TAFIa抑制剂与纤溶酶原激活剂的联合的制作方法

本发明涉及用于治疗或预防血栓形成或栓塞或其后遗症的药物组合物，其包含特定tafia抑制剂和纤溶酶原激活剂，所述tafia抑制剂与纤溶酶原激活剂联合施用，以及涉及治疗或预防血栓形成或栓塞或其后遗症的方法，其包括将特定tafia抑制剂与纤溶酶原激活剂联合施用于温血动物。

背景技术：

涉及使用纤溶酶原激活剂重新开放血管的血栓溶解疗法对于治疗血栓形成或栓塞诸如急性心肌梗塞、急性期脑梗塞、心源性栓塞或外周动脉或静脉闭塞是有效的。然而，这种疗法不利地引起不良反应诸如出血。为了避免这一点，不能施用足够量的纤溶酶原激活剂，并且由于血栓或栓塞的溶解不足而不能发挥治疗效果。因此，需要不增加纤溶酶原激活剂的剂量或通过减少其剂量而有效地溶解血栓或栓塞的治疗方法。

非专利文献1和2描述了通过联合使用表现出活化的凝血酶可活化的纤维蛋白溶解抑制剂(下文称为“tafia”)抑制活性的化合物和组织型纤溶酶原激活剂(下文称为“t-pa”)带来的抗血栓形成效果。

专利文献1公开了表现出tafia抑制活性的化合物组，并且显示该化合物组可用作针对血栓形成或栓塞的治疗药物。该文献还指出，该化合物组可以与抗凝血剂、抗血小板药物或与纤维蛋白溶解相关的酶等联合使用。

然而，这些文献无一描述表明通过联合使用特定tafia抑制剂和纤溶酶原激活剂带来的协同纤维蛋白溶解活性的测试结果，或暗示测试结果的科学基础。

引文列表

专利文献

专利文献1：国际公开号wo2011/115064

非专利文献

非专利文献1：suzuki等人,thejournalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics,2004,309,607-615

非专利文献2：wang等人,thrombosisandhaemostasis,2007,54-61。

发明概述

技术问题

本发明的目标是提供用于治疗或预防血栓形成或栓塞或其后遗症的药物组合物，其包含特定tafia抑制剂和纤溶酶原激活剂，所述tafia抑制剂与纤溶酶原激活剂联合施用，以及提供治疗或预防血栓形成或栓塞或其后遗症的方法，其包括将特定tafia抑制剂与纤溶酶原激活剂联合施用于温血动物。

解决技术问题的方法

本发明人为了研究通过联合使用tafia抑制剂和纤溶酶原激活剂带来的效果而进行了研究。作为结果，本发明人已经发现，通过联合施用特定tafia抑制剂与纤溶酶原激活剂来发挥协同的纤维蛋白溶解活性。

具体地，本发明涵盖以下方面。

(1)

用于治疗或预防血栓形成或栓塞或其后遗症的药物组合物，其包含式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐和纤溶酶原激活剂：

[式1]

其中r代表氢原子、[(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基]羰基、[1-(异丁酰基氧基)乙氧基]羰基、[1-(2,2-二甲基丙酰基氧基)乙氧基]羰基、{1-[(环己基羰基)氧基]乙氧基}羰基或(1-乙酰氧基乙氧基)羰基，

所述化合物或其药理学上可接受的盐与所述纤溶酶原激活剂联合施用，其中所述药物组合物表现出协同纤维蛋白溶解活性。

(2)

根据(1)所述的药物组合物，其中所述纤维蛋白溶解活性由血浆中的d-二聚体水平计算。

(3)

根据(1)或(2)所述的药物组合物，其中在分开的制剂中分别含有式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐和纤溶酶原激活剂作为活性成分并在相同时间或不同时间施用。

(4)

根据(1)或(2)所述的药物组合物，其中在单一制剂中作为活性成分含有式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐和纤溶酶原激活剂两者并施用。

(5)

根据(1)至(4)中任一项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原激活剂是组织型纤溶酶原激活剂(t-pa)。

(6)

根据(5)所述的药物组合物，其中所述t-pa为阿替普酶。

(7)

根据(1)至(4)中任一项所述的药物组合物，其中所述纤溶酶原激活剂为尿激酶(u-pa)。

(8)

根据(1)至(7)中任一项所述的药物组合物，其中r为氢原子。

(9)

根据(8)所述的药物组合物，其中所述药理学上可接受的盐为对甲苯磺酸盐。

(10)

根据权利要求(1)至(7)中任一项所述的药物组合物，其中r为[1-(异丁酰基氧基)乙氧基]羰基。

(11)

根据(10)所述的药物组合物，其中r为[(1r)-1-(异丁酰基氧基)乙氧基]羰基。

(12)

根据(1)至(11)中任一项所述的药物组合物，其中所述血栓形成或栓塞为急性冠状动脉综合征；静脉血栓栓塞症；外科手术后在心血管系统中发生的血栓形成或栓塞；人工关节置换手术后的血栓形成或栓塞；炎症相关的血管内疾病；外周血管病症来源或相关的疾病；肿瘤相关的疾病；或归因于血栓形成或栓塞的器官病症。

(13)

根据(12)所述的药物组合物，其中所述血栓形成或栓塞为心肌梗塞，稳定型心绞痛或不稳定型心绞痛；深静脉血栓形成或肺栓塞；在血管再血管化、血管成形术、支架置入或旁路手术后在心血管系统中发生的血栓形成或栓塞；在膝关节置换手术或髋关节置换手术后的血栓形成或栓塞；与脓毒症或弥漫性血管内凝血综合征(dic)相关的血管内疾病；外周动脉闭塞(pao)、动脉粥样硬化或糖尿病来源或相关的疾病；与实体癌或血癌相关的疾病；或归因于肺栓塞、脑梗塞或肾梗塞的器官病症。

(14)

根据(1)至(11)中任一项所述的药物组合物，其中所述血栓形成或栓塞为由与体内异物的接触引起的疾病；或由血液和身体外部的医疗装置的接触引起的疾病。

(15)

根据(14)所述的药物组合物，其中所述血栓形成或栓塞是由与医疗装置的接触引起的疾病。

(16)

根据(15)所述的药物组合物，其中所述血栓形成或栓塞为由与关节置换中使用的关节假体、血管导管、血管假体、血管内支架或人工瓣膜的接触引起的疾病。

(17)

根据(14)所述的药物组合物，其中所述血栓形成或栓塞为由血液和心脏手术中使用的泵式氧合器或血液透析中使用的医疗装置之间的接触引起的疾病。

(18)

根据(1)至(11)中任一项所述的药物组合物，其中所述血栓形成或栓塞为心肌梗塞、心绞痛、急性冠状动脉综合征、脑梗塞、深静脉血栓形成、肺栓塞或外周动脉闭塞。

(19)

用于治疗或预防血栓形成或栓塞或其后遗症的方法，

其包括向温血动物联合施用式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐和纤溶酶原激活剂：

[式2]

其中r代表氢原子、[(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基]羰基、[1-(异丁酰基氧基)乙氧基]羰基、[1-(2,2-二甲基丙酰基氧基)乙氧基]羰基、{1-[(环己基羰基)氧基]乙氧基}羰基或(1-乙酰氧基乙氧基)羰基，

其中所述方法表现出协同纤维蛋白溶解活性。

(20)

根据(19)所述的方法，其中所述纤维蛋白溶解活性由血浆中的d-二聚体水平计算。

(21)

根据(19)或(20)所述的方法，其中在分开的制剂中分别含有式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐和纤溶酶原激活剂作为活性成分并在相同时间或不同时间施用。

(22)

根据(19)或(20)所述的方法，其中在单一制剂中作为活性成分含有式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐和纤溶酶原激活剂两者并施用。

(23)

根据(19)至(22)中任一项所述的方法，其中所述纤溶酶原激活剂是组织型纤溶酶原激活剂(t-pa)。

(24)

根据(23)所述的方法，其中所述t-pa为阿替普酶。

(25)

根据(19)至(22)中任一项所述的方法，其中所述纤溶酶原激活剂为尿激酶(u-pa)。

(26)

根据(19)至(25)中任一项所述的方法，其中r为氢原子。

(27)

根据(26)所述的方法，其中所述药理学上可接受的盐为对甲苯磺酸盐。

(28)

根据(19)至(25)中任一项所述的方法，其中r为[1-(异丁酰基氧基)乙氧基]羰基。

(29)

根据(28)所述的方法，其中r为[(1r)-1-(异丁酰基氧基)乙氧基]羰基。

(30)

根据(19)至(29)中任一项所述的方法，其中所述血栓形成或栓塞为急性冠状动脉综合征；静脉血栓栓塞症；外科手术后在心血管系统中发生的血栓形成或栓塞；人工关节置换手术后的血栓形成或栓塞；炎症相关的血管内疾病；外周血管病症来源或相关的疾病；肿瘤相关的疾病；或归因于血栓形成或栓塞的器官病症。

(31)

根据(30)所述的方法，其中所述血栓形成或栓塞为心肌梗塞，稳定型心绞痛或不稳定型心绞痛；深静脉血栓形成或肺栓塞；在血管再血管化、血管成形术、支架置入或旁路手术后在心血管系统中发生的血栓形成或栓塞；在膝关节置换手术或髋关节置换手术后的血栓形成或栓塞；与脓毒症或弥漫性血管内凝血综合征(dic)相关的血管内疾病；外周动脉闭塞(pao)、动脉粥样硬化或糖尿病来源或相关的疾病；与实体癌或血癌相关的疾病；或归因于肺栓塞、脑梗塞或肾梗塞的器官病症。

(32)

根据(19)至(29)中任一项所述的方法，其中所述血栓形成或栓塞为由与体内异物的接触引起的疾病；或由血液和身体外部的医疗装置的接触引起的疾病。

(33)

根据(32)所述的方法，其中所述血栓形成或栓塞是由与医疗装置的接触引起的疾病。

(34)

根据(33)所述的方法，其中所述血栓形成或栓塞为由与关节置换中使用的关节假体、血管导管、血管假体、血管内支架或人工瓣膜的接触引起的疾病。

(35)

根据(32)所述的方法，其中所述血栓形成或栓塞为由血液和心脏手术中使用的泵式氧合器或血液透析中使用的医疗装置之间的接触引起的疾病。

(36)

根据(19)至(29)中任一项所述的方法，其中所述血栓形成或栓塞为心肌梗塞、心绞痛、急性冠状动脉综合征、脑梗塞、深静脉血栓形成、肺栓塞或外周动脉闭塞。

(37)

根据(19)至(36)中任一项所述的方法，其中所述温血动物是人。

发明效果

本发明可以提供用于治疗或预防血栓形成或栓塞或其后遗症的药物组合物，其包含特定tafia抑制剂和纤溶酶原激活剂，所述tafia抑制剂与纤溶酶原激活剂联合施用，以及提供治疗或预防血栓形成或栓塞或其后遗症的方法，其包括将特定tafia抑制剂与纤溶酶原激活剂联合施用于温血动物。

附图说明

[图1]图1是显示对照(盐水)组、化合物a(2.5μg/kg)组、t-pa(0.083、0.042和0.021mg/kg)组以及化合物a(2.5μg/kg)和t-pa(0.021mg/kg)的联合组的各自的7例中的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)的图表。

[图2]图2是显示对照(盐水)组、化合物a(2.5μg/kg)组、t-pa(0.083、0.042和0.021mg/kg)组以及化合物a(2.5μg/kg)和t-pa(0.021mg/kg)的联合组的各自的7例中的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)的平均值(标准误差)以及化合物a(2.5μg/kg)和t-pa(0.021mg/kg)单独施用组与联合组的比较(p值)的图表。

[图3]图3是显示化合物a(2.5μg/kg)和t-pa(0.021mg/kg)单独施用组与联合组通过双向anova的比较的图表。在该图表中，图绘出各个值，并且水平线描绘各组的7例的平均值。

[图4]图4是显示对照(盐水)组、u-pa(30ku/kg)组、化合物a(2.5μg/kg)组以及u-pa(30ku/kg)和化合物a(2.5μg/kg)的联合组的各自8例的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)的图表。

[图5]图5是显示对照(盐水)组、u-pa(30ku/kg)组、化合物a(2.5μg/kg)组以及u-pa(30ku/kg)和化合物a(2.5μg/kg)的联合组的各自8例的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)的平均值(标准误差)以及u-pa(30ku/kg)和化合物a(2.5μg/kg)单独施用组与联合组的比较(p值)的图表。

[图6]图6是显示u-pa(30ku/kg)和化合物a(2.5μg/kg)单独施用组与联合组通过双向anova的比较的图表。在该图表中，图绘出各个值，并且水平线描绘各组的8例的平均值。

具体实施方式

本发明中使用的式(i)代表的化合物：

[式3]

可以通过国际公开号wo2011/115064的小册子中描述的方法或与其等效的方法来产生。

式(i)代表的化合物，其中r为氢原子，即，(2s)-5-氨基-2-{[1-(反-4-甲基环己基)-1h-咪唑-4-基]甲基}戊酸，是表现出tafia抑制活性的化合物。该化合物描述于国际公开号wo2011/115064的小册子中的实施例15(2s形式)中。

式(i)代表的化合物，其中r是[(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基]羰基、[1-(异丁酰基氧基)乙氧基]羰基、[1-(2,2-二甲基丙酰基氧基)乙氧基]羰基、{1-[(环己基羰基)氧基]乙氧基}羰基、(1-乙酰氧基乙氧基)羰基或[(1r)-1-(异丁酰基氧基)乙氧基]羰基，即(2s)-2-{[1-(反-4-甲基环己基)-1h-咪唑-4-基]甲基}-5-({[(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基]羰基}氨基)戊酸、(2s)-5-({[1-(异丁酰基氧基)乙氧基]羰基}氨基)-2-{[1-(反-4-甲基环己基)-1h-咪唑-4-基]甲基}戊酸、(2s)-5-({[1-(2,2-二甲基丙酰基氧基)乙氧基]羰基}氨基)-2-{[1-(反-4-甲基环己基)-1h-咪唑-4-基]甲基}戊酸、(2s)-5-[({1-[(环己基羰基)氧基]乙氧基}羰基)氨基]-2-{[1-(反-4-甲基环己基)-1h-咪唑-4-基]甲基}戊酸、(2s)-5-{[(1-乙酰氧基乙氧基)羰基]氨基}-2-{[1-(反-4-甲基环己基)-1h-咪唑-4-基]甲基}戊酸或(2s)-5-({[(1r)-1-(异丁酰基氧基)乙氧基]羰基}氨基)-2-{[1-(反-4-甲基环己基)-1h-咪唑-4-基]甲基}戊酸)，是通过在体内与酶、胃酸等反应而转化为充当活性成分的(2s)-5-氨基-2-{[1-(反-4-甲基环己基)-1h-咪唑-4-基]甲基}戊酸的前药。所述化合物描述于国际公开号wo2011/115064的小册子中的实施例19、20、22、23、27和32中。

作为式(i)代表的化合物的药理学上可接受的盐的与酸的酸加成盐的实例可以包括：氢卤酸盐诸如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐；无机酸盐诸如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；低级烷烃磺酸盐诸如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐；芳基磺酸盐诸如苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐；有机酸盐诸如乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐和马来酸盐；和氨基酸盐诸如鸟氨酸盐(ornitate)、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。

当式(i)代表的化合物中的r为氢原子时，药理学上可接受的盐优选为氢卤酸盐或芳基磺酸盐，更优选盐酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐，甚至更优选苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐，特别优选对甲苯磺酸盐。

(2s)-5-氨基-2-{[1-(反-4-甲基环己基)-1h-咪唑-4-基]甲基}戊酸对甲苯磺酸盐无水物描述于国际公开号wo2011/115064的小册子中的实施例40中。

与碱的碱加成盐的实例可以包括：碱金属盐诸如钠盐、钾盐和锂盐；碱土金属盐诸如钙盐和镁盐；无机盐诸如铵盐；有机胺盐诸如二苄胺盐、吗啉盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲葡糖胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、环己胺盐、二环己胺盐、n,n'-二苄基乙二胺盐、二乙醇胺盐、n-苄基-n-(2-苯基乙氧基)胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐；和氨基酸盐诸如精氨酸盐。

式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐可以以溶剂化物形式存在。这些溶剂化物也包括在本发明中使用的化合物或其盐中。溶剂化物没有特别限制，只要其为药理学上可接受的即可。具体地，水合物、乙醇化物等是优选的，且水合物是更优选的。

本发明中定义的纤溶酶原激活剂包括t-pa和尿激酶(下文称为“u-pa”)两者。

t-pa还包括重组组织型纤溶酶原激活剂(下文称为“rt-pa”)。

rt-pa的实例包括具有与具有部分氨基酸取代以延长半衰期的天然存在的t-pa和孟替普酶、帕米普酶和那替普酶的氨基酸序列相同的氨基酸序列的阿替普酶。它们都包括在本发明中定义的t-pa中。

在本发明中，短语“联合施用”包括其中分别在分开的制剂中含有式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐和纤溶酶原激活剂作为活性成分并在相同时间或不同时间施用的情况，以及其中在单一制剂中作为活性成分含有式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐和纤溶酶原激活剂并施用的情况。

式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐可以是口服制剂或可以是肠胃外制剂。

口服制剂的实例包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和酏剂。这些形式的药物通常被制备为含有通式(i)代表的化合物或其盐作为主要成分与药学上可接受的添加剂诸如稀释剂、赋形剂或载体相混合的药物组合物。除此之外，药物组合物的制备可以根据常规方法使用根据需要适当地选自任意适当的药学上可接受的粘合剂、崩解剂、润滑剂、溶胀剂、溶胀助剂、包衣剂、增塑剂、稳定剂、抗菌剂、抗氧化剂、着色剂、增溶剂、混悬剂、乳化剂、甜味剂、防腐剂、缓冲剂、湿润剂等的一种或多种物质来进行。

肠胃外制剂的实例包括注射剂、软膏剂、凝胶剂、霜剂、泥敷剂、贴剂、气雾剂、吸入剂、喷雾剂、滴眼剂、滴鼻剂、栓剂和吸入剂。这些形式的药物通常被制备为含有式(i)代表的化合物或其盐作为主要成分与药学上可接受的添加剂诸如稀释剂、赋形剂或载体相混合的药物组合物。除此之外，药物组合物的制备可以根据常规方法使用根据需要适当地选自任意适当的药学上可接受的稳定剂、抗菌剂、增溶剂、湿润剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、胶凝剂、中和剂、缓冲剂、张度剂、表面活性剂、着色剂、增稠剂、润湿剂、填充剂、吸收促进剂、混悬剂、粘合剂等的一种或多种物质来进行。

纤溶酶原激活剂用作注射剂。因此，在使用式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐作为注射剂的情况下，可以在单一制剂中含有式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐和纤溶酶原激活剂作为活性成分并施用。另一方面，在使用式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐作为除注射剂以外的制剂的情况下，可以在分开的制剂中分别含有式(i)代表的化合物或其药理学上可接受的盐和纤溶酶原激活剂作为活性成分并在相同时间或不同时间施用。

式(i)代表的化合物的单一剂量为0.01至5000mg，优选0.1至1000mg，更优选1至200mg。

单独使用的t-pa的单一标准剂量就阿替普酶而言为290,000至435,000i.u./kg、就那替普酶而言为300,000i.u./kg、就孟替普酶而言为275,000i.u./kg和就帕米普酶而言为65,000i.u./kg。单独使用的u-pa的单一标准剂量是60,000至240,000u/天。

然而，通过与式(i)代表的化合物联合使用可以降低纤溶酶原激活剂的剂量。

而且，与纤溶酶原激活剂的单独施用相比，通过式(i)代表的化合物与标准剂量的纤溶酶原激活剂联合使用可以更有效地溶解血栓或栓塞。

在本发明中，纤维蛋白溶解活性可以通过本领域已知的方法、例如通过测量血浆中的d-二聚体水平来计算。

在本发明中，短语“表现出协同纤维蛋白溶解活性”意味着发挥出显著好于通过各自单独施用两种组分带来的总纤维蛋白溶解活性的纤维蛋白溶解活性。是否“表现出协同纤维蛋白溶解活性”可以通过双向anova来证实。

本发明的药物组合物和方法可用于治疗或预防血栓形成或栓塞或其后遗症。

“血栓形成或栓塞”的具体实例可以包括：急性冠状动脉综合征；静脉血栓栓塞症；外科手术后在心血管系统中发生的血栓形成或栓塞；人工关节置换手术后的血栓形成或栓塞；炎症相关的血管内疾病；外周血管病症来源或相关的疾病；肿瘤相关的疾病；和归因于血栓形成或栓塞的器官病症。其更具体的实例可以包括：心肌梗塞，稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛；深静脉血栓形成和肺栓塞；在血管再血管化、血管成形术、支架置入或旁路手术后在心血管系统中发生的血栓形成或栓塞；在膝关节置换手术或髋关节置换手术后的血栓形成或栓塞；与脓毒症或弥漫性血管内凝血综合征(dic)相关的血管内疾病；外周动脉闭塞(pao)、动脉粥样硬化或糖尿病来源或相关的疾病；与实体癌或血癌相关的疾病；和归因于肺栓塞、脑梗塞或肾梗塞的器官病症。

“血栓形成或栓塞”的其它具体实例可以包括：由与体内异物的接触引起的疾病；以及由血液和身体外部的医疗装置的接触引起的疾病。其更具体的实例可以包括：由与医疗装置的接触引起的疾病；以及由血液和心脏手术中使用的泵式氧合器或血液透析中使用的医疗装置之间的接触引起的疾病。其进一步具体实例可以包括由与关节置换中使用的关节假体、血管导管、血管假体、血管内支架或人工瓣膜的接触引起的疾病。

“血栓形成或栓塞”的更优选的具体实例可以包括心肌梗塞、心绞痛、急性冠状动脉综合征、脑梗塞、深静脉血栓形成、肺栓塞和外周动脉闭塞。

本发明的方法可以用于温血动物(特别是人)。

实施例

在下文中，将参照实施例具体描述本发明。然而，本发明无论如何不限于这些方法。

(实施例1)

对于与t-pa的联合使用的测试

1.施用溶液的制备

(1)将(2s)-5-氨基-2-{[1-(反-4-甲基环己基)-1h-咪唑-4-基]甲基}戊酸对甲苯磺酸盐无水物(下文称为“化合物a“)溶解于盐水中以制备1.0mg/ml溶液。使用盐水将溶液进一步稀释至0.0050mg/ml。化合物a的剂量以游离形式表示(转化因子：0.6301)。

(2)将t-pa(阿替普酶(用于注射的activacin(注册商标)6,000,000)，kyowahakkokirinco.,ltd.)用其中包括的注射用水调节至600,000i.u./ml(其被定义为1.0mg/ml)。使用盐水将所得溶液进一步稀释至0.17、0.083和0.042mg/ml。

(3)将0.0050mg/ml化合物a溶液与等量的盐水或0.042mg/mlt-pa溶液混合，以分别制备用于化合物a(2.5μg/kg)组和联合组的施用溶液。将0.17、0.083和0.042mg/mlt-pa溶液与等量的盐水混合，以分别制备用于t-pa(0.083、0.042和0.021mg/kg)组的施用溶液。

(4)将4ml盐水添加至10ml组织因子(标准品)(dade(注册商标)innovin(注册商标)，sysmexcorp.)以制备组织因子溶液。

2.向大鼠的施用和纤维蛋白溶解活性的测量

(1)十周龄雄性wistar大鼠(japanslc,inc.)从实验前一天起禁食。基于实验当天早晨测量的其体重，将7只大鼠分配至6组中的每一组：对照(盐水)组、化合物a(2.5μg/kg)组、t-pa(0.021、0.042和0.083mg/kg)组以及化合物a(2.5μg/kg)和t-pa(0.021mg/kg)的联合组。

(2)这些大鼠通过施用100mg/kg硫喷妥钠(ravonal(注册商标)，mitsubishitanabepharmacorp.)来麻醉，并将组织因子溶液从颈静脉以7.5ml/kg/小时连续施用20分钟。开始施用组织因子后25分钟，从颈静脉迅速施用各组的施用溶液。开始施用组织因子后45分钟，将血液从颈静脉收集至预先补充有柠檬酸的注射器中，并通过离心制备血浆。使用因子稀释剂(lsimediencecorp.)将血浆稀释20倍。使用lpia-aced-d二聚体ii和acltop500cts(instrumentationlaboratory)测量d-二聚体水平，并将其用作纤维蛋白溶解活性的指标(图1)。

3.统计分析

(1)在统计分析中使用microsoftexcel2003和sassystemrelease8.2。

(2)对于各组，计算d-二聚体水平的基本统计学(平均值和标准误差)并将其用作关于纤维蛋白溶解活性的结果(表1)。

(3)化合物a(2.5μg/kg)组与对照(盐水)组的比较通过studentt检验来进行。将计算的p值四舍五入，并且显示小数点后四位，并且显著性水平被设定为双侧5％。作为结果，相对于对照(盐水)组，化合物a(2.5μg/kg)组没有表现出显著优异的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(p=0.1431)。

(4)t-pa(0.021、0.042和0.083mg/kg)组与对照(盐水)组的比较通过参数dunnett检验来进行。将计算的p值四舍五入，并且显示小数点后四位，并且显著性水平被设定为双侧5％。

作为结果，相对于对照(盐水)组，t-pa(0.021mg/kg)组没有表现出显著优异的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(p=0.3080)。

另一方面，相对于对照(盐水)组，t-pa(0.042和0.083mg/kg)组表现出显著优异的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(p<0.0001)。

(5)化合物a(2.5μg/kg)组或t-pa(0.021mg/kg)单独施用组与联合组的比较通过参数dunnett检验进行。将计算的p值四舍五入，并且显示小数点后四位，并且显著性水平被设定为双侧5％。作为结果，相对于两个单独施用组，联合组表现出显著优异的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(p<0.0001)(图2)。

(6)化合物a(2.5μg/kg)组或t-pa(0.021mg/kg)单独施用组与联合组的比较通过双向anova进行。作为结果，在联合组中证实了协同纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(图3)。

(7)通过剂量-响应相关性的线性回归，使用单独的数据，对于对照(盐水)组和t-pa(0.021、0.042和0.083mg/kg)组反向估计出显示与联合组的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)相等的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)的单独的t-pa的剂量。作为结果，据反向估计，化合物a(2.5μg/kg)和t-pa(0.021mg/kg)的联合组的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)对应于t-pa(0.054mg/kg(95%置信区间：0.049至0.058mg/kg))的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)。

这些结果表明，通过与化合物a联合使用，发挥纤维蛋白溶解效果所必需的纤溶酶原激活剂的剂量降低至单独施用剂量的36％至43％。

(实施例2)

对于与u-pa的联合使用的测试

1.施用溶液的制备

(1)将u-pa(尿激酶注射液"fuji"(注册商标)60,000,wakamotoco.,ltd.)用注射用水调节至90ku/ml。

(2)将化合物a溶解于盐水中以制备1.0mg/ml溶液。使用盐水将溶液进一步稀释至0.0050mg/ml。化合物a的剂量以游离形式表示(转化因子：0.6301)。

(3)将适当量的盐水、90ku/mlu-pa溶液和0.0050mg/ml化合物a溶液混合，以分别制备用于u-pa(30ku/kg)组、化合物a(2.5μg/kg)组以及u-pa(30ku/kg)和化合物a(2.5μg/kg)的联合组的施用溶液。

(4)将5ml盐水添加至10ml组织因子(标准品)(dade(注册商标)innovin(注册商标)，sysmexcorp.)以制备组织因子溶液。

2.向大鼠的施用和纤维蛋白溶解活性的测量

(1)十一周龄雄性wistar大鼠(japanslc,inc.)从实验前一天起禁食。基于实验当天早晨测量的其体重，将8只大鼠分配至4组中的每一组：对照(盐水)组、u-pa(30ku/kg)组、化合物a(2.5μg/kg)组以及u-pa(30ku/kg)和化合物a(2.5μg/kg)的联合组。

(2)这些大鼠通过施用100mg/kg硫喷妥钠(ravonal(注册商标)，mitsubishitanabepharmacorp.)来麻醉，并将组织因子溶液从颈静脉以7.5ml/kg/小时连续施用20分钟。开始施用组织因子后25分钟，从颈静脉迅速施用各组的施用溶液。开始施用组织因子后45分钟，将血液从颈静脉收集至预先补充有柠檬酸的注射器中，并通过离心制备血浆。使用因子稀释剂(lsimediencecorp.)将血浆稀释20倍。使用lpia-aced-d二聚体ii和acltop500cts(instrumentationlaboratory)测量d-二聚体水平，并将其用作纤维蛋白溶解活性的指标(图4)。

3.统计分析

(1)在统计分析中使用microsoftexcel2010和sassystemrelease9.2。

(2)对于各组，计算d-二聚体水平的基本统计学(平均值和标准误差)并将其用作关于纤维蛋白溶解活性的结果(表2)。

(3)u-pa单独施用组与对照组的比较、化合物a单独施用组与对照组的比较以及联合组与对照组的比较通过studentt检验进行。将计算的p值四舍五入，并且显示小数点后四位，并且显著性水平被设定为双侧5％。

作为结果，相对于对照组，u-pa单独施用组表现出显著优异的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(p=0.0476)。另外，相对于对照组，化合物a单独施用组表现出显著优异的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(p=0.0019)。此外，相对于对照组，联合组表现出显著优异的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(p<0.0001)。

(4)u-pa单独施用组与联合组的比较以及化合物a单独施用组与联合组的比较通过参数dunnett检验进行。将计算的p值四舍五入，并且显示小数点后四位，并且显著性水平被设定为双侧5％。

作为结果，相对于u-pa单独施用组，联合组表现出显著优异的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(p<0.0001)。另外，相对于化合物a单独施用组，联合组表现出显著优异的纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(p<0.0001)(图5)。

(5)u-pa单独施用组、化合物a单独施用组和联合组间的比较通过双向anova进行。作为结果，在联合组中证实了协同纤维蛋白溶解活性(d-二聚体水平)(图6)。

产业适用性

本发明显示特定tafia抑制剂与纤溶酶原激活剂的联合施用表现出协同纤维蛋白溶解活性。因此，本发明的药物组合物和方法可用于治疗或预防血栓形成或栓塞或其后遗症。