子，且其可为经取代的，且其中所述二环环烯烃可为稠合、桥接或螺二环。在一些实施方案中，t包含降冰片-2-烯-5-基。
本文还公开了式(b)化合物：
[p-ct-s-c-c]y-q
其中p为多肽，t≥2，ct为包含至少两个碳原子的接头[即，p经由长度为两个碳原子或更长的接头连接至一个或多个硫醚部分]，y为1或大于1的整数[例如，2、3、4或更大]且q选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
如本领域技术人员所理解，式(b)中硫原子和q之间的c-c部分是由反应性硫醇基团(p-ct-sh的sh部分)和反应性烯基(携带合适的烯属不饱和基团的q的-c＝c-部分)的硫醇-烯反应得到的部分。本文理解和描述的是，所述烯属不饱和基团(-c＝c-部分)可直接或经由接头部分结合至q，诸如作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。还应当理解，反应性烯基团可为末端未经取代的烯基团(例如，[ch2＝ch]y-q)或可在一个或多于一个烯基碳处被取代，包括其中-c＝c-部分是掺合双键的环结构的一部分(例如，降冰片烯衍生的q或t-q)的取代。进一步理解和描述的是，式(b)的ct部分是长度为至少两个原子的接头，并且该部分可为未取代的或经取代的。
在一些实施方案中，式(b)化合物通过使式p-ct-sh化合物和式[ch2＝ch]yq化合物及自由基引发剂反应产生。p、ct、y和q如针对式(b)所定义。在一些实施方案中，式(b)化合物在减少的氧气环境中或在不存在氧气的情况下产生。
在一些实施方案中，本发明还提供了式(b)化合物，其中c-c部分衍生自除末端未取代烯烃以外的烯烃，且可通过使式p-ct-sh化合物和式[t]y-q化合物及自由基引发剂(诸如本文所述的光引发剂)反应产生，其中p、ct、t、q和x如针对式(b)所定义且t表示除末端未取代烯烃部分以外的烯烃部分。在一个方面，t为环烯烃部分，其可为单环或二环环烯烃，其可具有至多两个选自o、s和n的环杂原子，且其可为经取代的，且其中所述二环环烯烃可为稠合、桥接或螺二环。在一些实施方案中，t包含降冰片-2-烯-5-基。
本文还公开了聚合材料[例如，涉及硫醇-烯水凝胶]，其包含重复的式(i)单元：
其中x为多肽，t≥2，ct为包含至少两个碳原子的接头[即，x经由长度为两个碳原子或更长的接头连接至两个硫醚部分]，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
在一些实施方案中，所述聚合物材料进一步包含与聚合物材料的聚合物基质相关联(例如，包囊于或共价键合至(掺入或附接至))的生物活性组分。
本文还公开了一种用于治疗有此需要的受试者(例如人或动物)的疾病或病症的方法，包括给予经修饰的多肽；与生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物相关联(例如，包囊于或共价键合至(掺入或附接至))的生物活性组分；化合物；或与前述方面、实施方案及其变型的聚合物材料相关联(例如，包囊于或共价键合至(掺入或附接至))的生物活性组分。
本文还公开了一种用于再生组织的方法，包括在损伤或缺陷组织的部位释放包囊于前述方面的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物中的细胞或组织。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在损伤或缺陷组织的部位产生包含生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的组合物。
附图简述
图1示出氨基酸a)半胱氨酸、b)高半胱氨酸、c)2-氨基-5-硫基戊酸和硫醇化剂、d)hs-peg-nhs、e)n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫基丙酸酯(satp)、f)n-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯和g)nhs-降冰片烯的代表性结构。
图2示出经由赖氨酸残基的hs-peg-nhs修饰添加反应性硫醇基团的方案。
图3示出使生物活性成分与聚合物基质相关联的示意性示例性方面。
图4a-4e示出使多肽与聚合物基质相关联的示意性示例性方面。
图5示出水凝胶光聚合的流变学痕迹，证明二-半胱氨酸交联剂相对于peg-二硫醇交联剂而言反应速率慢。
图6示出ellman测定的结果，表明在光引发的硫醇-烯反应过程中，多种含硫醇化合物的游离硫醇基团的消耗。
图7示出sds-page实验，证明在将含二半胱氨酸的肽掺入硫醇-烯聚合物所需的条件下的蛋白质损伤。
图8a和8b示出ellman测定的结果，证明在包含高半胱氨酸的多种含硫醇化合物的光引发的硫醇-烯反应过程中游离硫醇基团的消耗。
图9示出水凝胶光聚合的流变曲线，表明二半胱氨酸交联剂相对于二高半胱氨酸交联剂的反应速率慢。
图10示出sds-page实验，证明在将含二半胱氨酸的肽掺入硫醇-烯聚合物中所需的条件下的蛋白质损伤，并且在将含二高半胱氨酸的肽掺入到硫醇-烯聚合物所需的条件下缺少蛋白质损伤。
图11示出如通过经ellman测定的游离硫醇基团的消耗率监测的溶液中氧的存在对光引发的硫醇-烯反应的速率的影响。
图12a示出具有各种骨架的硫醇化合物的代表性结构。
图12b示出ellman测定的结果，证明在光引发的硫醇-烯反应过程中半胱氨酸骨架的修饰对游离硫醇基团的消耗的影响。
具体实施方式
本发明提供了使用自由基介导的硫醇-烯和硫醇-炔化学使多肽(包括肽和蛋白质)连接至一个或多个其它部分的组合物和方法。所述方法的一些方面包括在促进自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔化学的条件下使附接至多肽的反应性硫醇基团与烯或炔化合物反应。与使用半胱氨酸硫醇的方法相比，所述方法提供了改进的经由自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔反应使肽和蛋白质与其它部分偶联的效率。使用例如蛋白质和肽缀合物和基于硫醇-烯的生物相容性聚合物产生的连接的多肽可用于治疗人和动物疾病以及用作医疗应用诸如伤口愈合和组织重建的生物材料。
除非另有明确说明，否则本文所用的术语“一个”或“一种”是指一个(种)或多个(种)。
本文中对“约”值的引用包括(和描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约x”的描述包括“x”的描述。
方法
本发明的一个方面提供了使用自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔化学连接多肽的方法。与目前科学和专利文献的当前教导相反，诸如本文中考虑使用半胱氨酸硫醇基团的硫醇-烯反应作为用于连接多肽的“生物正交”方法的那些参考文献，我们意外地发现，包囊于由与侧面有半胱氨酸的mmp可降解肽交联的降冰片烯官能化的四臂peg大分子单体所形成的硫醇-烯水凝胶中的蛋白质通过该反应基本上被改性-即使当使用水凝胶聚合所需的最小量的自由基引发剂和暴露时间时。此外，我们发现当包囊于由与peg-二硫醇交联的降冰片烯(例如，降冰片-2-烯-5-基)官能化的四臂peg大分子所形成的硫醇烯水凝胶中时，这些相同的蛋白质未被修饰。两个实验的主要区别在于，在第二种情况下，可使用仅在第一种情况下使用的引发剂量的十分之一(1/10)使水凝胶完全聚合。这表明这些肽中的半胱氨酸硫醇比peg硫醇具有更低的反应性。
令人惊讶的是，我们发现反应性硫醇对于自由基介导的硫醇-烯反应的反应性可通过在半胱氨酸的硫醇基团与肽骨架之间插入一个或多个另外的碳原子来增强。例如，当与半胱氨酸相比时，在硫醇和肽骨架之间具有另外的碳原子的高半胱氨酸的反应性与半胱氨酸相比显著增强。应当理解，类似地增加硫醇基团和肽骨架之间的距离的其它化合物也将增强硫醇基团的活性。例如，使用2-氨基-5-硫基戊酸代替半胱氨酸，在硫醇和肽骨架之间添加另外两个碳原子。
我们还评价了游离半胱氨酸参与硫醇-烯反应的能力。令人惊讶的是，游离半胱氨酸相对于其它小分子硫醇诸如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、高半胱氨酸、半胱胺和3-巯基丙酸而言显示出显著降低的活性。
与本领域当前教导相反的这些观察结果一起表明，为了使用自由基介导的硫醇-烯化学以经由肽内的半胱氨酸残基而使肽与含有烯的部分的肽反应所需的条件导致产生高浓度的破坏性自由基，其可改变或以其它方式损伤反应混合物中包含的生物活性组分。因此，在这些条件下，不能维持自由基介导的硫醇-烯化学的经常引用的性质，即生物正交性(bioorthogonality)。
使用相对于半胱氨酸硫醇具有增强的反应性的硫醇基团，反应需要较低浓度的自由基引发剂，反应混合物中存在较低浓度的损伤性自由基，和/或需要更短的反应时间来完成。这一发现的结果是使用这些增强的硫醇能够实现硫醇-烯反应的生物正交性所需的性质。
高半胱氨酸在自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔反应中的用途先前已在非常有限的范围内进行了描述。在yan等人(2013)中，通过使用丙-2-炔-1-基-(2-氧代四氢噻吩-3-基)氨基甲酸酯将高半胱氨酸引入非肽聚合物。在非水环境中，丙-2-炔-1-基(2-氧代四氢噻吩-3-基)氨基甲酸酯的氨解导致形成含炔取代的高半胱氨酸残基，然后其可通过与该所得化合物的另一分子的炔部分或所生成的聚合物的烯烃部分在不存在自由基化学引发剂的情况下的反应而聚合。在该论文使用的条件下，该反应在阳光照射累积15小时后进行完成。在espeel等人(2011)中，通过使用n-(烯丙基氧基羰基)高半胱氨酸硫代内酯将高半胱氨酸引入非肽聚合物。在非水环境中，n-(烯丙基氧基羰基)高半胱氨酸硫代内酯的氨解导致含烯烃取代的高半胱氨酸残基的形成，然后其可通过与该所得化合物的另一分子的烯烃部分在不存在自由基化学引发剂的情况下的反应而聚合。在该论文使用的条件下，该反应在用uv光照射3小时后进行完成。yan等人和espeel等人描述的反应相对缓慢地进行，并在非水环境中使用小的单体进行。先前尚未描述过在硫醇-烯反应中使用高半胱氨酸以保持包囊于水性水凝胶中的生物活性组分的活性。
因此，在一个方面，本发明提供了用于连接多肽的方法，其中所述多肽包含肽骨架和一个或多个反应性硫醇基团，所述方法包括使多肽的反应性硫醇基团与包含一个或多个反应性烯基团的烯化合物在促进自由基介导的硫醇-烯反应的条件下反应。本发明还提供了用于连接多肽的方法，其中所述多肽包含肽骨架和一个或多个反应性硫醇基团，所述方法包括使多肽的反应性硫醇基团与包含一个或多个反应性炔基团的烯化合物在促进自由基介导的硫醇-炔反应的条件下反应。适用于本发明方法的反应性硫醇基团在适用于自由基硫醇-烯或硫醇-炔化学的条件下比半胱氨酸硫醇基团具有更高的反应性。在一些实施方案中，多肽的反应性硫醇基团具有自由基介导的硫醇-烯反应的反应性，其为半胱氨酸硫醇基团的反应性的至少2倍。在一些实施方案中，多肽的反应性硫醇基团具有自由基介导的硫醇-烯反应的反应性，其为半胱氨酸硫醇基团的反应性的至少3倍、至少5倍或至少10倍。两个硫醇基团的相对反应性是在相同反应条件下硫醇基团的反应的相对速率，例如通过硫醇基团的消耗速率测量(例如，使用ellman测定法)。在一些实施方案中，相对反应性意指在相同的反应条件下(例如在光化学引发的反应中使用相同浓度的硫醇、烯类和引发剂，并且使用相同的波长和光强度)，在使用多肽的反应性硫醇基团时的反应速率将等于使用半胱氨酸的反应速率除以指示值。
硫醇-烯反应可化学或光化学引发。在一些实施方案中，反应通过自由基引发剂启动。在一些情况下，反应可通过光(例如，紫外光或太阳光)而不用引发剂化合物启动。在优选的实施方案中，所述自由基引发剂可为光引发剂化合物。可使用任何合适的光引发剂，例如bowman等人使用的那些，例如美国专利7,288,608和wo2012/103445。在一些实施方案中，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(lap)或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸钠(nap)。在一些实施方案中，所述光引发剂为2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(例如，
硫醇-烯反应通常通过产生自由基的光引发剂的光解引发。优选地，选择使用的光的波长以匹配光引发剂的激发波长。因此，在一些实施方案中，通过使光引发剂暴露于具有与光引发剂的激发波长匹配的波长的光来引发硫醇-烯反应。在lap或nap的情况下，所述光的波长为大约372nm，其中360nm或380nm在可接受的范围内。在2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(例如，
为了获得最佳结果，通常建议选择最小光引发剂量和暴露时间，由此使得硫醇-烯反应达到(或几乎达到)期望的完成。在具体实施方案中，选择暴露时间，使得硫醇-烯或硫醇-炔反应达到小于100％完成，例如约98％、约95％、约90％、约80％或约70％完成。这防止了对反应混合物的其它组分的过度的自由基损伤。在本发明的一个实施方案中，通过流变学作为光强度、曝光时间和引发剂浓度的函数监测网状物形成。在另一实施方案中，通过使用elman测定法消耗游离硫醇来监测反应。除了流变学和硫醇消耗之外，本领域技术人员将清楚监测反应的其它方法。
因此，在一些实施方案中，使用硫醇-烯化学连接多肽的方法进一步包括控制光引发剂的量、光的强度和/或光引发剂暴露于光的时间。在某些情况下，允许反应进行到这样的点：硫醇-烯反应不是100％完成，但是基本上实现了某一目标，而不会对反应混合物的其它组分造成实质损害。例如，通常用相对高浓度的光引发剂进行光诱导聚合，以确保实现相当高速率的光聚合。在这种情况下，并非所有引发剂都需要将反应推动到100％完成。对于这种情况，100％完全硫醇-烯反应将完全耗尽硫醇-烯反应物，其提供保护作用，免受由引发剂光解产生的自由基从而导致对生物活性物质(cargo)的损害。对于这些情况，通过将硫醇-烯反应驱动到小于100％，可容易地找到反应完全性和物质完整性之间的合理妥协。对于一个特例，在某些条件下驱动硫醇-烯光聚合反应至仅90％会导致形成具有可预测的机械弹性性质的水凝胶，同时借助剩余的10％硫醇或烯类为包囊的生物活性物质提供足够保护。例如，在一个实施方案中，光引发剂为0.01wt.％lap或0.01wt.％nap，且反应混合物经受19mw/cm2380nm光10秒。在一些实施方案中，所述硫醇-烯反应达到大于(下限)约70％、80％、90％、95％或98％完成。在一些实施方案中，所述硫醇-烯反应达到小于(上限)约99.99％、99.9％、99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、90％或85％。即，所述硫醇-烯反应的期望完成可为其中下限小于上限的约70％至约99.99％的任意范围的完成。在一些实施方案中，所述硫醇-烯反应达约70％完成和约95％完成。
硫醇-烯或硫醇-炔反应可在任何合适的介质或溶剂中进行。然而，在涉及蛋白质和其它水溶性生物材料的反应中，水性介质可能是有利的。因此，在一些优选的实施方案中，使用自由基介导的硫醇-烯化学连接多肽的方法包括在水性环境或水性介质中使反应性硫醇基团与烯/炔化合物反应。应当理解，所述方法可产生包含聚合物基质的水凝胶，例如，当反应在水性溶剂存在下进行时。
通常，与气氛平衡的水溶液含有约200μm浓度的溶解氧，这是许多自由基介导反应的已知抑制剂。然而，自由基介导的硫醇-烯聚合迄今被认为对氧介导的抑制不敏感。报道的自由基介导的硫醇-烯反应对氧抑制的不敏感性已经在许多出版物中有描述(参见，例如，mccall,j.d.,andanseth、k.s.,2012.,aswellashoyle,c.e.,lee,t.y.和roper,t.2004)。然而，意外地发现，在与快速生物聚合物形成相关的降冰片烯和硫醇的浓度下，例如，反应性硫醇基团和反应性烯基团浓度各自为1mm至50mm，氧存在抑制作用，并且这可通过从反应物溶液中除去氧而绕开。因此，在一个方面，提供了一种通过减少反应与溶解氧的接触来增加自由基介导的硫醇-烯反应的反应速率的方法(例如，通过在降低的氧环境中进行反应)。应当理解，在降低的氧环境中进行自由基介导的硫醇-烯反应增加了反应的速率，因此可减少任何硫醇化合物/烯化合物对的不期望的副反应，包括半胱氨酸/降冰片烯对和高半胱氨酸/降冰片烯对。在一个方面，本发明提供了一种通过在降低的氧环境下进行反应来还原自由基介导的硫醇-烯反应的自由基介导的副产物的方法，诸如通过使硫醇化合物和烯化合物在脱气溶液中在适于自由基介导硫醇-烯反应的条件下反应。在一些实施方案中，所述硫醇混合物包含反应性硫醇基团，其中所述反应性硫醇基团为半胱氨酸残基的硫醇基团。在一些实施方案中，所述硫醇混合物包含反应性硫醇基团，其中所述反应性硫醇基团为高半胱氨酸的硫醇基团。在一些实施方案中，所述烯化合物包含一个或多个降冰片-2-烯-5-基部分。在具体方面，硫醇-烯反应在脱气溶液中进行，其中反应性硫醇基团的浓度为1mm至50mm且反应性烯基团的浓度等于或相当接近反应性硫醇基团的浓度。在一些变型中，所述反应性硫醇基团和反应性烯基团浓度各自为1mm至50mm。在一些变型中，所述反应性硫醇基团和反应性烯基团浓度各自为1mm至40mm。在一些变型中，所述反应性硫醇基团和反应性烯基团浓度各自为1mm至30mm。在一些变型中，所述反应性硫醇基团和反应性烯基团浓度各自为1mm至20mm。在一些变型中，所述反应性硫醇基团和反应性烯基团浓度各自为1mm至10mm。在一些变型中，所述反应性硫醇基团和反应性烯基团浓度各自为10mm至50mm。在一些变型中，所述反应性硫醇基团和反应性烯基团浓度各自为20mm至50mm。在一些变型中，所述反应性硫醇基团和反应性烯基团浓度各自为30mm至50mm。在一些变型中，所述反应性硫醇基团和反应性烯基团浓度各自为40mm至50mm。
硫醇-烯或硫醇-炔反应可在降低的氧环境中进行，诸如在不存在氧的情况下或在与硫醇-烯反应(其中没有努力减少使反应暴露于氧的量)相比降低量的氧存在下。例如，反应溶液可在通过本领域通常应用的方法引发反应之前脱气。在一些实施方案中，使用自由基介导的硫醇-烯化学连接多肽的方法包括从反应介质中除去氧。
在一些实施方案中，所述烯化合物为非生物可降解的烯化合物。在一些实施方案中，所述硫醇化合物为非生物相容性硫醇化合物。在一些实施方案中，所述烯化合物为非可降解的烯化合物。在一些实施方案中，所述硫醇化合物为非可降解的硫醇化合物。
含有反应性硫醇的多肽
适用于本发明方法的多肽的反应性硫醇基团对于自由基介导的硫醇-烯反应比半胱氨酸硫醇基团更具反应性，所述反应性硫醇基团通过一个碳原子与肽骨架隔开。在一些实施方案中，所述多肽的反应性硫醇基团通过两个或更多个碳原子与所述多肽的肽骨架隔开。在一些实施方案中，所述多肽含有一个或多个反应性硫醇基团。在一些实施方案中，多肽经修饰以引入一个或多个适于本发明方法的反应性硫醇基团。在一些实施方案中，多肽经修饰以用稀有氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物代替半胱氨酸残基。可掺入多肽的反应性硫醇基团的非限制性实例如下表1所示。表1中的侧链经修饰的氨基酸残基举例说明了适合于掺入或存在于多肽中并且在自由基介导的硫醇-烯反应中与反应性烯基团反应的氨基酸残基。这种侧链经修饰的氨基酸残基具有期望的性质，其与半胱氨酸相比在多肽骨架和硫醇基团之间具有延伸的烷二基部分(其可包括一个或多个另外的接头，诸如，作为非限制性实例，酰胺和/或peg部分)。不受任何理论的束缚，与半胱氨酸硫醇形成的自由基相比，延伸的烷二基部分被认为使硫醇基团不稳定，导致与使用半胱氨酸硫醇相比，自由基介导的硫醇-烯反应速率增加。增加的反应速率是有益的并且具有显著意义，诸如自由基介导的副反应的量减少或程度减少，对组织或其它生物制品的损伤减少，增强对需要修饰的肽的选择性(通过降低内源性半胱氨酸的修饰的发生率)和患者环境(setting)中更快速的治疗方案(例如，将完成反应的时间减少约5-50倍，诸如从基于半胱氨酸的硫醇的90秒至用侧链经修饰氨基酸的2-10秒)。表1的骨架经修饰的氨基酸残基(例如，β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基、氨基酸类似物和氨基酸模拟物)举例说明了适于掺入多肽的氨基酸残基，并且其硫醇部分可与反应性烯基团在自由基介导的硫醇-烯反应中进行反应。与未修饰的多肽骨架相比，这种骨架经修饰的氨基酸残基也被认为可用于增加硫醇-烯反应的总反应速率，并且预期其表现出与侧链经修饰的氨基酸残基相同的有益性质，诸如副反应减少、选择性更高和快速治疗方案。
表1：示例性反应性硫醇基团
如下文实施例部分进一步说明，有许多用于将硫醇掺入肽中使得肽骨架和硫醇之间存在一个或多个碳原子的方法。这些方法包括但不限于：1)使用经保护的氨基酸进行肽合成，其中有两个或多个使硫醇与2位碳原子(其为肽骨架)隔开的碳原子。这些经保护的氨基酸的实例包括但不限于经fmoc保护的构建嵌段(s)-2-(fmoc-氨基)-4-三苯甲基硫烷基-丁酸(bachem)或(s)-fmoc-2-氨基-5-(三苯甲基硫基)-戊酸(多肽)；2)使用硫醇化剂修饰肽。这种硫醇化剂的实例包括但不限于n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫基丙酸酯(satp)、n-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯和nhs-peg-sh；3)通过甲基转移酶反应将甲硫氨酸转化为高半胱氨酸。
在一些实施方案中，多肽的反应性硫醇基为多肽的高半胱氨酸残基的硫醇基团或多肽的2-氨基-5-巯基戊酸残基的硫醇基团。含有高半胱氨酸或2-氨基-5-巯基戊酸残基的多肽可使用本领域已知的肽合成方法制备，诸如本文所述的方法。图2说明了使用nhs-peg-sh作为硫醇化剂将反应性硫醇基团掺入赖氨酸残基的侧链。
在一些实施方案中，多肽的反应性硫醇基团为通过接头附接至氨基的侧链氨基的硫醇基团(例如，赖氨酸残基的侧链氨基或n-末端氨基)。多肽的反应性硫醇基团可使用硫醇化剂附接至赖氨酸的侧链氨基。硫醇化剂的实例包括，但不限于，n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫基丙酸酯(satp)、n-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯和nhs-peg-sh。
用于连接多肽的方法的一些实施方案进一步包括在使反应性硫醇基团经受促进自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔反应的条件之前，产生包含一个或多个反应性硫醇基团的多肽。在一些实施方案中，所述方法包括使用经保护的含硫醇的氨基酸的多肽合成，其中所述硫醇基团通过两个或更多个碳原子与邻近羧基的碳原子隔开，例如不限于，经保护的高半胱氨酸(例如，(s)-2-(fmoc-氨基)-4-三苯甲基硫烷基-丁酸)或2-氨基-5-巯基戊酸(例如，(s)-fmoc-2-氨基-5-(三苯甲基硫基)-戊酸)。在一些实施方案中，所述方法包括使用硫醇化剂修饰多肽，例如，使肽中的氨基与硫醇化剂反应，诸如n-琥珀酰亚胺基-3-(乙酰基硫基)丙酸酯(satp)、n-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯或nhs-peg-sh。在一些实施方案中，所述方法包括将多肽中的甲硫氨酸残基化学或酶促转化成高半胱氨酸残基，例如通过甲基转移酶反应。
在一些实施方案中，多肽的反应性硫醇基团是附接至非天然氨基酸的硫醇基团，诸如经硫醇取代的β氨基酸、经硫醇取代的γ氨基酸、经硫醇取代的δ氨基酸或经硫醇取代的ε氨基酸。包括经硫醇取代的β氨基酸、经硫醇取代的γ氨基酸、经硫醇取代的δ氨基酸或经硫醇取代的ε氨基酸残基的多肽可使用本领域已知的肽合成方法诸如本文所述的方法制备。
在一些实施方案中，多肽的反应性硫醇基为附接至氨基酸类似物或氨基酸模拟物残基的硫醇基团。在一些实施方案中，氨基酸类似物或氨基酸模拟物残基衍生自天然氨基酸、稀有氨基酸或非天然氨基酸，其中羰基官能团被亚甲基部分或较长碳链代替，任选散布有一个或多个选自氧、硫和氮的杂原子。在一些实施方案中，氨基酸类似物或氨基酸模拟物残基衍生自天然氨基酸、稀有氨基酸或非天然氨基酸，其中氨基官能团被亚甲基部分或较长碳链代替，任选散布有一个或多个选自氧、硫和氮的杂原子。
在前述实施方案的一些变型中，所述硫醇化合物为非生物相容性硫醇化合物。在前述实施方案的其它变型中，所述硫醇化合物为非生物相容性硫醇化合物。在前述实施方案的一些变型中，所述硫醇化合物为可降解的硫醇化合物。在前述实施方案的其它变型中，所述硫醇化合物为非可降解的硫醇化合物。
用于连接多肽的本发明的方法可用于将蛋白质或肽连接至第二部分，例如，从而携带生物活性组分(诸如本文所述的那些)，或为多肽提供另外的性质，诸如延长体内循环半衰期的聚合物(例如peg)，亲和标签诸如生物素、抗体、适体(或其它捕获部分或标签)以提供捕获功能，标记物(诸如荧光标记、发色团或荧光团)，糖或其它碳水化合物，核酸，核糖核蛋白，另一多肽，脂质或另一疏水部分，纳米颗粒，纳米管或高级大分子集合体。
可使用本发明的方法修饰多种多肽。在某些实施方案中，所述多肽可选自肽和蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗性蛋白、酶和结构蛋白。生长因子可包括am、ang、bmp、bdnf、gdnf、gcsf、gm-csf、gdf、hgf、hdgf、kgf、msf、ngf、tpo、fbs、epo、igf、egf、fgf、tgf、pdgf和白介素，包括其衍生物和家族成员。结构蛋白包括纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白。
本发明的方法还可用于将可降解的肽掺入基于硫醇-烯或硫醇-炔的水凝胶聚合物。在一些实施方案中，所述多肽进一步包含已知对蛋白酶敏感的肽序列。在另一实施方案中，所述多肽为侧面有活性硫醇的纤溶酶可降解肽。在另一实施方案中，两种纤溶酶可降解序列包含在所述肽内。在一个具体的实施方案中，所述多肽为侧面有高半胱氨酸的基质金属蛋白酶(mmp)可降解肽，以产生被细胞分泌的mmp降解的水凝胶网状物。
在一些实施方案中，所述反应使用多肽(包括肽和蛋白质)，其包含一个通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开的反应性硫醇基团。在一些实施方案中，所述多肽(包括肽和蛋白质)包含两个或更多个反应性硫醇基团，各自通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开。在一些实施方案中，所述多肽(包括肽和蛋白质)包含两个反应性硫醇基团，各自通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开。在一些实施方案中，所述多肽(包括肽和蛋白质)包含三个或四个或更多个反应性硫醇基团，各自通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开。在一些实施方案中，所述反应性硫醇基团为高半胱氨酸残基的硫醇基团、2-氨基-5-巯基戊酸残基的硫醇基团或经由接头(例如，peg接头)附接至赖氨酸残基的侧链氨基的硫醇基团。
含烯/炔的化合物
可用于本发明的方法的烯化合物或烯化合物可为适用于自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔化学的任何烯化合物或炔化合物，诸如含有烯或炔基团的在自由基硫醇-烯或硫醇-炔条件下具有反应性的化合物(“反应性烯基团”或“反应性基团”)。烯化合物(或含烯的烃化合物)包含反应性烯基和构成携带反应性烯基团的骨架的携带烯的部分。在hoyle等人(2004)“thiol-enes:chemistryofthepastwithpromiseforthefuture”中可找到适当的烯化合物的列表，包括其相对反应速率的指示，将其通过引用并入本文。炔化合物(或含炔的化合物)包含反应性基团和构成携带反应性基团的骨架的携带炔的部分。
在前述实施方案的一些变型中，所述烯化合物为非生物可降解的烯化合物。在前述实施方案的其它变型中，所述烯化合物为非生物可降解的烯化合物。在前述实施方案的一些变型中，所述烯化合物为可降解的烯化合物。在前述实施方案的其它变型中，所述硫醇化合物为非可降解的烯化合物。
在一些实施方案中，所述烯化合物含有任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在优选的实施方案中，所述烯化合物包含降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，所述烯化合物的反应性烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，所述反应性烯基团为降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，所述烯化合物包含一个或多个降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，所述烯属不饱和基团可进一步取代有一个或多个合适的取代基，诸如作为非限制性实例，卤素、烷基、烷氧基或氧代。所述炔化合物含有一个或多个炔基团，诸如乙炔基、炔丙基、丙炔酸酯、环炔等。
表2中举例说明了反应性烯基团的非限制性实例及其相应的硫醇-烯反应产物，其中虚线表示附接的点。
表2：示例性反应性烯基团和相应的硫醇-烯反应产物
如本领域技术人员所理解，反应性硫醇基团的硫原子可连接到反应性烯基团的碳-碳双键的任一末端。同样如本领域技术人员所理解，在反应性烯基团的平面碳-碳双键的任一面上都可发生硫醇-烯反应。结果是，硫醇-烯反应的产物可表现出位置异构性(对碳-碳双键的不同碳原子的进攻)以及立体异构性(对碳-碳双键的不同面的进攻)。应当理解，本发明涵盖所有可能的产品。如本领域技术人员所进一步理解，包含多于一个反应性烯基团并具有相同反应性烯基团的烯化合物可产生其中各个反应性烯基团可能已经进行不同反应的产物。对于非限制性实例，peg二降冰片烯(具有两个降冰片-2-烯-5-基反应性基团的烯化合物)可产生产物，其中一个降冰片烯部分(例如，降冰片-2-烯-5-基)产生硫醚键，其中硫为5-外型(exo)，且另一个降冰片烯部分(例如，降冰片-2-烯-5-基)产生硫醚键，其中硫为6-内型(endo)。应当理解，这些变型也包括在本发明中。
通过本发明的自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔反应，烯/炔化合物的烯/炔部分共价连接至含反应性硫醇的多肽。可根据寻求赋予连接的特定功能性质来选择携带烯/炔的部分，作为非限制性实例，所述特定功能性质包括引入荧光团或发色团、引入亲和标记物、引入酶活性、引入某些化学部分或多个部分、引入亲水性、疏水性或两亲性聚合物尾部，以便控制溶解度、药物动力学、药效学或与生物膜或固体表面的相互作用，产生含蛋白质的聚合物或用于进一步聚合的远螯单体(telechelicmonomer)等。携带烯的部分可包括以下(非限制性实例)的适当衍生物：聚(乳酸)(pla)、聚乙交酯(pga)、pla和pga的共聚物(plga)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙二醇)(peg)、聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物(泊洛沙姆、美罗沙波)、泊洛沙胺、聚酐、聚原酸酯、聚(羟基酸)、聚二噁烷酮、聚碳酸酯、聚氨基碳酸酯、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚氨酯、羧甲基纤维素、羟基烷基化纤维素诸如羟乙基纤维素和甲基羟基丙基纤维素，及天然聚合物诸如多肽、核酸、多糖或碳水化合物诸如聚蔗糖、透明质酸、葡聚糖及其类似衍生物，硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、肝素或藻酸盐，及蛋白质诸如明胶、胶原蛋白、白蛋白或卵白蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白，荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白或其类似物、荧光和非荧光染料、荧光猝灭剂，高亲和力标签，诸如多肽标签(his-标记物、flag-标签等)，抗体及其片段、核酸适体、寡核苷酸和多核苷酸，高级大分子集合体诸如核糖核蛋白、病毒衣壳等。所述携带烯的部分还可包含含有任何已知修饰的核酸(“经修饰的核酸”)，诸如掺入经修饰的碱基的核酸(例如在碱基上的一个或多个位置的修饰，包括2'和5位)和锁核酸。
在一些实施方案中，所述烯/炔化合物包含选自以下的携带烯/炔的部分：聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；经修饰的核酸、锁核酸、多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素、藻酸盐；及其组合。
在一些实施方案中，所述携带烯/炔的部分可包含生物活性组分。在一些实施方案中，所述携带烯/炔的部分可包含第二部分，当其与多肽连接时，可为多肽提供另外的性质，诸如延长体内循环半衰期的聚合物(诸如peg)、提供捕获功能的生物素(或其它捕获部分或标签)、标记物(诸如荧光标记、发色团或荧光团)、糖或其它碳水化合物、核酸、另一种多肽。在一些实施方案中，所述携带烯/炔的部分包含聚合物、捕获部分、标记物、碳水化合物、核酸或第二多肽。所述烯/炔官能团可通过本领域已知的方法引入本文详述的烯/炔部分和其它合适的化合物。
生物活性组分可为多种材料或化合物，包括但不限于组织、细胞、蛋白质、肽、毒素、小分子药物、核酸、包囊的核酸(例如包囊于脂质纳米颗粒中)、脂质、碳水化合物或农业化合物。细胞类型包括上皮细胞和间充质来源的细胞，诸如干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、成骨细胞、软骨细胞和内皮细胞。对于非限制性实例，蛋白质的类型包括粘附肽(诸如rgd粘附序列)、生长因子、细胞因子、白介素、激素、抗激素、信号传导化合物、酶、血清蛋白、白蛋白、巨球蛋白、球蛋白、凝集素(agglutinin)、凝集素(lectin)、细胞外基质蛋白，抗体和抗原。其它蛋白质包括肽和蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗蛋白、酶和结构蛋白。生长因子可包括am、ang、bmp、bdnf、gdnf、gcsf、gm-csf、gdf、hgf、hdgf、kgf、msf、ngf、tpo、fbs、epo、igf、egf、fgf、tgf、pdgf和白介素，包括其衍生物和家族成员。结构蛋白包括纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、层粘连蛋白和胶原。小分子药物的类型包括，但不限于，镇痛药、解热药、非甾体抗炎药无、抗过敏药、抗菌药物、抗贫血药物、细胞毒素药物、抗高血压药物、皮肤病药物、心理治疗药物、维生素、矿物质、减食欲药、膳食营养(dietetics)、抗肥胖药物、碳水化合物代谢药物、蛋白质代谢药物、甲状腺药物、抗甲状腺药物和辅酶。农业化合物的种类包括，但不限于，杀真菌剂、除草剂、肥料、农药、碳水化合物、核酸、有机分子和无机生物活性分子。
如本领域技术人员所理解，存在许多方法可将烯/炔基团添加到本文所述的携带烯/炔的部分中。这些方法可导致在携带烯/炔的部分和烯/炔官能团之间的接头基团。在一个实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接向peg中添加一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺键向peg中添加一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)。下文提供非限制性实例并说明降冰片烯修饰的peg的形成：
在一些实施方案中，所述方法使用包含一个反应性烯基团的烯化合物。在一些实施方案中，所述烯化合物包含两个或更多个反应性烯基团。在一些实施方案中，所述烯化合物包含两个反应性烯基团。在一些实施方案中，所述烯化合物包含三个或四个或更多个反应性烯基团。
多肽修饰/衍生化
在一些实施方案中，通过经由自由基介导的硫醇-烯反应使另一部分(所述第二部分)附接至多肽来修饰多肽。在一些实施方案中，所述肽具有一个或多个反应性硫醇基团。所述反应性硫醇基团可通过两个或更多个碳原子与肽骨架隔开。所述第二部分含有一个或多个反应性烯基团。在优选的实施方案中，所述肽仅具有一个这样的反应性硫醇基团且所述第二部分仅具有一个反应性烯基团(图4d)。
在使用自由基介导的硫醇-烯化学连接多肽的方法的一些实施方案中，所述多肽包含一个或多个本文所述的反应性硫醇基团且所述烯化合物包含一个本文所述的反应性烯基团。在这种情况下，一个或多个本文所述的携带烯的部分可经由自多肽的一个或多个反应性硫醇基团衍生的硫醚连接至多肽。
在某些实施方案中，所述多肽可选自以下肽和蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗蛋白、酶和结构蛋白。生长因子可包括am、ang、bmp、bdnf、gdnf、gcsf、gm-csf、gdf、hgf、hdgf、kgf、msf、ngf、tpo、fbs、epo、igf、egf、fgf、tgf、pdgf和白介素，包括其衍生物和家族成员。结构蛋白包括纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、层粘连蛋白和胶原。
在一些实施方案中，所述烯化合物包含生物活性组分，例如，药物、毒素或农药。在一些实施方案中，所述烯化合物包括聚合物(例如，聚乙二醇)、捕获部分或标签(例如，生物素)、标记物(例如，荧光标记、发色团或荧光团)、糖或碳水化合物、核酸或第二多肽。
在所述方法的一些实施方案中，所述多肽包含一个本文所述的反应性硫醇基团且所述烯化合物包含一个本文所述的反应性烯基团。在这种情况下，多肽经由通过硫醇-烯反应形成的硫醚连接键连接至烯化合物的携带烯的部分(与其轭合)。
所述方法可用于使蛋白质或肽连接至第二部分，例如，携带生物活性组分(诸如本文所述的生物组分)，或为多肽提供另外的性质，诸如聚合物延长体内循环半衰期(诸如peg)、生物素(或其他捕获部分或标签)，以提供捕获功能，标记物(诸如荧光标记、发色团或荧光团)、糖或其它碳水化合物、核酸、另一种多肽。一个实施方案是所述方法用于添加单体，由此使得其将改变肽的adme性质。在另一实施方案中，添加官能团。
该方法的一个重要优点是其可用于在一个或多个半胱氨酸残基存在下特异性衍生蛋白质。也就是说，通过两个或更多个碳原子与肽骨架隔开的硫醇的活性增加，硫醇-烯反应将主要在蛋白质内相对于其它半胱氨酸硫醇基团的活性硫醇处发生。
本发明还提供了通过本文所述的方法产生的连接多肽(诸如与生物活性组分、聚合物、捕获部分、标记物、碳水化合物、核酸或第二多肽连接的多肽)。
在使用自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔化学连接多肽的方法的一些实施方案中，所述多肽包含一个本文所述的反应性硫醇基团且所述烯/炔化合物包含一个或多个本文所述的反应性烯/炔基团。在这种情况下，一个或多个本文所述的多肽可连接至本文所述的携带烯/炔的部分经由自多肽的反应性硫醇基团衍生的硫醚。
在这些实施方案的一些中，所述烯/炔化合物可包含任意的本文所述的携带烯/炔的部分。在一些实施方案中，所述烯化合物可包含选自以下的聚合物部分：聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
在一些实施方案中，所述烯化合物含有任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在优选的实施方案中，所述烯化合物包含降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，所述烯化合物的反应性烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，所述烯化合物包含一个或多个降冰片烯(例如，降冰片-2-烯-5-基)。如本领域技术人员所理解，所述烯属不饱和基团可进一步取代有一个或多个合适的取代基，诸如作为非限制性实例，卤素、烷基、烷氧基或氧代。所述炔化合物含有一个或多个炔基团诸如乙炔基、炔丙基、丙炔酸、环炔等。
在一些实施方案中，多肽通过使经由自由基介导的硫醇-烯反应的肽附接至经由自由基介导的硫醇-烯反应形成的聚合物基质进行修饰(图4c)。在某些实施方案中，所述聚合物基质经由第二硫醇化合物和含烯化合物之间的聚合物介导的硫醇-烯反应形成。在一些实施方案中，所述聚合物基质为生物相容性的。在其它实施方案中，所述聚合物基质为非生物相容性的。在一些实施方案中，所述聚合物基质为可降解的。在其它实施方案中，所述聚合物基质为非可降解的。
在使用自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔化学连接多肽的方法的一些实施方案中，所述多肽包含一个本文所述的反应性硫醇基团且所述烯/炔化合物包含两个或更多个本文所述的反应性烯/炔基团。因此，本发明提供一种用于使多肽连接(附接)至基于硫醇-烯的聚合物(例如，生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物)的方法，其中所述多肽包含肽骨架和一个反应性硫醇基团(例如，通过两个或更多个碳原子与多肽骨架隔开的反应性硫醇基团)，所述方法包括使多肽的反应性硫醇基团和第二硫醇化合物与包含两个或更多个反应性烯基团的烯化合物在促进自由基介导的硫醇-烯反应的条件下(例如，在使用自由基引发剂的条件下和/或在水性环境中)反应，其中所述第二硫醇化合物包含两个或更多个反应性硫醇基团。
在这些实施方案的一些中，所述肽可选自以下肽和蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗蛋白、酶和结构蛋白。生长因子可包括am、ang、bmp、bdnf、gdnf、gcsf、gm-csf、gdf、hgf、hdgf、kgf、msf、ngf、tpo、fbs、epo、igf、egf、fgf、tgf、pdgf和白介素，包括其衍生物和家族成员。结构蛋白包括纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、层粘连蛋白和胶原。
在这些实施方案的一些中，所述第二硫醇化合物包含j个反应性硫醇基团，所述烯化合物包含k个反应性烯基团，其中j和k独立地为≥2的整数且j+k≥5。
在某些实施方案中，所述第二硫醇化合物包含选自以下的聚合物部分：聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。在优选的实施方案中，所述第二硫醇化合物包含选自以下的聚合物部分：聚(乳酸)(pla)、聚(乙烯醇)(pva)和聚(乙二醇)(peg)及其组合。
一些应用要求所附接的基于硫醇的聚合物具有可降解的聚合物基质，用于控制所附接的多肽的释放。其它应用可能要求非可降解的聚合物基质用于保持所附接的多肽或经由构建在所附接的多肽中的替代机制释放所附接的多肽。
因此，在一些实施方案中，所述第二硫醇化合物包含肽骨架、可降解的肽和两个或更多个反应性硫醇基团，其各自通过两个或更多个碳原子与肽骨架隔开。在一些实施方案中，所述第二硫醇化合物包含已知对蛋白酶敏感的肽序列。在具体的实施方案中，所述第二硫醇化合物包含已知对蛋白酶敏感的肽序列且两侧为两个高半胱氨酸残基诸如侧面有二高半胱氨酸的金属蛋白酶(mmp)可降解肽，以建立通过细胞分泌的mmp降解的水凝胶网状物。在另一实施方案中，所述多肽为侧面有活性硫醇的纤溶酶可降解肽。在另一实施方案中，两种纤溶酶可降解序列包含在所述肽内。
在其它实施方案中，所述第二硫醇化合物包含聚乙二醇和附接至聚乙二醇的两个末端硫醇基团。在一些实施方案中，所述多肽包含一个反应性硫醇基团，其中所述反应性硫醇基团通过包含至少两个碳原子和可降解部分的接头与肽骨架隔开，因此可未经降解所述聚合物基质而释放所附接的多肽。在这些实施方案的一些中，所述方法进一步包括产生包含通过包含可降解部分的接头与肽骨架隔开的反应性硫醇基团的多肽。
在某些实施方案中，所述烯化合物包含选自以下的聚合物部分：聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。在优选的实施方案中，所述烯化合物包含选自以下的聚合物部分：多肽、聚(乳酸)(pla)、聚(乙烯醇)(pva)和聚(乙二醇)(peg)及其组合。
在一些实施方案中，所述烯化合物含有任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在优选的实施方案中，所述烯化合物包含降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，所述烯化合物的反应性烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，所述反应性烯基团为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，所述烯属不饱和基团可进一步取代有一个或多个合适的取代基，诸如作为非限制性实例，卤素、烷基、烷氧基或氧代。
本发明进一步提供了通过本文所述的方法产生的包含一个或多个连接的多肽的化合物(诸如包含连接至携带烯的部分或基于硫醇-烯的聚合物的多重多肽的化合物)。
交联
在使用自由基介导的硫醇-烯化学连接多肽的方法的一些实施方案中，所述多肽包含两个本文所述的反应性硫醇基团且所述烯化合物包含两个本文所述的反应性烯基团。在这种情况下，形成直链聚合物，其具有包含通过从自由基介导的硫醇-烯反应衍生的硫醚连接键连接至携带烯的部分的多肽的重复单元。
在使用自由基介导的硫醇-烯或硫醇-炔化学连接多肽的方法的一些实施方案中，所述多肽包含两个或更多个本文所述的反应性硫醇基团且所述烯/炔化合物包含两个或更多个本文所述的反应性烯/炔基团。在这种情况下，一个或多个本文所述的多肽可连接至本文所述的携带烯/炔的部分经由自多肽的反应性硫醇基团衍生的硫醚.
在某些实施方案中，所述方法使用包含n个反应性硫醇基团的多肽，以及包含m个反应性烯基团的烯化合物，其中n和m独立地为≥2的整数且n+m≥5。所述多肽经由反应性硫醇基团与携带烯的部分进行交联，以产生基于硫醇-烯的聚合物基质。
所述烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在优选的实施方案中，所述烯基团为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，所述烯属不饱和基团可进一步取代有一个或多个合适的取代基，诸如作为非限制性实例，卤素、烷基、烷氧基或氧代。
所述炔化合物可含有一个或多个炔基团诸如乙炔基、炔丙基、丙炔酸、环炔等。
在一些实施方案中，所述烯化合物可为任意的本文所述的含烯化合物。在一些实施方案中，所述烯化合物为烯改性的生物相容性单体，且所述硫醇-烯反应提供生物相容性交联的聚合物基质。
如本领域技术人员所理解，有多种将烯/炔基团添加至本文所述的携带烯/炔的部分的方式。这方法可导致所述携带烯/炔的部分与所述烯/炔官能团之间的接头基团。在一个实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯(降冰片-2-烯-5-基)部分添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(例如，降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。
在一些实施方案中，所述炔化合物可为任意的本文所述的含炔化合物。在一些实施方案中，所述炔为一种炔修饰的生物相容性单体，且硫醇-炔和随后的硫醇-烯反应提供生物相容性交联聚合材料。
在一些实施方案中，所述多肽进一步包含已知对蛋白酶敏感的肽序列，例如，可通过基质金属蛋白酶降解的肽。在一些实施方案中，所述多肽包含已知对蛋白酶敏感的肽序列且两侧为两个高半胱氨酸残基诸如侧面有二高半胱氨酸的金属蛋白酶(mmp)可降解肽。使用这种多肽产生的水凝胶网状物可被细胞分泌的mmp降解。这种多肽的一个具体实例是"hcmmpa"，一种二高半胱氨酸类似物mmpa(氨基酸序列kcgpqgiagqck)，其具有与mmpa相同的序列，但用高半胱氨酸代替每个半胱氨酸残基。在另一实施方案中，所述多肽为侧面有活性硫醇的纤溶酶可降解肽。在另一实施方案中，两种纤溶酶可降解序列包含在所述肽内。
在一些实施方案中，所述烯化合物为烯改性的生物相容性单体且所述多肽包含已知对蛋白酶敏感的肽序列且两侧为两个高半胱氨酸残基(例如，侧面有二高半胱氨酸的金属蛋白酶(mmp)可降解肽)。在这种情况下，所述硫醇-烯反应提供生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物(例如，可通过mmp降解)。
在一些实施方案中，使用含炔化合物(或炔化合物)代替在交联反应中使用的烯化合物或除在交联反应中使用的烯化合物之外使用含炔化合物(或炔化合物)。主要的硫醇-炔加合物可经受与反应性硫醇的进一步硫醇-烯醇反应，从而提供进一步的交联。
本发明还提供了通过本文所述的方法产生的交联多肽(自然交联的基于硫醇-烯的聚合物)。
交联的可降解水凝胶聚合物
在一个方面，使用含硫醇的多肽交联剂来交联烯化合物以产生生物相容性聚合物(例如，如图3a或图4a所示)。合成或以其它方式修饰多肽以含有两(2)个或更多个反应性硫醇基团。所述反应性硫醇基团可通过两(2)个或更多个碳原子与多肽骨架隔开。在具体的实施方案中，将两(2)个或更多个高半胱氨酸残基掺入多肽中以提供两(2)个或更多个硫醇。
在一些实施方案中，本发明提供用于产生生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的方法，包括使反应性硫醇化合物与自由基引发剂和反应性烯化合物反应，其中所述反应性硫醇化合物包含肽骨架、可降解的肽和两个或更多个反应性硫醇基团，其各自通过两个或更多个碳原子与肽骨架隔开；且所述反应性烯化合物是包含两个或更多个反应性烯基团的烯改性的生物相容性单体。
在某些实施方案中，所述多肽包含n个反应性硫醇基团，所述烯化合物包含m个反应性烯基团，其中n和m独立地为≥2的整数且n+m≥5。
在一些实施方案中，所述多肽的反应性硫醇基团通过两个或更多个碳原子与所述多肽的肽骨架隔开。在一些实施方案中，所述反应性硫醇化合物的反应性硫醇基团独立选自多肽的高半胱氨酸残基的硫醇基团、多肽的2-氨基-5-巯基戊酸残基的硫醇基团和经由接头附接至赖氨酸残基的侧链氨基的硫醇基团。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过本文所述的产生诸如多肽的方法/过程通过将反应性硫醇基团引入多肽产生多肽，例如，通过使用具有期望硫醇基团的氨基酸的肽合成，或者通过经由赖氨酸残基的氨基将反应性硫醇基附接至多肽。可使用硫醇化剂将多肽的反应性硫醇基团附接至赖氨酸的侧链氨基。硫醇化剂的实例包括，但不限于，n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫基丙酸酯(satp)、n-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯和nhs-peg-sh。
在一些实施方案中，所述多肽可包含两个或更多个反应性硫醇基团各自通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开。
硫醇-烯反应可化学或光化学引发。在一些实施方案中，所述反应通过自由基引发剂启动，例如，光引发剂。在一些实施方案中，所述自由基引发剂为选自以下的光引发剂：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(lap)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸钠(nap)、2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(例如，
在一些实施方案中，所述烯化合物可为任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在优选的实施方案中，所述烯化合物包含降冰片-2-烯-5-基。
在一些实施方案中，所述烯化合物可选自任何烯修饰的生物相容性单体，包括但不限于，聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。在具体的实施方案中，所述烯化合物为烯修饰聚乙二醇(peg)。在优选的实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。
在一些实施方案中，所得生物聚合物形成三维网状物。在具体实施方案中，生物聚合物形成含有>98％、>95％、>90％、>80％或>70％水的水凝胶。
对于许多生物医学应用，期望将生物活性组分包囊或掺入所述聚合物基质中。
在许多情况下，期望简单地在聚合物基质中包括上述生物活性组分。在某些情况下，非共价包囊的组分可随聚合物基质降解而释放(图3c)。在其它情况下，当组分小于聚合物基质孔径时，组分将通过扩散出聚合物网状物而释放(图3b)。在一些实施方案中，生物活性组分可先包囊于纳米颗粒或微粒中，然后将其包囊于聚合物基质中。颗粒内生物活性组分的包囊方法是本领域技术人员已知的。
在其它情况下，期望将生物活性组分附接或掺入聚合物网状物中。也就是说，通过一个或多个共价键将组分附接或掺入聚合物基质中。例如，对于小于孔径的生物活性组分，可能期望将组分共价附接至网状物，由此使得仅当网状物降解时才会被释放(图3d)。在一些实施方案中，所述生物活性组分经由用于使网状物交联的相同肽附接至聚合物网状物。在其它实施方案中，生物活性组分通过可降解或非可降解的接头附接。在一些情况下，可降解的接头为水解或酶促可降解的接头。在具体实施方案中，酶促可降解的接头为蛋白酶可切割的肽。在上述每种情况下，如果生物活性组分为经由肽上的硫醇附接或掺入网状物(有或没有介于其间的接头)，则硫醇应通过两个或更多个碳原子与肽骨架隔开。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将生物活性组分添加至反应混合物中，其中所述生物活性组分与生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质相关联。在这些实施方案的一些中，所述生物活性组分包囊于聚合物基质，其中生物活性组分与所述聚合物基质之间没有共价键。在这些实施方案的一些中，所述生物活性组分共价结合至所述聚合物基质。取决于生物活性组分相对于聚合物基质的位置，认定所述生物活性组分掺入聚合物基质或附接至所述聚合物基质上。
所述生物活性组分可为任意可适用的生物材料，诸如本文所述的生物活性组分，例如，本文所述的组织、细胞、蛋白质、肽、小分子药物、核酸、包囊的核酸(例如包囊于脂质纳米颗粒)、脂质、碳水化合物或农业化合物。
所述生物活性组分可掺入生物活性多肽中，其可通过引入适用于本发明的硫醇-烯反应的反应性硫醇基团而被修饰。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括将活性硫醇基团引入生物活性多肽(例如，通过使用如本文所述的nhs-peg-sh试剂使硫醇基团连接至赖氨酸侧链胺)并使反应性硫醇基团与烯化合物的烯基团反应。
在一些实施方案中，所述生物活性组分为经由通过使生物活性多肽的活性硫醇基团与烯基团反应形成的硫醚连接键共价结合至聚合物基质的生物活性多肽，其中硫醚连接键的硫基通过两个或更多个碳原子与生物活性多肽的骨架隔开。
本发明进一步提供通过本文所述的方法产生的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物。在一些实施方案中，所述生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物进一步包含与生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质相关联的生物活性组分。在这些实施方案的一些中，所述生物活性组分包囊于所述聚合物基质。在这些实施方案的一些中，所述生物活性组分共价结合至(例如，掺入或附接至)所述聚合物基质。
组合物
使用本文所述的方法使多肽的反应性硫醇基团(例如通过至少两个碳原子与肽骨架隔开的硫醇基团)与含烯烃化合物(烯化合物)在促进自由基介导的硫醇-烯反应条件下(例如在自由基引发剂存在下)，产生化合物和组合物，其包含经由硫醚连接键共价键合至另一部分的多肽(诸如肽或蛋白质)，所述硫醚连接键通过反应性硫醇基团和含烯烃化合物的烯基团之间的自由基反应形成；生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物，其通过反应性硫醇基团和含烯烃化合物的烯基团之间的自由基反应形成；和生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物，其进一步包含与相关联的生物活性组分[例如，包囊于或共价键合至(掺入或附接至)]生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质，其通过反应性硫醇基团和含烯烃化合物的烯基团之间的自由基反应形成。根据含硫醇多肽的每个分子中反应性硫醇基团的数目和烯化合物中反应性烯基团的数目，可产生多种化合物或组合物。如本领域技术人员所理解，生物相容性或非生物相容性化合物和组合物可使用本文所述的方法根据烯化合物和一种或多种硫醇化合物的生物相容性或非生物相容性质来产生。同样如本领域技术人员所理解，可使用本文所述的方法根据烯化合物和一种或多种硫醇化合物的可降解或非可降解性质来产生可降解或非可降解的化合物和组合物。如本领域技术人员所进一步理解，可使用本文所述的方法产生的化合物和组合物可被定制为包含可降解和非可降解的部分(section)，对于非限制性实例，可降解多肽可连接到非可降解的聚合物基质。可降解化合物和组合物可通过酶、生物、化学或物理过程降解。
当包含一个或多个反应性硫醇基团的含硫醇的多肽与仅含有一个反应性烯基团的烯化合物反应时，所述多肽被修饰以携带一个或多个自含烯化合物衍生的“末端”部分，使得每个含烯化合物只能与一个反应性硫醇基团反应。
因此，本发明提供式(a)化合物：
p-[ct-s-c-c-q]x
其中p为多肽，ct为包含至少两个碳原子的接头，(t≥2)，x为1或大于1的整数且q为生物活性组分(例如，药物、毒素或农药)、聚合物部分(例如，peg)、捕获部分(例如，生物素)、标记物(例如，荧光标记、发色团或荧光团)、糖或碳水化合物、核酸或第二多肽。在一些实施方案中，ct选自(c2-c6)烷二基-、-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-和-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-(o-ch2ch2)z-，其中z为1-10,000的整数。在一些实施方案中，ct可进一步取代有一个或多个选自卤素、烷基和烷氧基的取代基。如本领域技术人员所理解，硫原子与q之间的c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分，诸如选自以下的反应性烯基团：乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，硫原子与q之间的c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分，其中所述反应性烯基团为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，所述烯属不饱和基团可进一步取代有一个或多个合适的取代基，诸如作为非限制性实例，卤素、烷基、烷氧基或氧代。如本领域技术人员所理解，有多种将c-c部分添加至q基团的方式。这些方法可得到携带烯/炔的部分与烯/炔官能团之间的接头基团，诸如，作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。在一个实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在一些实施方案中，硫原子与q之间的c-c部分为选自以下的部分：-ch2-ch2-ch2-c(＝o)-、-ch2-ch2-oc(＝o)-、-ch2-ch2-s(＝o)2-、-ch2-ch2-o-、-(c2-c6)-烷二基-、-ch2-ch2-c(＝o)o-、-ch2-ch(ch3)-c(＝o)o-、-ch2-ch2-c(＝o)nh-、-ch(ch3)-ch2-o-、-ch2-ch2-ch2-o-、-ch2-ch2-nhc(＝o)-、
在这些实施方案中，多肽p经由长度为两个碳原子或更长的接头连接至一个或多个硫醚部分。每个硫醚部分也经由自烯基团衍生的乙烯单元连接至q部分。
在式(a)的一些实施方案中，p可选自肽和蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗蛋白、酶和结构蛋白。生长因子可包括am、ang、bmp、bdnf、gdnf、gcsf、gm-csf、gdf、hgf、hdgf、kgf、msf、ngf、tpo、fbs、epo、igf、egf、fgf、tgf、pdgf和白介素，包括其衍生物和家族成员。结构蛋白包括纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、层粘连蛋白和胶原。
在式(a)的一些实施方案中，所述多肽p进一步包含已知对蛋白酶敏感的肽序列。在另一实施方案中，所述多肽为侧面有活性硫醇的纤溶酶可降解肽。在另一实施方案中，两种纤溶酶可降解序列包含在所述肽内。在具体的实施方案中，所述多肽为侧面有高半胱氨酸的基质金属蛋白酶(mmp)可降解肽，以创造通过细胞分泌的mmp降解的水凝胶网状物。
在一些实施方案中，x为1，其中一个q部分连接至多肽p。在一些实施方案中，x为2、3、4或更大的整数。
在式(a)的某些实施方案中，所述p部分选自肽和蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗蛋白、酶和结构蛋白。生长因子可包括am、ang、bmp、bdnf、gdnf、gcsf、gm-csf、gdf、hgf、hdgf、kgf、msf、ngf、tpo、fbs、epo、igf、egf、fgf、tgf、pdgf和白介素，包括其衍生物和家族成员。结构蛋白包括纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、层粘连蛋白和胶原。
在一些实施方案中，连接至多肽p的q部分针对意在赋予修饰的具体功能性质而选择，作为非限制性实例，引入荧光团或发色团，引入亲和标签，引入酶活性，引入某一化学部分或多个部分，引入亲水性、疏水性或两亲性聚合物尾部以便操纵溶解度、药动学、药效学或与生物膜或固体表面的相互作用，产生用于进一步聚合的含多肽的聚合物或远螯单体等，并且可包括以下的适当衍生物(非限制性实例)：聚(乳酸)(pla)、聚乙交酯(pga)、pla和pga的共聚物(plga)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙二醇)(peg)、聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物(泊洛沙姆、美罗沙波)、泊洛沙胺、聚酐、聚原酸酯、聚(羟基酸)、聚二噁烷酮、聚碳酸酯、聚氨基碳酸酯、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚氨酯、羧甲基纤维素、羟基烷基化纤维素诸如羟乙基纤维素和甲基羟基丙基纤维素，及天然聚合物诸如多肽、多糖或碳水化合物诸如聚蔗糖、透明质酸、葡聚糖及其类似衍生物，硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、肝素或藻酸盐，及蛋白质诸如明胶、胶原蛋白、白蛋白或卵白蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白，荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白或其类似物、荧光和非荧光染料、荧光猝灭剂，高亲和力标签，诸如多肽标签(his-标记物、flag-标签等)，抗体及其片段、核酸适体、寡核苷酸和多核苷酸，高级大分子集合体诸如核糖核蛋白、病毒衣壳等。所述第二部分的反应性烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。连接至多肽p的q部分可包含聚合物部分，诸如，但不限于，聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。在一些实施方案中，所述第二部分可包含生物活性组分。
在式(a)的某些实施方案中，连接至多肽p的q部分可包含生物活性组分，诸如任一种本文所述的生物活性组分。在一些实施方案中，所述q部分包含本文所述的聚合物、捕获部分、标记物、碳水化合物、核酸或第二多肽。
在一些实施方案中，式(a)化合物通过以下方式产生：使式p-[ct-sh]x化合物与式ch2＝ch-q化合物和自由基引发剂(诸如本文所述的光引发剂)，例如，在本文所述的促进自由基介导的硫醇-烯反应的条件下反应，其中p、ct、t、q和x如针对式(a)所定义或其任意变型。在一个方面，ch2＝ch-q的ch2＝ch-部分为选自以下的反应性烯基团：乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基和n-乙烯基氨甲酰基。
应当理解，ch2＝ch-q表示携带末端、未取代的烯烃部分的烯基团，但是也可使用经取代的烯烃并且也在本文中描述。因此，应当理解，本发明还提供其中c-c部分衍生自除了末端、未取代的烯烃以外的烯烃的式(a)化合物，并且可通过以下方式产生：使式p-[ct-sh]x与式t-q化合物和自由基引发剂(诸如本文所述的光引发剂)在自由基介导的反应条件下反应，其中p、ct、t、q和x如针对式(a)所定义或其任何变型，且t表示除末端、未取代的烯烃部分以外的烯烃部分。在一个方面，t-q为下式
在一些实施方案中，t-q的t部分为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，存在许多方式将ch2＝ch-部分添加至ch2＝ch-q的q部分或将t部分添加至t-q的q部分。这些方法可得到携带烯/炔的部分与烯/炔官能团之间的接头基团，诸如，作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。在优选的实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在一些实施方案中，ch2＝ch-q的ch2＝ch-部分选自以下的部分：ch2＝ch-c(＝o)-、ch2＝ch-s(＝o)2-、ch2＝ch-o-、ch2＝ch-(c0-c4)-烷二基-、ch2＝ch-c(＝o)o-、ch2＝c(ch3)-c(＝o)o-、ch2＝ch-c(＝o)nh-、ch2＝ch-ch2-o-和ch2＝ch-nhc(＝o)-，并且t-q的t部分选自
在一些实施方案中，式(a)化合物在减少的氧环境中或在不存在氧的情况下，诸如在经脱气的溶剂存在下产生。
在下表3中举例说明了式ch2＝ch-q和t-q的各种化合物和对应的式(a)化合物的非限制性实例，其中x为1(即(a)具有式p-ct-s-c-c-q)。在下表3中举例说明了式p-ct-sh的各种化合物和对应的式(a)化合物的非限制性实例，其中x为1(即(a)具有式p-ct-s-c-c-q)。
表3
表4：
本发明还提供式(b)化合物：
[p-ct-s-c-c]y-q
其中p为多肽，t≥2，ct为包含至少两个碳原子的接头(即，经由长度为两个碳原子或更长的接头将p连接至硫醚部分)，y为1或大于1的整数(例如，2、3、4或更大)且q选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。针对式(a)描述的p、ct、t和q的所有变型同样适用于并且针对式(b)进行描述，如同每个描述、变化、方面或实施方案被具体和单独针对式(b)列出。也就是说，应当理解，式(a)描述了其中可将多于一个-ct-s-c-c-q附加到给定p的材料，并且式(b)描述其中可将多于一个p-ct-s-c-c-附加到给定q的材料，但是基本的p、ct、t和q可在两个式中相同。
在一些实施方案中，ct选自(c2-c6)烷二基-、-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-和-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-(o-ch2ch2)z-，其中z为1-10,000的整数。在一些实施方案中，ct可进一步取代有一个或多个选自卤素、烷基和烷氧基的取代基。如本领域技术人员所理解，硫原子与q之间的各c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分，诸如独立选自以下的反应性烯基团：乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，硫原子与q之间的c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分，其中所述反应性烯基团为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，有多种将c-c部分添加至q基团的方式。这些方法可得到携带烯/炔的部分与烯/炔官能团之间的接头基团，诸如，作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。在一个实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯部分添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯部分添加至peg。在一些实施方案中，硫原子与q之间的各c-c部分为独立选自以下的部分：-ch2-ch2-ch2-c(＝o)-、-ch2-ch2-oc(＝o)-、-ch2-ch2-s(＝o)2-、-ch2-ch2-o-、-(c2-c6)-烷二基-、-ch2-ch2-c(＝o)o-、-ch2-ch(ch3)-c(＝o)o-、-ch2-ch2-c(＝o)nh-、-ch(ch3)-ch2-o-、-ch2-ch2-ch2-o-、-ch2-ch2-nhc(＝o)-、
在一些实施方案中，式(b)化合物通过以下方式产生：使式p-ct-sh化合物与式[ch2＝ch]yq化合物和自由基引发剂(诸如本文所述的光引发剂)，例如，在本文所述的促进自由基介导的硫醇-烯反应的条件下反应，其中p、ct、t、q和y如针对式(b)所定义或其任意变型。
在一个方面，[ch2＝ch]yq的每个ch2＝ch-部分为独立选自以下的反应性烯基团：乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基和n-乙烯基氨甲酰基。
应当理解，[ch2＝ch]yq表示携带一个或多个末端、未取代的烯烃部分的烯基团，但是也可使用经取代的烯烃并且也在本文中描述。因此，应当理解，本发明还提供其中c-c部分衍生自除了末端、未取代的烯烃以外的烯烃的式(b)化合物，并且可通过以下方式产生：使式p-ct-sh与式[t]y-q化合物和自由基引发剂(诸如本文所述的光引发剂)在自由基介导的反应条件下反应，其中p、ct、t、q和x如针对式(b)所定义或其任何变型，且t表示除末端、未取代的烯烃部分以外的烯烃部分。在一个方面，[t]y-q包含一个或多个环烯烃部分且[t]y-q具有下式
在一些实施方案中，[t]y-q的每个t部分为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，存在许多方式将一个或多个ch2＝ch-部分添加至[ch2＝ch]yq的q基团或将一个或多个t部分添加至[t]y-q的q基团。这些方法可得到携带烯/炔的部分与烯/炔官能团之间的接头基团，诸如，作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。在优选的实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯添加至peg。在一些实施方案中，[ch2＝ch]yq的每个ch2＝ch-部分为独立选自以下的部分：ch2＝ch-c(＝o)-、ch2＝ch-s(＝o)2-、ch2＝ch-o-、ch2＝ch-(c0-c4)-烷二基-、ch2＝ch-c(＝o)o-、ch2＝c(ch3)-c(＝o)o-、ch2＝ch-c(＝o)nh-、ch2＝ch-ch2-o-和ch2＝ch-nhc(＝o)-，并且[t]y-q的每个t部分独立选自
在一些实施方案中，式(b)化合物在减少的氧气环境中或在不存在氧气的情况下产生。
在式(b)的一些实施方案中，p可选自肽和蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗蛋白、酶和结构蛋白。生长因子可包括am、ang、bmp、bdnf、gdnf、gcsf、gm-csf、gdf、hgf、hdgf、kgf、msf、ngf、tpo、fbs、epo、igf、egf、fgf、tgf、pdgf和白介素，包括其衍生物和家族成员。结构蛋白包括纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、层粘连蛋白和胶原。
在式(b)的一些实施方案中，所述多肽p进一步包含已知对蛋白酶敏感的肽序列。在具体的实施方案中，所述多肽为侧面有高半胱氨酸的基质金属蛋白酶(mmp)可降解肽，以建立通过细胞分泌的mmp降解的水凝胶网状物。在另一实施方案中，所述多肽为侧面有活性硫醇的纤溶酶可降解肽。在另一实施方案中，两种纤溶酶可降解序列包含在所述肽内。
在式(b)的一些实施方案中，q为式(qa)的聚合物部分：
其中，r1和r2独立选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；且其中
r1和r2可取决于所得聚合物材料的期望性质而在尺寸上变化。更具体地，r1和r2的分子量可在约30da至约50000da的范围内。在形成本发明的聚合物材料之前，可将r1衍生以包括两个或更多个反应性硫醇基团且可将r2衍生以包括三个或更多个反应性烯基团，由此使得它们可参与光引发的硫醇-烯聚合，它们可参与光引发的硫醇-烯聚合。硫醇化的大分子单体诸如聚(乙二醇)二硫醇为可商购的。所述反应性烯基团可选自具有碳-碳双键的任何合适的化合物。例如，所述反应性烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。因此，应当理解，在上述重复单元中，所述碳可为ch2或者可在重复基团中的一个或多于一个碳原子处被取代，甚至包括掺入双键的环结构。如果r1用两个反应性硫醇基团衍生化且r2用两个反应性烯基团衍生化，所得的硫醇-烯聚合物将是由交替的r1和r2节段组成的直链共聚物。然而，硫醇-烯聚合物材料优选形成为含有交联和分支。因此，衍生化的r1和r2节段优选每个分子具有多于两个可参与交联和聚合的反应性硫醇基团或反应性烯基团。分支和交联的程度可通过使用不同衍生化的r1和r2节段进行控制，并控制起始物质的浓度。在一些实施方案中，r1为式-ct-r1b-ct-的多肽，其中r1b为多肽，t≥1且ct为包含至少一个碳原子的接头，其中r1b的每个残基包含可选自以下的ct接头：天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸残基为经硫醇取代的β氨基酸残基、经硫醇取代的γ氨基酸残基、经硫醇取代的δ氨基酸残基或经硫醇取代的ε氨基酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基衍生自天然氨基酸残基或其中羰基官能团被亚甲基部分替代的非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基衍生自天然氨基酸残基或其中氨基官能团被亚甲基替代的非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，ct选自(c2-c6)烷二基-、-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-和-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-(o-ch2ch2)z-，其中z为1-10,000的整数。在一些实施方案中，ct可进一步取代有一个或多个选自以下的取代基：卤素、烷基和烷氧基。
在式(b)的一些实施方案中，q为式(qb)的聚合物部分：
其中，r1和r2独立选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；且其中
r1和r2可取决于所得聚合物材料的期望性质而在尺寸上变化。更具体地，r1和r2的分子量可在约30da至约50000da的范围内。在形成本发明的聚合物材料之前，可将r1衍生以包括两个或更多个反应性硫醇基团且可将r2衍生以包括三个或更多个反应性烯基团，由此使得它们可参与光引发的硫醇-烯聚合，它们可参与光引发的硫醇-烯聚合。硫醇化的大分子单体诸如聚(乙二醇)二硫醇为可商购的。所述反应性烯基团可选自具有碳-碳双键的任何合适的化合物。例如，所述反应性烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。因此，应当理解，在上述重复单元中，所述碳可为ch2或者可在重复基团中的一个或多于一个碳原子处被取代，甚至包括掺入双键的环结构。如果r1用两个反应性硫醇基团衍生化且r2用两个反应性烯基团衍生化，所得的硫醇-烯聚合物将是由交替的r1和r2节段组成的直链共聚物。然而，硫醇-烯聚合物材料优选形成为含有交联和分支。因此，衍生化的r1和r2链段优选每个分子具有多于两个可参与交联和聚合的反应性硫醇基团或反应性烯基团。分支和交联的程度可通过使用不同衍生化的r1和r2节段进行控制，并控制起始物质的浓度。
本发明还提供聚合物材料(例如硫醇-烯水凝胶)，其包含重复的式(i)单元：
其中x为多肽，t≥2，ct为包含至少两个碳原子的接头(即，x经由长度为两个碳原子或更长的接头连接至两个硫醚部分)，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。在一些实施方案中，ct选自(c2-c6)烷二基-、-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-和-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-(o-ch2ch2)z-，其中z为1-10,000的整数。在一些实施方案中，ct可进一步取代有一个或多个选自卤素、烷基和烷氧基的取代基。如本领域技术人员所理解，硫原子与y之间的每个c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分诸如独立选自以下的反应性烯基团：乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，硫原子与y之间的c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分，其中所述反应性烯基团为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，有多种将c-c部分添加至y基团的方式。这些方法可得到携带烯/炔的部分与烯/炔官能团之间的接头基团，诸如，作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。在一个实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在一些实施方案中，硫原子与y之间的每个c-c部分为独立选自以下的部分：-ch2-ch2-ch2-c(＝o)-、-ch2-ch2-oc(＝o)-、-ch2-ch2-s(＝o)2-、-ch2-ch2-o-、-(c2-c6)-烷二基-、-ch2-ch2-c(＝o)o-、-ch2-ch(ch3)-c(＝o)o-、-ch2-ch2-c(＝o)nh-、-ch(ch3)-ch2-o-、-ch2-ch2-ch2-o-、-ch2-ch2-nhc(＝o)-、
本发明还提供聚合物材料[例如，涉及硫醇-烯水凝胶]，其包含重复的式(ii)单元：
其中x为多肽，t≥2，ct为包含至少两个碳原子的接头(即，x经由长度为两个碳原子或更长的接头连接至两个硫醚部分)，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；其中
本发明还提供聚合物材料[例如，涉及硫醇-烯水凝胶]，其包含重复的式(iii)单元：
其中x为多肽，t≥2，ct为包含至少两个碳原子的接头(即，x经由长度为两个碳原子或更长的接头连接至两个硫醚部分)，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；其中
在一些实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的聚合物材料可进一步包含与聚合物材料的聚合物基质相关联的生物活性组分。在这些实施方案的一些中，所述生物活性组分包囊于聚合物基质。在这些实施方案的一些中，所述生物活性组分共价结合至(例如，掺入或附接至)聚合物基质，该生物活性组分可为本文所述的可适用的生物活性组分中的任一种，诸如组织、细胞、蛋白质、肽、小分子药物、核酸、包囊的核酸(例如包囊于脂质纳米颗粒)、脂质、碳水化合物或农业化合物本文所述的。
应当理解，在式(a)、(b)、(i)、(ii)和(iii)中所示的重复单元中，碳原子可为ch2或可在重复基团中的一个或多于一个碳原子处被取代，甚至包括掺入双键的环结构。此外，应当理解，为了用烯/炔衍生化生物活性化合物，在生物活性化合物与碳之间可存在一个或多个连接基团。
当包含一个或多个反应性硫醇基团的含硫醇的多肽与仅含有一个反应性烯基团的烯化合物反应时，所述多肽被修饰以携带一个或多个衍生自含烯化合物的“末端”部分，因为每个含烯化合物只能与一个反应性硫醇基团反应。
因此，本发明提供式(c)化合物：
p-[ct-s-c-c-q]x
其中p为多肽，ct为包含至少一个碳原子的接头，t≥1，x为1或大于1的整数且q为生物活性组分(例如，药物、毒素或农药)、聚合物部分(例如，peg)、捕获部分(例如，生物素)、标记物(例如，荧光标记、发色团或荧光团)、糖或碳水化合物、核酸或第二多肽且其中包含ct接头的p的每个残基可选自天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸残基为经硫醇取代的β氨基酸残基、经硫醇取代的γ氨基酸残基、经硫醇取代的δ氨基酸残基或经硫醇取代的ε氨基酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基衍生自天然氨基酸残基或其中羰基官能团被亚甲基部分替代的非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基衍生自天然氨基酸残基或其中氨基官能团被亚甲基替代的非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，ct选自(c2-c6)烷二基-、-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-和-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-(o-ch2ch2)z-，其中z为1-10,000的整数。在一些实施方案中，ct可进一步取代有一个或多个选自卤素、烷基和烷氧基的取代基。如本领域技术人员所理解，硫原子与q之间的c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分，诸如选自以下的反应性烯基团：乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，硫原子与q之间的c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分，其中所述反应性烯基团为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，有多种将c-c部分添加至q基团的方式。这些方法可得到携带烯/炔的部分与烯/炔官能团之间的接头基团，诸如，作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。在一个实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在一些实施方案中，硫原子与q之间的c-c部分为选自以下的部分：-ch2-ch2-ch2-c(＝o)-、-ch2-ch2-oc(＝o)-、-ch2-ch2-s(＝o)2-、-ch2-ch2-o-、-(c2-c6)-烷二基-、-ch2-ch2-c(＝o)o-、-ch2-ch(ch3)-c(＝o)o-、-ch2-ch2-c(＝o)nh-、-ch(ch3)-ch2-o-、-ch2-ch2-ch2-o-、-ch2-ch2-nhc(＝o)-、
在这些实施方案中，多肽p经由长度为两个碳原子或更长的接头连接至一个或多个硫醚部分。每个硫醚部分也经由自烯基团衍生的乙烯单元连接至q部分。
在式(c)的一些实施方案中，p可选自肽和蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗蛋白、酶和结构蛋白。生长因子可包括am、ang、bmp、bdnf、gdnf、gcsf、gm-csf、gdf、hgf、hdgf、kgf、msf、ngf、tpo、fbs、epo、igf、egf、fgf、tgf、pdgf和白介素，包括其衍生物和家族成员。结构蛋白包括纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、层粘连蛋白和胶原。
在式(c)的一些实施方案中，所述多肽p进一步包含已知对蛋白酶敏感的肽序列。在另一实施方案中，所述多肽为侧面有活性硫醇的纤溶酶可降解肽。在另一实施方案中，两种纤溶酶可降解序列包含在所述肽内。在具体的实施方案中，所述多肽为侧面有高半胱氨酸的基质金属蛋白酶(mmp)可降解肽，以创造通过细胞分泌的mmp降解的水凝胶网状物。
在一些实施方案中，x为1，其中一个q部分连接至多肽p。在一些实施方案中，x为2、3、4或更大的整数。
在式(c)的某些实施方案中，所述p部分选自肽和蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗蛋白、酶和结构蛋白。生长因子可包括am、ang、bmp、bdnf、gdnf、gcsf、gm-csf、gdf、hgf、hdgf、kgf、msf、ngf、tpo、fbs、epo、igf、egf、fgf、tgf、pdgf和白介素，包括其衍生物和家族成员。结构蛋白包括纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、层粘连蛋白和胶原。
在一些实施方案中，连接至多肽p的q部分针对意在赋予修饰的具体功能性质而选择，作为非限制性实例，引入荧光团或发色团，引入亲和标签，引入酶活性，引入某一化学部分或多个部分，引入亲水性、疏水性或两亲性聚合物尾部以便操纵溶解度、药动学、药效学或与生物膜或固体表面的相互作用，产生用于进一步聚合的含多肽的聚合物或远螯单体等，并且可包括以下的适当衍生物(非限制性实例)：聚(乳酸)(pla)、聚乙交酯(pga)、pla和pga的共聚物(plga)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙二醇)(peg)、聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物(泊洛沙姆、美罗沙波)、泊洛沙胺、聚酐、聚原酸酯、聚(羟基酸)、聚二噁烷酮、聚碳酸酯、聚氨基碳酸酯、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚氨酯、羧甲基纤维素、羟基烷基化纤维素诸如羟乙基纤维素和甲基羟基丙基纤维素，及天然聚合物诸如多肽、多糖或碳水化合物诸如聚蔗糖、透明质酸、葡聚糖及其类似衍生物，硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、肝素或藻酸盐，及蛋白质诸如明胶、胶原蛋白、白蛋白或卵白蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白，荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白或其类似物、荧光和非荧光染料、荧光猝灭剂，高亲和力标签，诸如多肽标签(his-标记物、flag-标签等)，抗体及其片段、核酸适体、寡核苷酸和多核苷酸，高级大分子集合体诸如核糖核蛋白、病毒衣壳等。所述第二部分的反应性烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。连接至多肽p的q部分可包含聚合物部分，诸如，但不限于，聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。在一些实施方案中，所述第二部分可包含生物活性组分。
在式(c)的某些实施方案中，连接至多肽p的q部分可包含生物活性组分，诸如任一种本文所述的生物活性组分。在一些实施方案中，所述q部分包含本文所述的聚合物、捕获部分、标记物、碳水化合物、核酸或第二多肽。
在一些实施方案中，式(c)化合物通过以下方式产生：使式p-[ct-sh]x化合物与式ch2＝ch-q化合物和自由基引发剂(诸如本文所述的光引发剂)，例如，在本文所述的促进自由基介导的硫醇-烯反应的条件下反应，其中p、ct、t、q和x如针对式(c)所定义或其任意变化形式。在一个方面，ch2＝ch-q的ch2＝ch-部分为选自以下的反应性烯基团：乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基和n-乙烯基氨甲酰基。
应当理解，ch2＝ch-q表示携带末端、未取代的烯烃部分的烯基团，但是也可使用经取代的烯烃并且也在本文中描述。因此，应当理解，本发明还提供其中c-c部分衍生自除了末端、未取代的烯烃以外的烯烃的式(c)化合物，并且可通过以下方式产生：使式p-[ct-sh]x与式t-q化合物和自由基引发剂(诸如本文所述的光引发剂)在自由基介导的反应条件下反应，其中p、ct、t、q和x如针对式(c)所定义或其任何变型，且t表示除末端、未取代的烯烃部分以外的烯烃部分。在一个方面，t-q为下式
在一些实施方案中，t-q的t部分为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，存在许多方式将ch2＝ch-部分添加至ch2＝ch-q的q基团或将t部分添加至t-q的q基团。这些方法可得到携带烯/炔的部分与烯/炔官能团之间的接头基团，诸如，作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。在优选的实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在一些实施方案中，ch2＝ch-q的ch2＝ch-部分选自以下的部分：ch2＝ch-c(＝o)-、ch2＝ch-s(＝o)2-、ch2＝ch-o-、ch2＝ch-(c0-c4)-烷二基-、ch2＝ch-c(＝o)o-、ch2＝c(ch3)-c(＝o)o-、ch2＝ch-c(＝o)nh-、ch2＝ch-ch2-o-和ch2＝ch-nhc(＝o)-并且t-q的t部分选自
在一些实施方案中，式(c)化合物在减少的氧环境中或在不存在氧的情况下，诸如在经脱气的溶剂存在下产生。
本发明还提供式(d)化合物：
[p-ct-s-c-c]y-q
其中p为多肽，ct为包含至少一个碳原子的接头，t≥1，其中包含ct接头的p的每个残基可选自天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基；y为1或大于1的整数(例如，2、3、4或更大)且q选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。针对式(c)描述的p、ct、t和q的所有变化形式同样适用于并且针对式(d)进行描述，如同每个描述、变化、方面或实施方案被具体和单独针对式(d)列出。也就是说，应当理解，式(c)描述了其中可将多于一个-ct-s-c-c-q附加到给定p的材料，并且式(d)描述其中可将多于一个p-ct-s-c-c-附加到给定q的材料，但是基本的p、ct、t和q可在两个式中相同。
在一些实施方案中，所述非天然氨基酸残基为经硫醇取代的β氨基酸残基、经硫醇取代的γ氨基酸残基、经硫醇取代的δ氨基酸残基或经硫醇取代的ε氨基酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基衍生自天然氨基酸残基或其中羰基官能团被亚甲基部分替代的非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基衍生自天然氨基酸残基或其中氨基官能团被亚甲基替代的非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，ct选自(c2-c6)烷二基-、-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-和-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-(o-ch2ch2)z-，其中z为1-10,000的整数。在一些实施方案中，ct可进一步取代有一个或多个选自卤素、烷基和烷氧基的取代基。如本领域技术人员所理解，硫原子与q之间的各c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分诸如独立选自以下的反应性烯基团：乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，硫原子与q之间的c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分，其中所述反应性烯基团为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，有多种将c-c部分添加至q基团的方式。这些方法可得到携带烯/炔的部分与烯/炔官能团之间的接头基团，诸如，作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。在一个实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在一些实施方案中，硫原子与q之间的各c-c部分为独立选自以下的部分：-ch2-ch2-ch2-c(＝o)-、-ch2-ch2-oc(＝o)-、-ch2-ch2-s(＝o)2-、-ch2-ch2-o-、-(c2-c6)-烷二基-、-ch2-ch2-c(＝o)o-、-ch2-ch(ch3)-c(＝o)o-、-ch2-ch2-c(＝o)nh-、-ch(ch3)-ch2-o-、-ch2-ch2-ch2-o-、-ch2-ch2-nhc(＝o)-、
在一些实施方案中，式(d)化合物通过以下方式产生：使式p-ct-sh化合物与式[ch2＝ch]yq化合物和自由基引发剂(诸如本文所述的光引发剂)在例如本文所述的促进自由基介导的硫醇-烯反应的条件下反应，其中p、ct、t、q和y如针对式(d)所定义或其任意变化形式。
在一个方面，[ch2＝ch]yq的每个ch2＝ch-部分为独立选自以下的反应性烯基团：乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基和n-乙烯基氨甲酰基。
应当理解，[ch2＝ch]yq表示携带一个或多个末端、未取代的烯烃部分的烯基团，但是也可使用经取代的烯烃并且也在本文中描述。因此，应当理解，本发明还提供其中c-c部分衍生自除了末端、未取代的烯烃以外的烯烃的式(d)化合物，并且可通过以下方式产生：使式p-ct-sh与式[t]y-q化合物和自由基引发剂(诸如本文所述的光引发剂)在自由基介导的反应条件下反应，其中p、ct、t、q和x如针对式(d)所定义或其任何变化形式，且t表示除末端、未取代的烯烃部分以外的烯烃部分。在一个方面，[t]y-q包含一个或多个环烯烃部分且[t]y-q具有下式
在一些实施方案中，[t]y-q的每个t部分为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，存在许多方式将一个或多个ch2＝ch-部分添加至[ch2＝ch]yq的q基团或将一个或多个t部分添加至[t]y-q的q基团。这些方法可得到携带烯/炔的部分与烯/炔官能团之间的接头基团，诸如作为非限制性实例的酰胺官能团、酯官能团或其组合。在优选的实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在一些实施方案中，[ch2＝ch]yq的每个ch2＝ch-部分为独立选自以下的部分：ch2＝ch-c(＝o)-、ch2＝ch-s(＝o)2-、ch2＝ch-o-、ch2＝ch-(c0-c4)-烷二基-、ch2＝ch-c(＝o)o-、ch2＝c(ch3)-c(＝o)o-、ch2＝ch-c(＝o)nh-、ch2＝ch-ch2-o-和ch2＝ch-nhc(＝o)-，且[t]y-q的每个t部分独立选自
在一些实施方案中，式(d)化合物在减少的氧气环境中或在不存在氧气的情况下产生。
在式(d)的一些实施方案中，p可选自肽和蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗蛋白、酶和结构蛋白。生长因子可包括am、ang、bmp、bdnf、gdnf、gcsf、gm-csf、gdf、hgf、hdgf、kgf、msf、ngf、tpo、fbs、epo、igf、egf、fgf、tgf、pdgf和白介素，包括其衍生物和家族成员。结构蛋白包括纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、角蛋白、肌动蛋白、层粘连蛋白和胶原。
在式(d)的一些实施方案中，所述多肽p进一步包含已知对蛋白酶敏感的肽序列。在具体的实施方案中，所述多肽为侧面有高半胱氨酸的基质金属蛋白酶(mmp)可降解肽，以建立通过细胞分泌的mmp降解的水凝胶网状物。在另一实施方案中，所述多肽为侧面有活性硫醇的纤溶酶可降解肽。在另一实施方案中，两种纤溶酶可降解序列包含在所述肽内。
在式(d)的一些实施方案中，q为式(qc)的聚合物部分：
其中，r1和r2独立选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；且其中
r1和r2可取决于所得聚合物材料的期望性质而在尺寸上变化。更具体地，r1和r2的分子量可在约30da至约50000da的范围内。在形成本发明的聚合物材料之前，可将r1衍生以包括两个或更多个反应性硫醇基团且可将r2衍生以包括三个或更多个反应性烯基团，由此使得它们可参与光引发的硫醇-烯聚合，它们可参与光引发的硫醇-烯聚合。硫醇化的大分子单体诸如聚(乙二醇)二硫醇为可商购的。所述反应性烯基团可选自具有碳-碳双键的任何合适的化合物。例如，所述反应性烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。因此，应当理解，在上述重复单元中，所述碳可为ch2或者可在重复基团中的一个或多于一个碳原子处被取代，甚至包括掺入双键的环结构。如果r1用两个反应性硫醇基团衍生化且r2用两个反应性烯基团衍生化，所得的硫醇-烯聚合物将是由交替的r1和r2节段组成的直链共聚物。然而，硫醇-烯聚合物材料优选形成为含有交联和分支。因此，衍生化的r1和r2节段优选每个分子具有多于两个可参与交联和聚合的反应性硫醇基团或反应性烯基团。分支和交联的程度可通过使用不同衍生化的r1和r2节段进行控制，并控制起始物质的浓度。
在式(d)的一些实施方案中，q为式(qd)的聚合物部分：
其中，r1和r2独立选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；且其中
r1和r2可取决于所得聚合物材料的期望性质而在尺寸上变化。更具体地，r1和r2的分子量可在约30da至约50000da的范围内。在形成本发明的聚合物材料之前，可将r1衍生以包括两个或更多个反应性硫醇基团且可将r2衍生以包括三个或更多个反应性烯基团，由此使得它们可参与光引发的硫醇-烯聚合，它们可参与光引发的硫醇-烯聚合。硫醇化的大分子单体诸如聚(乙二醇)二硫醇为可商购的。所述反应性烯基团可选自具有碳-碳双键的任何合适的化合物。例如，所述反应性烯基团可选自任何合适的烯属不饱和基团，诸如，但不限于，乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。因此，应当理解，在上述重复单元中，所述碳可为ch2或者可在重复基团中的一个或多于一个碳原子处被取代，甚至包括掺入双键的环结构。如果r1用两个反应性硫醇基团衍生化且r2用两个反应性烯基团衍生化，所得的硫醇-烯聚合物将是由交替的r1和r2节段组成的直链共聚物。然而，硫醇-烯聚合物材料优选形成为含有交联和分支。因此，衍生化的r1和r2节段优选每个分子具有多于两个可参与交联和聚合的反应性硫醇基团或反应性烯基团。分支和交联的程度可通过使用不同衍生化的r1和r2节段进行控制，并控制起始物质的浓度。
本发明还提供聚合物材料(例如硫醇-烯水凝胶)，其包含重复的式(iv)单元：
其中x为多肽，t≥1且ct为包含至少一个碳原子的接头，其中包含ct接头的x的每个残基可选自天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸残基为经硫醇取代的β氨基酸残基、经硫醇取代的γ氨基酸残基、经硫醇取代的δ氨基酸残基或经硫醇取代的ε氨基酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基衍生自天然氨基酸残基或其中羰基官能团被亚甲基部分替代的非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基衍生自天然氨基酸残基或其中氨基官能团被亚甲基替代的非天然氨基酸残基。在一些实施方案中，ct选自(c2-c6)烷二基-、-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-和-c(＝o)-(c1-c6)-烷二基-(o-ch2ch2)z-，其中z为1-10,000的整数。在一些实施方案中，ct可进一步取代有一个或多个选自卤素、烷基和烷氧基的取代基。如本领域技术人员所理解，硫原子与y之间的每个c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分,诸如独立选自以下的反应性烯基团：乙烯基乙酰基、乙烯基酯、乙烯基磺酰基、乙烯基醚、烯丙基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺基、马来酰亚胺基、丙烯基醚、烯丙基醚、烯基、不饱和酯、二烯基、n-乙烯基氨甲酰基和降冰片-2-烯-5-基。在一些实施方案中，硫原子与y之间的c-c部分为由反应性硫醇基团与反应性烯基团的硫醇-烯反应得到的部分，其中所述反应性烯基团为降冰片-2-烯-5-基。如本领域技术人员所理解，有多种将c-c部分添加至y基团的方式。这些方法可得到携带烯/炔的部分与烯/炔官能团之间的接头基团，诸如，作为非限制性实例，酰胺官能团、酯官能团或其组合。在一个实施方案中，用5-降冰片烯-2-羧酸修饰peg，由此使得经由酯连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在另一实施方案中，用nhs-降冰片烯修饰peg胺，由此使得经由酰胺连接键将一个或多个末端降冰片烯部分(降冰片-2-烯-5-基)添加至peg。在一些实施方案中，硫原子与y之间的每个c-c部分为独立选自以下的部分：-ch2-ch2-ch2-c(＝o)-、-ch2-ch2-oc(＝o)-、-ch2-ch2-s(＝o)2-、-ch2-ch2-o-、-(c2-c6)-烷二基-、-ch2-ch2-c(＝o)o-、-ch2-ch(ch3)-c(＝o)o-、-ch2-ch2-c(＝o)nh-、-ch(ch3)-ch2-o-、-ch2-ch2-ch2-o-、-ch2-ch2-nhc(＝o)-、
本发明还提供聚合物材料[例如，涉及硫醇-烯水凝胶]，其包含式的重复单元(v)：
其中x为多肽，t≥1且ct为包含至少一个碳原子的接头，其中包含ct接头的x的每个残基可选自天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；其中
本发明还提供聚合物材料[例如，涉及硫醇-烯水凝胶]，其包含重复的式(vi)单元：
其中x为多肽，t≥1且ct为包含至少一个碳原子的接头，其中包含ct接头的x的每个残基可选自天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；其中
在一些实施方案中，式(iv)、(v)或(vi)的聚合物材料可进一步包含与聚合物材料的聚合物基质相关联的生物活性组分。在这些实施方案的一些中，所述生物活性组分包囊于聚合物基质。在这些实施方案的一些中，所述生物活性组分共价结合至(例如，掺入或附接至)聚合物基质。该生物活性组分可为本文所述的可适用的生物活性组分中的任一种，诸如组织、细胞、蛋白质、肽、小分子药物、核酸、包囊的核酸(例如包囊于脂质纳米颗粒)、脂质、碳水化合物或农业化合物本文所述的。
应当理解，在式(c)、(d)、(iv)、(v)和(vi)中所示的重复单元中，碳原子可为ch2或可在重复基团中的一个或多于一个碳原子处被取代，甚至包括掺入双键的环结构。此外，应当理解，为了用烯/炔衍生化生物活性化合物，在生物活性化合物与碳之间可存在一个或多个连接基团。
用途
本文所述的或通过本文所述的方法产生的肽:聚合物组合物可在治疗人和动物中具有许多用途。在一个实施方案(药物递送)中，生物活性化合物被包囊、附接或掺入水凝胶中，并且使水凝胶与组织接触，由此使得生物活性组分被释放到组织中。它可通过上述任何机理释放到组织中，包括从水凝胶中扩散、水凝胶的降解或经由可降解的接头释放。在另一实施方案(组织再生)中，水凝胶作为组织再生的骨架起作用。在一个这样的实施方案中，细胞或组织被包囊于骨架中，并且将骨架置于组织缺陷中。水凝胶可预先制造，在施用时预聚合，或者可在缺陷的部位进行原位聚合。在另一实施方案中，水凝胶作为从周围迁移到骨架中的细胞的骨架起作用。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于治疗有此需要的受试者(例如人或动物)的疾病或病症的方法，包括给予本文所述的经修饰的多肽(诸如与第二部分缀合的多肽)；与本文所述的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物相关联[例如，包囊于或共价键合至(掺入或附接至)]的生物活性组分；本文所述的的化合物；或与本文所述的聚合物材料相关联[例如，包囊于或共价键合至(掺入或附接至)]的生物活性组分。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于再生组织的方法，包括在损伤或缺陷组织的部位释放包囊于本文所述的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物中的细胞或组织。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在损伤或缺陷组织的部位产生包含生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的组合物。
试剂盒
包含本文提供的化合物或组合物(例如，式(a)-(d)或(i)-(vi)的化合物或这些化合物的一种前体或多种前体，以及任选的额外药剂，诸如额外的生物活性组分)的试剂盒。在一个方面，试剂盒包括用于治疗损伤(诸如伤口)的说明书。
上文和全文详细描述的任何组合物可用于试剂盒中，如同将每种化合物和组合物具体地和单独列出用于试剂盒一样。试剂盒可任选包含诸如用于治疗损伤(诸如伤口)的说明书。试剂盒可包含与治疗相关的额外组分，诸如用于将化合物或组合物递送到个体上的期望部位(诸如伤口)的施用器(applicator)，诸如针和/或注射器。试剂盒还可包含选择用于引发聚合的光引发剂。试剂盒可进一步含有在选择以匹配用于引发聚合的光引发剂的吸收光谱的波长处发射光的光源。
制品
本发明提供制品，其包含其中本文提供的化合物或组合物(例如，式(a)-(d)或(i)-(vi)的化合物或这些化合物的一种前体或多种前体，以及任选的额外药剂，诸如额外的生物活性组分)包含在内的容器。制品可以是瓶、小瓶(包括密封或可封闭的管)、安瓿、一次性使用施用器、注射器等。容器可由各种材料形成，诸如玻璃或塑料，并且在一个方面，还含有在容器上或与容器相关联的标签，其指示用于治疗本文提供的适应症的指导，诸如愈合伤口。
在一个方面，容器是含有本文提供的组合物的单位剂型的医疗装置。所述装置可含有用于将组合物施用至个体上的损伤部位(例如，伤口)的施用器。可选择地，容器(例如，瓶、小瓶或安瓿)可与用于将组合物从容器分配至期望部位(例如，伤口)的针和/或注射器的说明书一起包装或提供。在一个方面，包括本文提供的化合物或组合物或本文提供的化合物或组合物的一种前体或多种前体的制品(例如，式(a)-(d)或(i)-(vi)的化合物或这些化合物的一种前体或多种前体)与适合于获得或储存任选的额外试剂(诸如额外的生物活性组分)的第二容器一起包装。
本文所述的任何组合物可用于制品中，如同将每种组合物具体地和单独列出用于使用制品一样。
列举的实施方案
通过以下实施方式进一步描述本发明。适当和可行时，每个实施方案的特征可与任何其它实施方案组合。
实施方案1.一种用于连接多肽的方法，其中所述多肽包含肽骨架和一个或多个反应性硫醇基团，所述方法包括使多肽的反应性硫醇基团与包含一个或多个反应性烯基团的烯化合物在促进自由基介导的硫醇-烯反应的条件下反应，其中多肽的反应性硫醇基团具有为半胱氨酸硫醇基团的至少2倍的针对自由基介导的硫醇-烯反应的反应性。
实施方案2.实施方案1的方法，其中所述方法包括使多肽的反应性硫醇基团与自由基引发剂和烯化合物反应。
实施方案3.实施方案1或2的方法，其中所述多肽的反应性硫醇基团通过两个或更多个碳原子与所述多肽的肽骨架隔开。
实施方案4.实施方案3的方法，其中所述多肽的反应性硫醇基团是多肽的高半胱氨酸残基的硫醇基团或多肽的2-氨基-5-巯基戊酸残基的硫醇基团。
实施方案5.实施方案3的方法，其中所述多肽的反应性硫醇基团为经由接头附接至赖氨酸残基的侧链氨基的硫醇基团。
实施方案6.实施方案2至5中任一项的方法，其中所述自由基引发剂为选自以下的光引发剂：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(lap)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸钠(nap)、2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、1-羟基-环己基-苯基-酮和2,2-二甲氧基-1,2-二苯基乙-1-酮。
实施方案7.实施方案6的方法，其中通过使光引发剂暴露于具有与光引发剂的激发波长相匹配的波长的光来引发硫醇-烯反应。
实施方案8.实施方案6或7的方法，其中所述方法进一步包括控制光引发剂的量、光的强度和/或光引发剂暴露于光的时间。
实施方案9.实施方案8的方法，其中所述硫醇-烯反应达到约70％完成至约95％完成。
实施方案10.实施方案1至9中任一项的方法，其中所述多肽包含两个或更多个反应性硫醇基团，其各自通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开。
实施方案11.实施方案10的方法，其中所述烯化合物包含两个或更多个反应性烯基团。
实施方案12.实施方案11的方法，其中所述多肽包含n个反应性硫醇基团，所述烯化合物包含m个反应性烯基团，其中n和m独立地为≥2的整数且n+m≥5。
实施方案13.实施方案12的方法，其中所述烯化合物为烯改性的生物相容性单体。
实施方案14.实施方案13的方法，其中所述烯化合物为降冰片烯改性的聚乙二醇(peg)。
实施方案15.实施方案13或14的方法，其中所述多肽进一步包含已知对蛋白酶敏感的肽序列。
实施方案16.实施方案15的方法，其中所述硫醇-烯反应提供生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物。
实施方案17.实施方案1至9中任一项的方法，其中所述烯化合物包含一个反应性烯基团。
实施方案18.实施方案17的方法，其中所述烯化合物包含聚合物、捕获部分、标记物、碳水化合物、核酸或第二多肽。
实施方案19.实施方案17的方法，其中所述烯化合物包含生物活性组分。
实施方案20.实施方案17至19中任一项的方法，其中所述多肽包含通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开的一个反应性硫醇基团。
实施方案21.实施方案17至20中任一项的方法，其中所述多肽选自肽或蛋白质激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素、受体、可溶性受体、治疗性蛋白、酶和结构蛋白。
实施方案22.实施方案1至9中任一项的方法，其中所述多肽包含通过两个或更多个碳原子与多肽的肽骨架隔开的一个反应性硫醇基团，并且所述烯化合物包含两个或更多个反应性烯基团。
实施方案23.实施方案22的方法，其中所述烯化合物包含两个或更多个反应性烯基团。
实施方案24.实施方案22的方法，其中所述方法进一步包括使第二硫醇化合物与包含两个或更多个反应性烯基团的烯化合物反应，其中所述第二硫醇化合物包含两个或更多个反应性硫醇基团。
实施方案25.实施方案24的方法，其中所述第二硫醇化合物包含j个反应性硫醇基团，所述烯化合物包含k个反应性烯基团，其中j和k独立地为≥2的整数且j+k≥5。
实施方案26.实施方案24或25的方法，其中所述第二硫醇化合物包含选自以下的聚合物部分：聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
实施方案27.实施方案24或25的方法，其中所述第二硫醇化合物包含肽骨架、可降解的肽和两个或更多个反应性硫醇基团，所述硫醇基团各自通过两个或更多个碳原子与肽骨架隔开。
实施方案28.实施方案27的方法，其中所述第二硫醇化合物包含已知对蛋白酶敏感的肽序列和位于肽序列侧翼的两个高半胱氨酸残基。
实施方案29.实施方案24或25的方法，其中所述第二硫醇化合物包含聚乙二醇和附接至聚乙二醇的两个末端硫醇基团。
实施方案30.实施方案22至29中任一项的方法，其中所述烯化合物包含选自以下的聚合物部分：聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
实施方案31.实施方案1至30中任一项的方法，进一步包括产生包含一个或多个反应性硫醇基团的多肽。
实施方案32.实施方案31的方法，其中产生包含一个或多个反应性硫醇基团的多肽包括使用经保护的含硫醇的氨基酸或氨基酸类似物的多肽合成，其中所述硫醇基团通过两个或更多个碳原子与同羧基相邻的碳原子隔开，所述经保护的含硫醇的氨基酸或氨基酸类似物诸如经保护的高半胱氨酸或2-氨基-5-巯基戊酸。
实施方案33.实施方案31的方法，其中产生包含一个或多个反应性硫醇基团的多肽包括使用硫醇化剂修饰多肽。
实施方案34.实施方案31的方法，其中产生包含一个或多个反应性硫醇基团的多肽包括将多肽中的甲硫氨酸残基进行化学或酶促转化为高半胱氨酸残基。
实施方案35.一种通过实施方案1至34中任一项的方法产生的连接多肽。
实施方案36.一种用于产生生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的方法，包括使反应性硫醇化合物与自由基引发剂和反应性烯化合物反应，其中所述反应性硫醇化合物包含肽骨架、可降解的肽和两个或更多个反应性硫醇基团，所述硫醇基团各自通过两个或更多个碳原子与肽骨架隔开；且所述反应性烯化合物是包含两个或更多个反应性烯基团的烯改性的生物相容性单体。
实施方案37.实施方案36的方法，其中所述多肽包含n个反应性硫醇基团，所述烯化合物包含m个反应性烯基团，其中n和m独立地为≥2的整数且n+m≥5。
实施方案38.实施方案36的方法，进一步包括向反应混合物中添加生物活性组分，其中所述生物活性组分与生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质相关联。
实施方案39.实施方案36或38的方法，其中反应性硫醇化合物的反应性硫醇基团独立选自多肽的高半胱氨酸残基的硫醇基团、多肽的2-氨基-5-巯基戊酸残基的硫醇基团和经由接头附接至赖氨酸残基的侧链氨基的硫醇基团。
实施方案40.实施方案36至39中任一项的方法，其中所述自由基引发剂为选自以下的光引发剂：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(lap)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸钠(nap)、2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、1-羟基-环己基-苯基-酮和2,2-二甲氧基-1,2-二苯基乙-1-酮。
实施方案41.实施方案36至40中任一项的方法，其中所述反应性烯化合物包含选自以下的聚合物部分：聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
实施方案42.实施方案38至41中任一项的方法，其中所述生物活性组分为组织、细胞、蛋白质、肽、小分子药物、核酸、包囊的核酸(例如包囊于脂质纳米颗粒中)、脂质、碳水化合物或农业化合物。
实施方案43.实施方案42的方法，其中所述生物活性组分包囊于生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质中。
实施方案44.实施方案42的方法，其中所述生物活性组分共价键合至生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质。
实施方案45.实施方案44的方法，其中所述生物活性组分为经由通过使生物活性多肽的反应性硫醇基团与烯基团反应所形成的硫醚连接键而共价键合至聚合物基质的生物活性多肽，其中所述硫醚连接键的硫基通过两个或更多个碳原子与生物活性多肽的骨架隔开。
实施方案46.一种通过实施方案35至45中任一项的方法产生的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物。
实施方案47.实施方案46的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物，进一步包含与生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的聚合物基质相关联的生物活性组分。
实施方案48.式(a)化合物：
p-[ct-s-c-c-q]x
其中p为多肽，t≥2，ct是包含至少两个碳原子的接头，x为1或大于1的整数且q为生物活性组分、聚合物、捕获部分、标记物、碳水化合物、核酸或第二多肽。
实施方案49.实施方案48的化合物，其中所述化合物通过以下方式产生：使式p-[ct-sh]x化合物与式ch2＝ch-q化合物和自由基引发剂反应。
实施方案50.式(b)化合物：
[p-ct-s-c-c]y-q
其中p为多肽，t≥2，ct是包含至少两个碳原子的接头，y为1或大于1的整数且q选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
实施方案51.实施方案50的化合物，其中所述化合物通过以下方式产生：使式p-ct-sh化合物与式[ch2＝ch]yq化合物和自由基引发剂反应。
实施方案52.实施方案50的化合物，其中q为式(qa)的聚合物部分：
其中，r1和r2独立选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；且其中
实施方案53.实施方案50的化合物，其中q为式(qb)的聚合物部分：
其中，r1和r2独立选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；且其中
实施方案54.一种聚合物材料[例如涉及硫醇-烯水凝胶]，其包含重复的式(i)单元：
其中x为多肽，t≥2，ct是包含至少两个碳原子的接头，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
实施方案55.实施方案54的聚合物材料，其进一步包含与聚合物材料的聚合物基质相关联的生物活性组分。
实施方案56.一种聚合物材料[例如涉及硫醇-烯水凝胶]，其包含重复的式(ii)单元：
其中x为多肽，t≥2，ct为包含至少两个碳原子的接头(即，x经由长度为两个碳原子或更长的接头连接至两个硫醚部分)，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；其中
实施方案57.一种聚合物材料[例如涉及硫醇-烯水凝胶]，其包含重复的式(iii)单元：
其中x为多肽，t≥2，ct为包含至少两个碳原子的接头(即，x经由长度为两个碳原子或更长的接头连接至两个硫醚部分)，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；其中
实施方案58.式(c)化合物：
p-[ct-s-c-c-q]x
其中p为多肽，ct为包含至少一个碳原子的接头，t≥1，x为1或大于1的整数且q为生物活性组分(例如，药物、毒素或农药)、聚合物部分(例如，peg)、捕获部分(例如，生物素)、标记物(例如，荧光标记、发色团或荧光团)、糖或碳水化合物、核酸或第二多肽且其中包含ct接头的p的每个残基可选自天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基。
实施方案59.权利要求58的化合物，其中所述化合物通过以下方式产生：使式p-[ct-sh]x化合物与式ch2＝ch-q化合物和自由基引发剂反应。
实施方案60.式(d)化合物：
[p-ct-s-c-c]y-q
其中p为多肽，ct为包含至少一个碳原子的接头，t≥1，其中包含ct接头的p的每个残基可选自天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基；y为1或大于1的整数(例如，2、3、4或更大)且q选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
实施方案61.实施方案60的化合物，其中所述化合物通过以下方式产生：使式p-ct-sh化合物与式[ch2＝ch]yq化合物和自由基引发剂反应。
实施方案62.实施方案60的化合物，其中q为式(qc)的聚合物部分：
其中，r1和r2独立选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；且其中
实施方案63.实施方案60的化合物，其中q为式(qd)的聚合物部分：
其中，r1和r2独立选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；且其中
实施方案64.一种聚合物材料(例如硫醇-烯水凝胶)，其包含重复的式(iv)单元：
其中x为多肽，t≥1且ct为包含至少一个碳原子的接头，其中包含ct接头的x的每个残基可选自天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合。
实施方案65.实施方案64的聚合物材料，其进一步包含与聚合物材料的聚合物基质相关联的生物活性组分。
实施方案66.一种聚合物材料[例如涉及硫醇-烯水凝胶]，其包含重复的式(v)单元：
其中x为多肽，t≥1且ct为包含至少一个碳原子的接头，其中包含ct接头的x的每个残基可选自天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；其中
实施方案67.一种聚合物材料[例如涉及硫醇-烯水凝胶]，其包含重复的式(vi)单元：
其中x为多肽，t≥1且ct为包含至少一个碳原子的接头，其中包含ct接头的x的每个残基可选自天然氨基酸残基、稀有氨基酸残基、非天然氨基酸残基、氨基酸类似物残基或氨基酸模拟物残基，条件是包含ct接头的天然氨基酸残基不是半胱氨酸残基，且y选自聚(乳酸)(pla)；聚乙交酯(pga)；pla和pga的共聚物(plga)；聚(乙烯醇)(pva)；聚(乙二醇)(peg)；聚(环氧乙烷)；聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物；泊洛沙胺；聚酐；聚原酸酯；聚(羟基酸)；聚二噁烷酮；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚(乙烯吡咯烷酮)；聚(乙基噁唑啉)；聚氨酯；羧甲基纤维素；羟基烷基化纤维素；多肽；核酸；修饰的核酸；锁核酸；多糖；碳水化合物；硫酸乙酰肝素；硫酸软骨素；肝素；藻酸盐；及其组合；其中
实施方案68.一种用于治疗有此需要的受试者的疾病或病症的方法，包括给予实施方案35的经修饰的多肽；与实施方案46的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物相关联的生物活性组分；实施方案48的化合物；实施方案50的化合物；与实施方案54的聚合物材料相关联的生物活性组分；与实施方案56的聚合物材料相关联的生物活性组分；与实施方案57的聚合物材料相关联的生物活性组分；实施方案58的化合物；实施方案60的化合物；与实施方案64的聚合物材料相关联的生物活性组分；与实施方案66的聚合物材料相关联的生物活性组分；或与实施方案67的聚合物材料相关联的生物活性组分。
实施方案69.一种用于再生组织的方法，包括在损伤或缺陷组织的部位释放包囊于实施方案46的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物中的细胞或组织。
实施方案70.实施方案的方法69，进一步包括在损伤或缺陷组织的部位产生包含生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物的组合物。
实施方案71.一种试剂盒，其包含实施方案35的经修饰多肽；与实施方案46的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物相关联的生物活性组分；实施方案48的化合物；实施方案50的化合物；与实施方案54的聚合物材料相关联的生物活性组分；与实施方案56的聚合物材料相关联的生物活性组分；与实施方案57的聚合物材料相关联的生物活性组分；实施方案58的化合物；实施方案60的化合物；与实施方案64的聚合物材料相关联的生物活性组分；与实施方案66的聚合物材料相关联的生物活性组分；或与实施方案67的聚合物材料相关联的生物活性组分。
实施方案72.一种制品，其包含实施方案35的经修饰多肽；与实施方案46的生物相容性交联的可降解水凝胶聚合物相关联的生物活性组分；实施方案48的化合物；实施方案50的化合物；与实施方案54的聚合物材料相关联的生物活性组分；与实施方案56的聚合物材料相关联的生物活性组分；与实施方案57的聚合物材料相关联的生物活性组分；实施方案58的化合物；实施方案60的化合物；与实施方案64的聚合物材料相关联的生物活性组分；与实施方案66的聚合物材料相关联的生物活性组分；或与实施方案67的聚合物材料相关联的生物活性组分。
实施例
提供以下实施例以示例说明而不是限制本发明。
实施例1：固相合成后将高半胱氨酸和2-氨基-5-硫基戊酸掺入合成的寡肽中。
根据本领域熟知的方法，通过固相fmoc合成操作在rink-amide树脂上合成序列kcgpqgiagqck("mmpa")和calkvlkgc("c2xpc")的含半胱氨酸的寡肽(参见chanw.c.andwhitep.d.2000)。
为了位点特异性引入高半胱氨酸或2-氨基-5-硫基戊酸残基以代替这些序列中的半胱氨酸，将经fmoc保护的构造块(s)-2-(fmoc-氨基)-4-三苯甲基硫基-丁酸(bachem)或(s)-fmoc-2-氨基-5-(三苯甲基硫基)-戊酸(polypeptide)在合成操作中使用以代替半胱氨酸的常见构造块(例如fmoc-l-cys(trt)-oh)。使用本领域已知的标准方法将合成的寡肽从树脂上切割、脱保护和纯化。
实施例2：将非天然硫醇掺入合成的寡肽中。
操作1：用nhs-peg-硫醇进行肽的树脂上选择性硫醇化
为了在没有掺入两个半胱氨酸氨基酸的情况下制备二硫醇肽交联剂，在自动化固相肽合成仪(tribute,proteintechnologies)上用标准fmoc化学以0.5mmol规模合成以下肽：gpq(trt)giwgq(trt)gk(dde)g-树脂。包括最终脱保护步骤以从肽中移去n-末端fmoc，留下游离的末端胺：nh2-gpq(trt)giwgq(trt)gk(dde)g-树脂。然后通过将肽-树脂在20mldmf+2％肼中在室温孵育10分钟来移去k(dde)上的dde保护基(该脱保护步骤重复3次)，以产生nh2-gpq(trt)giwgq(trt)gk(nh2)g-树脂。然后用dmf洗涤肽-树脂以移去肼并称重(回收5.5g肽-树脂)。
然后将51.4mg肽-树脂转移到单独的玻璃反应容器中(基于0.5mmol合成，得到5.5g肽-树脂，51.4mg将为约0.005mmol肽)。然后将1ml无水dmf(sigma)、100mg3.5kdanhs-peg-sh(nanocs)和9μl二异丙基乙胺(sigma)添加到反应容器中并在室温搅拌>24小时。然后在茚三酮测试中测试游离胺的存在(从反应混合物中取出2μl珠粒，并用40μl5％茚三酮/乙醇、40μl苯酚/乙醇(4:1比率)和40μl吡啶在100℃孵育2分钟。在该测试中，通过出现紫色检测游离胺的存在)。尽管在该测试中未反应的肽-树脂产生了显著的紫色，但是从nhs-peg-sh反应混合物中取出的珠粒在并行(side-by-side)测试中并未显示出紫色，这表明游离胺已经成功地与nhs-peg-sh反应。然后通过与1ml裂解混合物(cocktail)(0.5mlh2o、0.25g苯酚、0.25g二硫苏糖醇(dtt)、0.125ml三异丙基硅烷(tips)、5ml三氟乙酸(tfa))反应从树脂上切割肽。该步骤还移去了q(trt)上的trt保护基团。通过在乙醚中析出回收肽。
操作2：用巯基-酸进行肽的树脂上选择性硫醇化
为了在没有掺入两个半胱氨酸氨基酸的情况下制备二硫醇肽交联剂，在自动化固相肽合成仪(tribute,proteintechnologies)上用标准fmoc化学以0.5mmol规模合成以下肽：gk(boc)k(dde)q(trt)giwgq(trt)gk(dde)k(boc)g-树脂。包括最终脱保护和封端步骤以从肽中移去n-末端fmoc并将游离的末端胺封端。然后通过将肽-树脂在20mldmf+2％肼中在室温孵育10分钟来移去k(dde)上的dde保护基(该脱保护步骤重复3次)，以产生gk(boc)k(nh2)q(trt)giwgq(trt)gk(nh2)k(boc)g-树脂。然后用dmf多次洗涤肽树脂以除去残留的肼，然后置于含有10ml无水dcm的反应玻璃容器中。
通过将600mgnhs、800μl二异丙基碳二亚胺(dic)和440μl3-巯基-丙酸在无水dcm中与少量二甲基氨基吡啶(dmap)混合来进行第二反应。在该反应期间，形成可见的析出物，表明nhs的成功活化。过滤该反应混合物以移去析出物，然后添加至肽-树脂/dcm中。将合并的肽-树脂和活化的nhs在室温混合30分钟以使k(nh2)完全转化成k(n-ccc-sh)，如通过茚三酮测试(在先前操作所述)所监测。
然后通过与裂解混合物(1.0mlh2o、0.5g苯酚、0.5g二硫苏糖醇(dtt)、0.25ml三异丙基硅烷(tips)、10ml三氟乙酸(tfa))反应从树脂上切割肽。该步骤还从k(boc)和q(trt)中移去boc和trt保护基团。通过在乙醚中析出回收肽。
作为先前描述的操作的替代方案，本领域已知的许多硫醇化试剂可用于将选择性脱保护的氨基转化为非半胱氨酸硫醇，例如可商购的n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫基丙酸酯(satp)或n-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯。
实施例3：将非半胱氨酸硫醇基团掺入胶原中。
在+4℃，将以约3mg/ml浓度溶于20mm乙酸(corning)中的大鼠尾胶原针对6m尿素于ph8.0的磷酸盐缓冲液中的溶液进行透析。透析后的变性胶原随后在环境温度用1:100(体积:体积)的55mmn-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫基丙酸酯(satp)在二甲基亚砜中的溶液处理2小时。通过在+4℃针对6m尿素于ph7.4的磷酸盐缓冲液中的溶液进行过夜透析，移去未反应的satp和二甲基亚砜。通过在ph7.4的磷酸盐缓冲液中用1:10(体积:体积)的0.5m羟胺、25mmedta在环境温度处理蛋白质溶液2小时，并通过在+4℃针对20mm乙酸进行广泛透析，除去尿素、缓冲液和脱酰基化步骤的低分子量产物。
实施例4：使用二半胱氨酸交联剂和peg-二硫醇交联剂的硫醇-烯水凝胶的光聚合的动力学。
制备含有6％(wt/vol)的4臂20kdapeg四降冰片烯(fairbanks)、0.01％(wt/vol)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸钠(或nap)(fairbanks2)、50mm乙酸钠缓冲液ph5.0和6mm二硫醇交联剂(降冰片烯与硫醇的化学计量比)的100微升样品。二硫醇交联剂包括直链peg-二硫醇、3.5kda(jenkemusa)或含合成性二半胱氨酸的寡肽肽“mmpa”(氨基酸序列kcgpqgiagqck)。一式两份制备和分析所有样品。
在水凝胶光聚合的实时动力学之后为在discoveryhr-3流变仪(tainstruments)上的平行板几何学的原位动态流变学。在19mw/cm2的385nm光通过平板石英板引导通过样品，同时在0.250mm间隙、1％应变和10rad/s的环境温度进行动态应力测量。在聚合后进行应变扫描(strainsweep)以验证线性响应方案。进行聚合，直到剪切储能模量(g')达到平台值(图5)，这表明光聚合反应完成。
数据的检查表明，如果使用peg二硫醇作为交联剂，则g'在小于10s的照射范围内达到平台值，而如果使用二半胱氨酸肽mmpa，则需要较长的时间(超过80s)。
实施例5：在光诱导的硫醇-烯反应的过程中，针对多种含有硫醇的化合物的游离硫醇基团的消耗速率。
为了比较在光引发的硫醇-烯反应中各种携带硫醇的化合物的相对反应性，制备200μl溶液，其含有6mm直链peg二降冰片烯(mw3.8kda)、0.01％(wt/vol)nap、50mm乙酸钠ph5.0和具有12mm浓度硫醇的携带硫醇的化合物(具有降冰片烯浓度的化学计量)，并在平底96孔组织培养板中以19mw/cm2的385nm光照射。测试的携带硫醇的化合物包括β-巯基乙醇、甲氧基peg硫醇(mw5kda,"mme-peg5k-sh")、半胱氨酸盐酸盐和含合成的二半胱氨酸的寡肽"c2xpc"(氨基酸序列calkvlkgc)。
在规定的时间点，从反应混合物中取出10微升等分试样，用去离子水稀释12倍，如下通过ellman测定法测量剩余游离硫醇的浓度。在透明的平底96孔板中，将20微升稀释的样品与200微升的5,5'-二硫代二(2-硝基苯甲酸)的200微摩尔浓度溶液在50mm磷酸钠(ph7.4)中混合并在环境温度孵育15分钟。用biotekelx800平板读数器确定样品中由游离硫醇释放的2-硝基-5-硫代苯甲酸盐所产生在405nm处的光密度。新鲜制备的0.063mm至1.46mm半胱氨酸盐酸盐的连续稀释液以相同的方式进行处理，并且经过由microsoftexcel中的线性回归拟合，提供了与样品中游离硫醇的浓度和405nm处光密度相关的一阶方程，其用于计算辐射样品中游离硫醇的浓度。
针对所有四种测试的化合物，图6显示了在光诱导的硫醇-烯反应过程中游离硫醇消耗的动力学。应该指出，动力学曲线被清楚地分成两个不同的类别，其中β-巯基乙醇和mme-peg5k-sh在照射10秒内反应完成，且两种含半胱氨酸的化合物(半胱氨酸和c2xpc寡肽)则反应慢得多并通过90秒的照射达到接近完成。
还应指出的是，本实验中所用的硫醇-烯反应条件基本上与上述实施例4中的相同，只是此处的反应产物是直链水溶性分子，而不是如实施例4中所形成的共价交联的网状物。图5和图6中的动力学曲线的直接比较显示，含半胱氨酸的交联剂和携带巯基的peg之间的网状物形成速率的差异主要是由于这些类化合物所提供的硫醇官能团的反应性的差异，其中基于半胱氨酸的硫醇在光诱导的硫醇-烯反应中展现出异常缓慢的反应性。
实施例6：通过半胱氨酸介导的硫醇-烯反应破坏鸡蛋溶菌酶。
制备含有1.4mg/ml鸡蛋溶菌酶、6mm直链peg二降冰片烯(mw3.8kda)、0.01％(wt/vol)nap、50mm乙酸钠(ph5.0)和具有12mm浓度硫醇的携带硫醇化合物(具有降冰片烯浓度的化学计量)的50微升溶液，并在打开的1.5mleppendorf管中用385nm光以19mw/cm2从上面照射。携带硫醇的化合物包括半胱氨酸(缓慢反应)或甲氧基peg硫醇(快速反应)。辐射时间为慢反应90秒而快速反应10秒。在选择的条件下，这些照射时间在慢速和快速反应中导致硫醇的完全消耗(图6；实施例5)，并且足以促使共价交联网状物的形成完成，如果如实施例4中使用相应的多臂降冰片烯和携带硫醇的单体的话。
将照射的样品和未照射的对照以约800倍稀释至加载lds凝胶的缓冲液(invitrogen)，并通过sds-page在12％novexnupage凝胶(invitrogen)上分析反应产物，随后进行银染色(silverquest染色试剂盒,invitrogen)。
结果如图7所示。与未处理的对照(泳道"peg-sh,无uv"对"peg-sh,10"uv")相比，使溶菌酶暴露于快速硫醇-烯过程持续完全使peg-硫醇交联的水凝胶光聚合所需的时间，从而导致蛋白质迁移率没有可检测的变化，这表明运输蛋白(溶菌酶)保持完整。反过来，如果硫醇-烯过程缓慢，则运输蛋白暴露于反应持续达到完全网状物形成所需的时间，从而导致大量迁移较慢的蛋白质形式(泳道"cys,无uv"对"cys,90"uv")的出现，这与运输蛋白在一些次级过程中的参与相一致，可能导致3.8kdapeg二降冰片烯的加入，即使在其自然状态的鸡蛋溶菌酶中没有游离硫醇的情况下。
该实施例说明快速和慢速硫醇-烯反应之间的生物正交性的重要差异，其中由更具反应性的硫醇部分(例如甲氧基-peg-硫醇)介导的硫醇-烯过程是真正的生物正交(对缺少游离硫醇的生物大分子无反应性)，并且至少对于一些选定的生物大分子(溶菌酶)而言，该过程由缺乏生物正交性的较慢的基于半胱氨酸的硫醇介导。
实施例7：在光诱导的硫醇-烯反应过程中含半胱氨酸和高半胱氨酸的化合物的游离硫醇基团的消耗速率。
为了比较在光引发的硫醇-烯反应中基于半胱氨酸和高半胱氨酸的硫醇的相对反应性，制备含有6mm直链peg二降冰片烯(mw3.8kda)、0.01％(wt/vol)nap、50mm乙酸钠(ph5.0)和具有12mm浓度硫醇的携带硫醇化合物(具有降冰片烯浓度的化学计量)的200微升溶液，并在平底96孔组织培养板中以385nm的光照在19mw/cm2照射。测试的携带硫醇的化合物包括游离氨基酸半胱氨酸和高半胱氨酸以及合成的含二半胱氨酸的肽"mmpa"和"c2xpc"(氨基酸序列kcgpqgiagqck和calkvlkgc)及其类似物"hcmmpa"和"hc2xphc"(含有高半胱氨酸，而不是半胱氨酸)。在规定的时间点，从反应混合物中取出10微升等分试样，用去离子水稀释12倍，剩余游离硫醇的浓度通过ellman测定法测量，如上述实施例5所述。
在图8a中，比较了半胱氨酸和高半胱氨酸的游离硫醇的消耗动力学，并在图8b中比较了含有二半胱氨酸和二高半胱氨酸的寡肽。含有游离半胱氨酸和二半胱氨酸的肽mmpa和c2xpc的硫醇消耗速率基本上与上述实施例5相同，其在约90秒的照射实现了接近完全的硫醇消耗。游离高半胱氨酸反应明显更快，且在照射20秒内完全消耗(图8a)。含二高半胱氨酸的肽hcmmpa和hc2xphc反应更快，其在仅照射15秒内即可实现完全硫醇消耗。
实施例8：使用二半胱氨酸交联剂和二高半胱氨酸交联剂的硫醇-烯水凝胶的光聚合动力学。
制备含有6％(wt/vol)的4臂20kdapeg四降冰片烯(fairbanks)、0.01％(wt/vol)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸钠(或nap)(fairbanks2)、50mm乙酸钠缓冲液(ph5.0)和6mm二硫醇交联(降冰片烯与硫醇的化学计量比)的100微升样品。二硫醇交联剂包括具有相同序列的合成的含二半胱氨酸的寡肽“mmpa”(氨基酸序列kcgpqgiagqck)或其二高半胱氨酸类似物"hcmmpa"，但用高半胱氨酸替代每个半胱氨酸残基。所有样品一式两份制备和分析。
在水凝胶光聚合的实时动力学之后为在discoveryhr-3流变仪(tainstruments)上具有平行板几何学的原位动态流变学。在19mw/cm2的385nm光通过平板石英板引导通过样品，同时在0.250mm间隙、1％应变和10rad/s在环境温度进行动态应力测量。在聚合后进行应变扫描以验证线性响应方案。之后进行聚合直到剪切储能模量(g')达到平台值(图9)，这表明光聚合反应完成。
数据的检查表明，如果使用二高半胱氨酸肽hcmmpa作为交联剂，则g’在20秒照射内达到平台值，而如果使用二半胱氨酸肽mmpa，则需要显著更长的时间(历经80s)。此外，mmpa交联网状物的g'的平台值显著低于hcmmpa交联网状物的平台值，考虑到所采用的单体几乎相同的化学组成，这是预料不到的。这种差异表明，在含二半胱氨酸的交联剂的情况下，反应如此缓慢以致于在光聚合过程中，所有引发剂在水凝胶网状物完全形成之前即被消耗，而当使用更具反应性的二高半胱氨酸交联剂时，水凝胶完全显影。为了测试这个假设，用10倍更高浓度的引发剂(0.1％nap)重复用mmpa交联剂的光聚合实验。如图9所示，在这种高浓度的引发剂下，mmpa介导的光聚合的总体速率接近于在0.01％nap的hcmmpa介导的过程的总体速率，并且所得网状物的弹性性质几乎相同。然而，这种速率的增加是以单体溶液和任何生物活性物质(例如包囊的蛋白质)暴露于十倍更高浓度的引发剂为代价而发生的，且因此，较高浓度的自由基可能对物质的稳定性具有不利影响。
实施例9：暴露于高半胱氨酸介导的硫醇-烯反应的溶菌酶的sds-page分析。
制备含有1.4mg/ml鸡蛋溶菌酶、6mm直链peg二降冰片烯(mw3.8kda)、0.01％(wt/vol)nap、50mm乙酸钠(ph5.0)和具有12mm浓度硫醇的携带硫醇化合物(具有降冰片烯浓度的化学计量)的50微升溶液，并在打开的1.5mleppendorf管中用385nm光以19mw/cm2从上面照射。携带硫醇的化合物包括半胱氨酸(缓慢反应)或高半胱氨酸(快速反应)。辐射时间为半胱氨酸90秒而高半胱氨酸20秒。在反应选择的条件下，这些照射时间在慢速和快速反应中导致硫醇的完全消耗(图8；实施例7)，并且足以促使光聚合完成，如果如实施例8中使用多臂降冰片烯和携带硫醇的单体的话。此外，以10倍较高浓度的引发剂(0.1％nap)重复半胱氨酸介导的反应，照射10秒钟，以评估由于暴露于导致半胱氨酸介导的光聚合过程中完成网状物形成的条件而引起的运输蛋白损伤的可能性，如上述实施例8中所讨论。
将照射的样品和未照射的对照以约800倍稀释至加载lds凝胶的缓冲液(invitrogen)，并通过sds-page在12％novexnupage凝胶(invitrogen)上进行分析，随后进行银染色(silverquest染色试剂盒,invitrogen)。
结果示于图10。溶菌酶暴露于促使完成的高半胱氨酸介导的反应导致完全挽救由暴露于半胱氨酸介导的反应而引起的破坏作用(图10，比较泳道"cys,90"uv"和"hcys,20"uv")。同时，在基于高半胱氨酸的交联剂(实施例8)的情况下，预期完成网状物形成，但不是在基于半胱氨酸的交联剂的情况下。在后一种情况下，为了促使网状物形成完成，需要引发剂浓度增加十倍(图9，实施例8)，尽管反应时间非常短，但是导致在次级过程中几乎完全消耗了运输蛋白(泳道"cys,10"uv")。
实施例10：光诱导的硫醇-烯反应过程中氧气对游离硫醇基团的消耗速率的影响。
为了评估溶解氧对硫醇在光引发的硫醇-烯反应中反应性的影响，制备含有浓度为6mm的直链peg-二降冰片烯(mw3.5kda)、0.01％(wt/vol)nap和浓度为6mm的peg-二硫醇(mw3.5kda)(即硫醇基团和降冰片烯基团以化学计量比存在)的4ml溶液。然后将溶液分成两个2ml等分试样，并通过将低压氩气流鼓泡通过溶液20分钟(脱气)对等分试样中的一个进行除氧；使用第二个2ml等分试样而不脱气。然后在锥形底96孔聚丙烯板中用385nm光以19mw/cm2照射每种溶液的40μl等分试样。随后，从照射的样品中取出10μl等分试样，用去离子水稀释11倍，并通过ellman测定法测量剩余游离硫醇的浓度，如上述实施例5所述。一式两份收集所有数据点，并根据标准统计技术计算平均值和标准偏差。
在图11中比较了未经处理(“原样”)和经脱气的反应混合物的游离硫醇的消耗动力学。未经处理的(“原样”)反应混合物展现出约3-4秒的显著活化延迟期，此后在另外的4s内快速进行至完成。使反应物溶液脱气完全消除了活化延迟期，并且反应进行得显著更快，在照射的前4秒内接近完成。
实施例11：骨架修饰的影响。
在先前的实施例中，证明了增加侧链长度(例如将碳添加到半胱氨酸中以形成高半胱氨酸)增加硫醇基团对于自由基硫醇-烯化学的活性(参见图8a和8b)。为了评估半胱氨酸骨架(即α-氨基酸部分而不是侧链)的修饰对光引发的硫醇-烯反应中硫醇的反应性的影响，制备含有浓度为6mm的直链peg-二降冰片烯(mw3.5kda)、0.01％(wt/vol)nap和浓度为12mm的4种不同硫醇中的一种(即硫醇基团和降冰片烯基团以化学计量比存在)的4ml溶液。这些硫醇包括半胱氨酸、高半胱氨酸、3-巯基丙酸和半胱胺(参见图12a)。然后在锥形底96孔聚丙烯板中用385nm光以19mw/cm2照射每种溶液的40μl等分试样。随后，从照射的样品中取出10μl等分试样，用去离子水稀释11倍，并通过ellman测定法测量剩余游离硫醇的浓度，如上述实施例5所述。一式两份收集所有数据点，并根据标准统计技术计算平均值和标准偏差。
在图12b中比较了各个化合物的游离硫醇的消耗动力学。从该比较可以明确的是，骨架修饰(在这种情况下移去羧基或胺)可导致与使用高半胱氨酸所观察到的相似的速率增强。
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所有参考文献，诸如出版物、专利、专利申请和公开的专利申请，均通过引用整体并入本文。
虽然为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例的方式对前述发明进行了详细描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，将会进行某些微小的改变和修改。因此，描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。
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