用于治疗癌症的P38MAPK的抑制的制作方法

背景技术：
：：本发明是在国立卫生研究院授予的批准号5r01ca155243和德克萨斯州癌症预防和研究所授予的批准号rp-130485的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。1.发明领域本发明一般涉及分子生物学和医学领域。更具体地，它涉及治疗癌症例如前列腺癌、乳腺癌和白血病的组合物和方法。2.相关技术描述前列腺癌前列腺癌(pca)进展为转移性疾病占男性所有癌症相关死亡的>10％。雄激素剥夺疗法(adt)仍然是pca的主要治疗方法。虽然这导致最初的肿瘤消退，但由于促进肿瘤细胞生长的雄激素非依赖性机制的出现，这些患者中的大多数变得不符合该治疗方案。此外，虽然大多数最初诊断的pcas是腺泡腺癌，其表现出雄激素受体(ar)及其靶基因前列腺特异性抗原(psa)的表达升高，但是相当大比例的患者呈现非典型临床特征，并且其特征在于ar和psa的明显缺失，相反，显示出对神经内分泌(ne)分化标志物如嗜铬粒蛋白a，突触素，cd56和神经元特异性烯醇化酶(nse)的免疫反应性。虽然这些arpsa阴性的神经内分泌前列腺癌(nepc)(或小细胞前列腺癌)在初步诊断时很少见，但它们占adt后的晚期复发性去势抵抗性前列腺癌的10-30％(crpc，高级gleason)(aggarwal等，2014)。这些变体“ar阴性pca”或nepc极具侵略性，具有雄激素非依赖性、转移性和治疗抗性，其5年总生存率为12.6％，从而将其归类为所有pca中最致命的亚组(parimi等，2014)。目前，没有针对这类患者的靶向治疗，并且它们的ar阴性呈现出主要的治疗挑战。长期以来已经认识到雄激素和ar在前列腺中表现出关键的肿瘤抑制作用。事实证明，前列腺上皮细胞中ar的基因消融促进了侵袭性前列腺肿瘤的发展(niu等，2008)，而用sirna靶向ar已经显示通过stat3激活增强巨噬细胞募集来促进转移(izumi等，2013)。此外，ar表达在转移性激素抗性pca中显着降低(davis等，2006)，而在一些晚期pca中发现ar信号传导严重减弱(tomlins等，2007)。总的来说，这种观点认为ar和ar信号的恢复确实可以对特征在于ar或其下游分子靶标缺失的选择的pca患者(例如那些被诊断患有nepc/小细胞前列腺癌，甚至是adt后显示ne分化的晚期腺癌)产生有益效果。新出现的证据表明在前列腺肿瘤(pcascs)中存在雄激素不敏感的干细胞样细胞亚群，其可能有助于肿瘤复发，转移进展和治疗抵抗(castillo等，2014)。然而，这些细胞的起源和控制其干细胞样行为的分子因素仍然知之甚少，尽管有人认为pcosc可能是ne的性质(因此也是ar/psa-/lo)(santoni等，2014)。在最近一篇旨在表征来自pca外植体的癌干细胞(csc)库的报告中，发现耐药球体培养物特别富集细胞角蛋白(paranjape等，2014)，表明它们的上皮起源。此外，在雄激素非依赖性pca细胞以及去势的pten条件性敲除小鼠的前列腺肿瘤中，zeb1(一种与干细胞特性相关的上皮-间充质-转换(emt)转录因子)的表达升高提示pcasc可能是emt的产物(li等，2014)。emt是指复杂的细胞重编程过程，其促进分化的上皮细胞转变成松散组织的，高迁移性和侵入性的间充质细胞。尽管存在多种建议，emt途径的异常激活可能促进pca的发展，并可能有助于其进展至晚期治疗抵抗状态(sun等，2012)，决定emt/csc的精确分子机制中性转变为改变的ar信号传导以及雄激素非依赖性，以及pca进展中干细胞的来源，仍然很大程度上未定义。通过使用psa启动子驱动的慢病毒egfp报告系统，先前已证明在原发性前列腺癌组织和已建立的pca细胞系中，psa-/lo细胞代表功能上独特的亚群，其选择性地富集抗去势pcasc的特征性细胞(qin等，2012)。这种未分化的细胞库表达经典的pcasc标记物(aldh，cd44，α2β1-整联蛋白)，并经历不对称的细胞分裂以产生前列腺上皮细胞的psa+/分化的对应物。此外，这些细胞具有升高的克隆形成潜力和肿瘤增殖能力，从而突出了有效靶向该pca细胞亚群的潜在临床益处。然而，缺乏消除这些前列腺癌干细胞样细胞的来源/产生的治疗方法，肿瘤细胞亚群严重决定肿瘤的发生，复发，去势抵抗和转移进展。乳腺癌超过90％的癌症相关死亡归因于转移而不是原发性肿瘤(gupta等，2006)。在癌症中，转移能力取决于潜在胚胎程序的异常激活，称为上皮-间质转化(emt)(tsai等，2013)。emt是一个复杂的过程，需要将分化的上皮细胞重编程为间充质表型，强调e-钙粘蛋白的缺失，肌动蛋白细胞骨架的重组，间充质标记的获得以及增强的迁移和侵袭潜力。此外，肿瘤细胞中emt的诱导赋予自我更新能力(mani等人，2008)。累积地，这些特性导致从头生成能够导航/完成转移级联并在远端部位播种新的肿瘤集落的转移能力的癌干细胞(csc)。最近，forkhead转录因子foxc2被鉴定为多个emt程序的关键下游效应子，与emt诱导刺激的性质无关(mani等，2007)。此外，发现foxc2对于emt诱导后获得csc特性、化学疗法耐药性和转移能力是必要且充分的(hollier等，2013)。重要的是，foxc2表达在易于转移的基底样和低紧密连接蛋白的csc富集的乳腺癌以及从用常规疗法治疗的乳腺癌患者中分离的残留肿瘤细胞(其显示间充质和干细胞特征)中升高。总之，这些发现强调了foxc2作为转移性和治疗抗性乳腺癌的潜在治疗靶点的临床相关性。然而，将这些发现转化为有效的治疗方式是有问题的，因为foxc2是一种转录因子，从药理学的角度来看-阻碍了合理的药物设计。因此，鉴定foxc2功能的可药物上游调节剂可能是开发针对转移性乳腺癌的有效疗法的关键。然而，尚未确定可转发上游激酶，其介导foxc2磷酸化并控制其在转移进展期间的多效性作用。白血病bcr-abl是bcr-abl阳性(bcr-abl+；也称为费城染色体阳性)b细胞急性淋巴细胞白血病(all)中的关键致癌基因，编码具有持续高酪氨酸激酶活性的致癌融合蛋白。在bcr-abl+all中，不同的染色体断裂点产生具有不同分子量的bcr-abl同种型。p190bcr-abl同种型占所有病例的约30％，并预测成人和儿童的不良预后。在引入酪氨酸激酶抑制剂(tki)之前，患有bcr-abl+all的患者用化学疗法治疗但结果不佳。在首次完全缓解期间向所有患者提供同种异体干细胞移植。然而，干细胞移植与毒性相关并且受到合适供体的可用性的限制。包括伊马替尼(tki原型)在一线治疗中彻底改变了bcr-abl+all的治疗方法，其结果与干细胞移植相当，但毒性低得多。不幸的是，伊马替尼耐药性已成为一项重大挑战。bcr-abl的伊马替尼结合域中的遗传突变或独立于基因突变的各种机制促进对伊马替尼的抗性并随后引起疾病复发。导致伊马替尼耐药起源的非遗传机制非常迅速地产生并且可能引起突变介导的抗性。最近，证实了bcr-abl+all中新的抗原性的非遗传机制，即伊马替尼诱导的间充质干/基质细胞(msc)介导的抗性。结果发现，伊马替尼和其他tki就像一把双刃剑：一方面，它们可以杀死大量白血病细胞，是治疗bcr-abl+白血病(包括bcr-abl+all)(目标效应)必不可少的；另一方面，它们诱导msc中的结构和功能变化，并使msc能够为白血病细胞提供替代的存活信号(脱靶效应)。抑制bcr-abl信号传导和激活替代存活信号传导驱动白血病细胞转换信号以存活。伊马替尼诱导的msc介导的保护在治疗过程的早期开始，这使得白血病细胞能够产生其他类型的抗性，包括与bcr-abl基因突变相关的抗性。因此，开发用于bcr-abl阳性白血病的疗法存在未满足的需求。技术实现要素：本公开的实施方案提供用于治疗受试者中的癌症的方法和组合物。在第一个实施方案中，提供了治疗受试者的癌症的方法，包括给受试者施用有效治疗量的：(a)p38mapk抑制剂；和(b)抗癌疗法，其中所述受试者被鉴定为具有相对于参考水平表达升高水平的foxc2的癌细胞。在一些方面，受试者是人受试者。在某些方面，治疗包括抑制原发性肿瘤细胞的生长，抑制转移的形成，抑制转移瘤的生长，杀死循环癌细胞，抑制癌干细胞的生长和/或存活，诱导缓解，延长缓解或抑制复发。在一些方面，治疗包括抑制癌干细胞的生长和/或存活。在一些方面，相对于在施用p38mapk抑制剂和抗癌疗法之前的表达，癌干细胞具有降低的n-钙粘蛋白，iii型胶原蛋白，纤连蛋白，波形蛋白，slug，zeb1或foxc2的表达。在某些方面，癌症是口腔癌，口咽癌，鼻咽癌，呼吸癌，泌尿生殖系统癌，胃肠癌，中枢或外周神经系统组织癌，内分泌或神经内分泌癌或造血系统癌，神经胶质瘤，肉瘤，癌，淋巴瘤，黑色素瘤，纤维瘤，脑膜瘤，脑癌，口咽癌，鼻咽癌，肾癌，胆道癌，嗜铬细胞瘤，胰岛细胞癌，li-fraumeni肿瘤，甲状腺癌，甲状旁腺癌，垂体瘤，肾上腺肿瘤，成骨肉瘤，i型和ii型多发性神经内分泌，乳腺癌，肺癌，头颈癌，前列腺癌，食道癌，气管癌，肝癌，膀胱癌，胃癌，胰腺癌，卵巢癌，子宫癌，宫颈癌，睾丸癌，结肠癌，直肠癌或皮肤癌。在特定方面，癌症是前列腺癌。在一些方面，前列腺癌是雄激素非依赖性的。在某些方面，前列腺癌是抗去势的。在一些方面，相对于施用p38mapk抑制剂和抗癌疗法之前，受试者具有减少数量的癌干细胞。在某些方面，癌干细胞表达一种或多种选自aldh，cd44，α2β-整联蛋白，bmi1和sox2的标志物。在一些方面，癌干细胞不表达雄激素受体和/或前列腺特异性抗原(psa)。在某些方面，抗癌疗法是化学疗法，放射疗法，基因疗法，手术，激素疗法，抗血管生成疗法或细胞因子疗法。在一些方面，激素疗法是雄激素-受体抑制剂。在某些方面，雄激素受体抑制剂是恩杂鲁胺。在一个具体方面，化学疗法是多西紫杉醇。在一些方面，p38mapk抑制剂是sb203580，sb203580盐酸，sb681323(dilmapimod)，ly2228820二甲磺酸盐，birb796(doramapimod)，bms-582949，pamapimod，gw856553，arry-797al8697，amg548，cmpd-1，eo1428，jx401，rwj67657，ta01，ta02，vx745，dbm1285二盐酸盐，ml3403，sb202190，sb239063，sb706504，scio469盐酸盐，skf86002二盐酸盐，sx011，tak715，vx702或ph-797804。在特定方面，p38mapk抑制剂是sb203580。在一些方面，p38mapk抑制剂是sb203580，并且抗癌疗法是恩杂鲁胺。在其他方面，p38mapk抑制剂是sb203580，抗癌疗法是多西紫杉醇。在某些方面，抗癌疗法和/或p38mapk抑制剂通过静脉内，腹膜内，气管内，肿瘤内，肌肉内，内窥镜，病灶内，经皮，皮下，区域性或通过直接注射或灌注施用。在一些方面，施用抗癌疗法和/或p38mapk抑制剂包括局部、区域性或全身施用。在其他方面，基本上同时施用抗癌疗法和p38mapk抑制剂。在某些方面，在p38mapk抑制剂之前施用抗癌疗法。在某些方面，在p38mapk抑制剂后施用抗癌疗法。在某些方面，抗癌疗法和/或p38mapk抑制剂施用两次或更多次。在某些方面，该方法还包括施用至少一种其他抗癌疗法。在一些方面，施用超过一种p38mapk抑制剂。在一些方面，癌症对第一种抗癌疗法具有抗性。在某些方面，第一种抗癌疗法是化学疗法或放射疗法。在另一个实施方案中，提供了包含p38mapk抑制剂和抗癌疗法的药物组合物，其可用于治疗已经确定相对于参考水平具有升高的foxc2表达的癌症患者。在一些方面，p38mapk抑制剂是sb203580。在某些方面，抗癌疗法是恩杂鲁胺或多西紫杉醇。在另一个实施方案中，提供了预测对患有癌症的患者中的与抗癌疗法组合的p38mapk抑制剂的反应的方法，包括检测所述患者的癌细胞中foxc2的表达水平，其中如果癌细胞相对于参考水平具有升高的foxc2表达，则预测患者对与抗癌疗法组合的p38mapk抑制剂具有有利的反应。在某些方面，对与抗癌疗法组合的p38mapk抑制剂的有利反应包括减小肿瘤大小或负荷，阻断肿瘤生长，减少肿瘤相关疼痛，减少癌症相关病理学，减少癌症相关症状，癌症无进展，无疾病间隔期增加，进展时间延长，缓解诱导，转移减少或患者存活率增加。在另一个实施方案中，提供了治疗受试者的乳腺癌转移的方法，包括以有效治疗的量向所述受试者施用p38丝裂原活化蛋白激酶(mapk)抑制剂。在一些方面，受试者是人受试者。在某些方面，治疗包括抑制转移的形成，抑制转移的生长，或杀死循环的乳腺癌细胞。在一些方面，治疗不包括抑制原发性肿瘤细胞的生长。在一些方面，循环乳腺癌细胞是癌干细胞。在特定方面，癌干细胞是cd44高和cd24低。在一些方面，乳腺癌低紧密连接蛋白的乳腺癌。在某些方面，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在一些方面，乳腺癌转移是在肺中。在某些方面，该方法还包括施用至少一种其他抗癌疗法。在一些方面，抗癌疗法是化学疗法，放射疗法，基因疗法，手术，激素疗法，抗血管生成疗法或细胞因子疗法。在特定方面，激素疗法是雌激素受体调节剂。例如，雌激素受体调节剂是他莫昔芬或来曲唑。在一些方面，受试者先前已接受放射疗法，化学疗法，免疫疗法，分子靶向疗法或已经手术切除肿瘤。在某些方面，相对于施用p38mapk抑制剂之前，受试者的foxc2表达降低。在一些方面，相对于施用p38mapk抑制剂之前，受试者具有减少的癌干细胞数量。在某些方面，相对于施用p38mapk抑制剂之前，受试者在foxc2的丝氨酸367处的磷酸化降低。在一些方面，p38mapk抑制剂是sb203580，sb203580盐酸，sb681323(dilmapimod)，ly2228820二甲磺酸盐，birb796(doramapimod)，bms-582949，pamapimod，gw856553，arry-797al8697，amg548，cmpd-1，eo1428，jx401，rwj67657，ta01，ta02，vx745，dbm1285二盐酸盐，ml3403，sb202190，sb239063，sb706504，scio469盐酸盐，skf86002二盐酸盐，sx011，tak715，vx702或ph-797804。在特定方面，p38mapk抑制剂是sb203580。在一些方面，p38mapk抑制剂是sb203580，并且抗癌疗法是化学疗法。在某些方面，p38mapk抑制剂是sb203580，并且抗癌疗法是激素疗法。在某些方面，抗癌疗法和/或p38mapk抑制剂通过静脉内，腹膜内，气管内，肿瘤内，肌肉内，内窥镜，病灶内，经皮，皮下，区域性或通过直接注射或灌注施用。在一些方面，施用抗癌疗法和/或p38mapk抑制剂包括局部，区域性或全身施用。在某些方面，基本上同时施用抗癌疗法和p38mapk抑制剂。在一些方面，在p38mapk抑制剂之前施用抗癌疗法。在某些方面，在p38mapk抑制剂后施用抗癌疗法。在一些方面，抗癌疗法和/或p38mapk抑制剂施用两次或更多次。在一些方面，施用超过一种p38mapk抑制剂。在一些方面，乳腺癌转移对第一抗癌疗法具有抗性。在某些方面，第一种抗癌疗法是化学疗法或放射疗法。在另一个实施方案中，提供了包含p38mapk抑制剂的药物组合物，其可用于治疗患有乳腺癌转移的癌症患者。在一些方面，p38mapk抑制剂是sb203580。在某些方面，组合物还包含抗癌治疗剂。在一些方面，抗癌治疗剂是化学疗法，基因疗法，激素疗法，抗血管生成疗法或细胞因子疗法。在某些方面，抗癌治疗剂是化学疗法。在某些方面，抗癌治疗剂是激素疗法。另一个实施方案提供了治疗受试者中bcr-abl相关病症的方法，包括给予所述受试者有效量的p38丝裂原活化蛋白激酶(mapk)抑制剂，糖皮质激素受体激动剂和酪氨酸激酶抑制剂。治疗这种疾病。在特定方面，所述受试者是人受试者。在一些方面，治疗包括抑制原发性肿瘤细胞的生长，抑制转移的形成，抑制转移瘤的生长，杀死循环癌细胞，抑制癌干细胞的生长和/或存活，诱导缓解，延长缓解或抑制复发。在特定方面，治疗包括抑制间充质干细胞介导的tki抗性。在一些方面，bcr-abl相关病症是癌症。在某些方面，癌症是白血病或淋巴瘤。在特定方面，白血病是急性淋巴细胞白血病(all)或慢性髓性白血病(cml)。在某些方面，tki选自伊马替尼，达沙替尼，尼罗替尼，博舒替尼，普纳替尼，巴非替尼，saracatinib，tozasertib和rebastinib。在某些方面，tki是伊马替尼或达沙替尼。在一些方面，糖皮质激素受体激动剂是地塞米松，皮质醇，可的松，泼尼松龙，泼尼松，甲基强的松龙，松精酮，氢化可的松或皮质酮。在特定方面，糖皮质激素受体是地塞米松。在某些方面，p38mapk抑制剂是sb203580，sb203580盐酸，sb681323(dilmapimod)，ly2228820二甲磺酸盐，birb796(doramapimod)，bms-582949，pamapimod，gw856553，arry-797al8697，amg548，cmpd-1，eo1428，jx401，rwj67657，ta01，ta02，vx745，dbm1285二盐酸盐，ml3403，sb202190，sb239063，sb706504，scio469盐酸盐，skf86002二盐酸盐，sx011，tak715，vx702或ph-797804。在特定方面，p38mapk抑制剂是sb203580。在特定方面，p38mapk抑制剂是sb203580，糖皮质激素受体是地塞米松，tki是伊马替尼。在其他方面，p38mapk抑制剂是sb203580，糖皮质激素受体是地塞米松，tki是达沙替尼。在一些方面，p38mapk抑制剂，糖皮质激素受体激动剂和/或tki通过静脉内，腹膜内，气管内，肿瘤内，肌肉内，内窥镜，病灶内，经皮，皮下，区域性或通过直接注射或灌注施用。在某些方面，施用包括局部，区域性或全身施用。在一些方面，糖皮质激素受体，tki和p38mapk抑制剂基本上同时施用。在某些方面，糖皮质激素受体和/或tki在p38mapk抑制剂之前施用。在一些方面，糖皮质激素受体和/或tki在p38mapk抑制剂后施用。在特定方面，糖皮质激素受体，tki和/或p38mapk抑制剂施用两次或更多次。在一些方面，施用超过一种p38mapk抑制剂。在某些方面，bcr-abl相关病症对第一种抗癌疗法具有抗性。在一些方面，第一种抗癌疗法是tki。在一些方面，该方法还包括施用至少一种其他抗癌疗法。在某些方面，抗癌疗法是化学疗法，放射疗法，基因疗法，手术，激素疗法，抗血管生成疗法或细胞因子疗法。另一个实施方案提供了药物组合物，其包含p38mapk抑制剂、糖皮质激素受体激动剂和tki，其可用于治疗患有bcr-abl相关病症的患者。在一些方面，p38mapk抑制剂是sb203580。在某些方面，糖皮质激素受体激动剂是地塞米松。在某些方面，tki是伊马替尼或达沙替尼。在一些方面，bcr-abl相关病症是all。根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解，详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改根据本说明书对于本领域技术人员将变得显而易见。附图的简要说明以下附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。前列腺癌图1a-1i：psa-/lopca干细胞样细胞以及雄激素非依赖性pca细胞系表现出升高的foxc2表达和限定emt/csc表型的关键特性。(a)左图显示facs图，表示从lncap细胞分选gfp+(psa+)和gfp10(psa-/lo)级分。右图显示了分选细胞的形态和gfp荧光。(b)来自分选后立即分析的lncap细胞的分选的psa+和psa-/lo级分上的foxc2，以及关键的前列腺-上皮-分化-(pd)，神经内分泌-分化-(ne)，emt-和干细胞(sc)相关标记的qrtpcr分析。y轴表示hprt标准化mrna表达的倍数变化(n＝3；误差条表示sem)。(c)在分选的psa+和psa-/lo级分上对foxc2和其他指示的标记物进行免疫印迹。(d)foxc2和指示分选的psa+和psa-/lo细胞中的标志物的if(比例尺＝100μm；dapi)。(e)与lncap细胞相比，pc3和du145pca细胞中foxc2和其他指定标志物的qrtpcr分析。y轴代表与lncap细胞相比，hprt标准化mrna表达的倍数变化(n＝3；误差条表示sem)。(f)上述细胞中foxc2和其他指定标志物的免疫印迹(***p<0.001)。(g)在lncap和du145细胞中分析cd44(apc)和cd24(pe)表面标志物表达的代表性facs图。(h)d中显示的facs分析的定量(n＝3；误差条表示sem)。(i)前列腺球的定量(n＝5；误差条表示sem；***p<0.001)。图2a-2j：foxc2代表通常由pca细胞中的多个emt-诱导物上调的关键收敛因子，并且其表达与与不良临床预后相关的复发性和高gleason评分前列腺肿瘤相关。(a)稳定过表达emt转录因子-zebl和snail后lncap细胞的形态学。(b)稳定敲低zeb1和snail后du145细胞的形态学(a，b：比例尺＝100μm。(c，e)qrtpcr分析2a和2b中指示的标记。y轴代表与载体对照细胞相比，hprt标准化的mrna表达的倍数变化(n＝3；误差条表示sem)。(d，f)所示细胞系中各种标记物的免疫印迹。(g)复发与非复发的foxc2表达水平来自gds4109geo数据库的复发性临床pca数据。(h)。来自gse17356(h)和tcga(i)数据库的不同gleason评分的前列腺肿瘤中的foxc2表达水平。(j)通过ihc分析的各种患者pca组织中foxc2蛋白表达的定量(相应的图像显示在图8中；bph：良性前列腺增生，pin：前列腺上皮内瘤形成，g7：gleason7)。图3a-30：foxc2是赋予emt/csc特征以及pca细胞中雄激素非依赖性/药物抗性的转变所必需且足够的。(a)上图显示foxc2过表达后lncap细胞的形态；下图显示了psa表达的降低(在相同的视野中)，这是由psa启动子下游克隆的gfp表达降低所推断的(比例尺＝100μm)。(b)针对指示标记的qrtpcr分析。y轴表示与载体对照细胞相比hprt标准化mrna表达的倍数变化(n＝3；误差条表示sem)。(c)对指定细胞系中的各种标记物进行免疫印迹。(d)前列腺球的定量(n＝5；误差条表示sem；**p<0.01)。(e，f)使用mts测定法在用恩杂鲁胺(e)或多西紫杉醇(f)处理的过表达foxc2的lncap细胞中定量细胞存活。数据表示为490nm处的吸光度(od)(n＝3)，*p<0.05，**p<0.01。(g)指定细胞类型的形态学(比例尺＝100μm。(h)在foxc2抑制后du145细胞中指定标志物的qrtpcr分析。y轴表示与du145-shff3细胞相比hprt标准化mrna表达的倍数变化(n＝3；误差条表示sem)。(i)所示细胞类型中各种标记物的免疫印迹。(j)指定细胞类型中arpsa表达的if(比例尺＝100μm。(k)在指定的细胞系中分析cd44(apc)和cd24(pe)表面标志物表达的代表性facs图。(l)图表显示上面显示的facs分析的定量(n＝3；误差条表示sem；***p<0.001)。(m)foxc2抑制后每千个du145细胞形成的前列腺球的定量(n＝5；误差条表示sem；**p<0.01)。(n，o)使用du145-shfoxc2中的mts测定法定量用恩杂鲁胺(n)或多西紫杉醇(o)处理的细胞的细胞存活。数据表示为490nm处的吸光度(od)(n＝3)，*p<0.05。图4a-4f：foxc2通过zeb1调节pca细胞中的ar表达和干细胞特性。(a)在表达所示构建体的lncap细胞中的免疫印迹。(b)每1000个lncap细胞形成的肿瘤球的数量的定量，每个lncap细胞表达指定的构建体(n＝5；误差条表示sem；*p<0.05，***p<0.001)。(c)在用恩杂鲁胺处理的各种lncap衍生的品系中使用mts测定法定量细胞存活。数据表示为490nm处的吸光度(od)(n＝3)，**p<0.01。(d)表达所示构建体的du145细胞中zeb1，foxc2，ar和肌动蛋白的免疫印迹。(e)每1000个du145细胞形成的前列腺球的定量，每个细胞表达指定的构建体(n＝5；误差条表示sem；***p<0.001)。(f)在用恩杂鲁胺处理的各种du145衍生细胞系中使用mts测定法定量细胞存活。数据表示为490nm处的吸光度(od)(n＝3)，*p<0.05，***p<0.001。图5a-5i：p38mapk信号传导的激活始终与雄激素非依赖性pca细胞中的foxc2依赖性emt/csc状态相关。在，psa+、psa-/lo细胞(a)、pca细胞系(b)、foxc2过表达后的lncap细胞(c)和抑制foxc2表达后的du145和du145细胞(d)中总(t)-和磷酸化(p)-p38及其靶底物atf2的免疫印迹。(e)使用tgfβ(p38信号传导的生理活化剂)诱导进行emt的lncap细胞中以及用tgfβ1信号传导抑制剂ly364947处理的du145细胞中foxc2、p-和t-smad23和p38信号传导组分的免疫印迹。f.肿瘤球的定量(n＝5；误差条表示sem；*p<0.05，***p<0.001)。(g)示意图显示基于磷酸基序扫描的人foxc2蛋白上推定的p38mapk磷酸化位点。(h)肿瘤球的定量(n＝5；误差条表示sem；**p<0.01，***p<0.001)。(i)在表达所示构建体的lncap细胞中的免疫印迹。图6a-6k：雄激素非依赖性细胞中p38信号传导的抑制导致emt的逆转，foxc2依赖性干细胞样特性的显著降低，以及对恩杂鲁胺和多西紫杉醇的敏感性的恢复。(a)du145细胞在sb203580(特异性p38信号传导抑制剂)处理7天后的形态学。(b)用sb203580处理的du145细胞进行伤口愈合测定的代表性图像。(c)b中细胞迁移的定量(n＝5；***p<0.001；误差条表示sem)。(d)对sb203580处理的du145细胞中的各种标记物进行qrtpcr分析。y轴表示相对于第0天，与载体处理的细胞相比，sb203580处理的细胞中hprt标准化mrna表达的倍数变化(n＝3；误差条表示sem)。(e)在sb203580处理7天后，对du145细胞中的foxc2，关键emt标记和p38信号传导组分进行免疫印迹。f.用载体或sb203580处理7天的du145细胞中cd44(apc)和cd24(pe)表面标志物表达的代表性facs图。(g)f组中显示的facs分析的定量(n＝3；误差条表示sem；***p<0.001)。(h)每1000个du145细胞形成的肿瘤球的定量(用载体或sb203580处理7天；n＝5，误差条表示sem，***p<0.001)。(i)用载体或sb203580处理7天的du145细胞中的ar和psa的if染色(比例尺＝100μm)。(j，k)在使用恩杂鲁胺(j)或多西紫杉醇(k)，如所示处理的du145细胞中使用mts测定法定量细胞存活。数据表示为490nm处的吸光度(od)(n＝3)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图7a-7i：用sb203580和恩杂鲁胺两者对携带侵袭性雄激素不敏感性肿瘤的小鼠进行组合治疗导致原发性肿瘤形成的显著消退以及循环肿瘤细胞群体的显著丧失。(a)示意图显示了体内实验的设计。(b)定量由du145-rfp-荧光素酶标记的细胞形成的肿瘤中荧光素酶活性的发光，并如所示进行处理。(c)从如所示处理的小鼠中分离的肿瘤(比例尺＝1cm，n＝8个数据点)。(d，e)图表显示在指定条件下肿瘤体积(d)和肿瘤重量(e)(ns＝p>0.05，**p<0.01)。(f)针对foxc2的qrtpcr分析，以及分离的肿瘤中的其他指示的标志物。y轴表示与汇集的对照载体处理的肿瘤相比，随机选择的肿瘤样品中hprt标准化mrna表达的倍数变化(n＝3；误差条表示sem)。(g)针对指定肿瘤的foxc2，ar和patf2(活化的p38信号传导的标记物)的ihc。(h)由所示的携带各种肿瘤的小鼠的血液中分离的ctc形成的集落的定量。通过稳定导入du145细胞的rfp表达证实菌落是人源的(ns＝p>0.05，***p<0.001)。(i)示意图描绘了foxc2参与将分化的/上皮前列腺癌细胞重编程为缺乏上皮性状的adt不敏感、耐药/神经内分泌干细胞样细胞。图8：代表bph(良性前列腺增生)，pin(前列腺上皮内瘤形成)和格里森等级7的原代人前列腺组织样品中foxc2表达的免疫组织化学分析。显示代表每种病症的3个不同样品。bc：人乳腺癌组织样品，阳性对照(比例尺＝100μm)。图9：免疫组织化学分析证明以缺乏ar表达为特征的原代人前列腺小细胞癌组织表现出高水平的foxc2表达(比例尺＝50μm)。右图中的插图显示foxc2染色组织的更高放大倍数图10：免疫印迹分析证明foxc2和ar在各种人类患者衍生的肿瘤异种移植物(pdx)亚系的裂解物中的表达之间的相互关系，其模拟具有ar阴性神经内分泌特征的致死变体小细胞前列腺癌[144-13和177-0：ar阴性子系；133-4和180-30：ar阳性对照]。图11：du145细胞中前列腺分化标志物-ar和psa的qrt-pcr分析，从sb203580处理后第0-7天开始逐步进行。y轴表示与对照细胞相比，sb203580处理的样品中hprt标准化mrna表达的倍数变化(n＝3；误差条表示sem)。图12：将rfp-荧光素酶标记的du145前列腺肿瘤细胞皮下注射到nodscid小鼠中，并通过生物发光成像监测肿瘤进展。在形成可触知的肿瘤(约2周)后，将小鼠随机分成4组，并如所示进行处理。小组显示小鼠和在治疗方案结束时可辨别的荧光素酶活性的发光(n＝8个数据点)。乳腺癌图13a-13f：foxc2表达与具有间充质和干细胞特性的细胞中的p38活化相关。(a)来自多个物种的foxc2氨基酸序列的比对显示在s367(p38的推定的磷酸化位点)处的高进化序列保守性。(b)通过免疫印迹分析来自指定细胞的细胞裂解物的p-p38，p38和foxc2。β-肌动蛋白用作上样对照。(c)用载体或sb203580处理指定的细胞24小时。通过免疫印迹分析细胞裂解物的foxc2。β-肌动蛋白用作上样对照(d)。用p38shrna(shp38)或对照shrna(shcontrol)转导指定的细胞。通过免疫印迹分析细胞裂解物的p38和foxc2。β-肌动蛋白用作上样对照。(e)通过免疫印迹测定，用10μmmg132预处理所示细胞可防止sb203580处理后foxc2的蛋白水解降解。β-肌动蛋白用作上样对照。(f)对于伤口愈合测定，用无菌移液管尖端刮擦上皮hmle细胞的汇合单层培养物。用载体或sb203580处理hmle细胞，并在刮擦诱导后(0小时)或伤口诱导后9小时立即固定，然后对foxc2和p-p38进行免疫染色。细胞核用dapi复染。比例尺，20μm。图14a-14e：p38抑制使原发性肿瘤生长不减弱，但显著损害转移。(a)用载体或sb203580处理4t1细胞24小时。通过foxc2的免疫印迹分析细胞裂解物，β-肌动蛋白作为上样对照。(b)将荧光素酶标记的4t1细胞原位注射到小鼠中，随后每天用载体或sb203580处理。在植入后3、4、5和6周收获原发性乳腺肿瘤(左图；宏观)和肺(右图；生物发光)。n＝每组5只小鼠。(c)用卡尺测量从(b)中的小鼠收获的原发性乳腺肿瘤的大小，作为两个垂直直径(mm2)的乘积并随时间作图。(d)定量(b)中来自肺的生物发光信号以确定转移的发生率。(e)定量(b)中从小鼠中分离的每100μl血液中的ctc数量，并随时间作图，使用student's非配对双尾t检验计算p值。*p<0.05；与对照相比，***p<0.001。图15a-15l：p38抑制在体外损害emt和干细胞特性的获得和维持。(a)单独或与sb203580组合地用tgfβ处理3天的mcf10a细胞。收获细胞并通过免疫印迹分析相应的裂解物的foxc2，e-钙粘蛋白和间充质标记物，β-肌动蛋白用作上样对照。(b)用4-oht处理hmle-snail-er细胞12天并同时暴露于载体或sb203580。在指定的时间点收获细胞，并通过免疫印迹分析foxc2，e-钙粘蛋白和间充质标记物的相应裂解物，β-肌动蛋白用作上样对照。(c)用4-oht处理hmle-snail-er和hmle-twist-er细胞12天，并同时暴露于载体或sb203580。在超低附着板中每孔接种一千个细胞并培养7-10天。计数直径大于75μm的球体。数据报告为形成的球体数/1000个接种细胞±sem。(d)通过facs测定同时暴露于载体或sb203580的4-oht处理的hmle-snail-er和hmle-twist-er群体中cd44高cd24细胞的百分比。数据表示为平均值±sem。(e)用p38shrna(shp38)或对照shrna(shcontrol)转导的hmle-twist-er细胞用4-oht处理9天，并在指定的时间点收获。通过免疫印迹分析foxc2，e-钙粘蛋白和间充质标记物的相应裂解物。β-肌动蛋白用作上样对照。(f)测定用对照shrna(shcontrol)或p38shrna(shp38)转导的4-oht处理的hmle-twist-er细胞的球形成效率。数据报告为形成的球体数/1000个接种细胞±sem。(g)用载体或sb203580处理指定的细胞，并通过免疫印迹分析foxc2，e-钙粘蛋白和间充质标记物。β-肌动蛋白的相应裂解物作为上样对照。(h)在载体或sb203580存在下测定所示细胞的球形成效率。数据报告为形成的球体数/1000个接种细胞±sem。(i)通过facs测定用载体或sb203580处理的指定细胞中cd44高cd24低亚群的百分比。数据表示为平均值±sem。(j)通过图像分析测量用载体或sb203580处理的指定细胞的相对伤口闭合，并以图形形式表示。数据表示为平均值±sem。(k)通过图像分析测量用对照shrna(shcontrol)，p38shrna(shp38)或foxc2shrna(shfoxc2)转导的hmle细胞的相对伤口闭合，并以图形格式表示。数据表示为平均值±sem。(1)将hmle-snail和hmle-twist细胞接种在fitc-缀合的明胶上，并用载体或sb203580处理。16小时后，固定细胞并用荧光鬼笔环肽染色，荧光鬼笔环肽与f-肌动蛋白结合，细胞核用dapi复染以促进细胞的可视化(参见图9)。通过图像分析量化fitc-明胶的降解。n＝150个细胞/样品。数据报告为平均值±sem。使用student's非配对双尾t检验计算p值。*p<0.05；**p<0.01；与对照相比，***p<0.001。图16a-16f：表达foxc2(s367)突变体的hmler细胞的emt和干细胞特性。(a)用空载体、foxc2、foxc2(s367e)或foxc2(s367a)转导hmler细胞，并通过相差显微镜对它们的形态进行成像。比例尺，100μm。(b)用指定构建体转导的来自hmler细胞的细胞裂解物通过免疫印迹分析foxc2(抗ha)，e-钙粘蛋白，纤连蛋白和波形蛋白。β-肌动蛋白用作上样对照。(c)指定细胞的球形成表示为形成的球体的平均数/1000个接种细胞±sem。(d)通过facs分析指定的细胞中细胞表面上cd44和cd24的存在。圆圈表示载体转导的对照群体在细胞图中的位置。(e)用载体或sb203580处理的指定细胞的球形成表示为形成的球体的平均数/1000个接种细胞±sem。(f)通过图像分析测量用载体或sb203580处理的指定细胞的相对伤口闭合，并以图形格式表示。数据表示为平均值±sem。使用student's非配对双尾t检验计算p值。*p<0.05；**p<0.01；与对照相比，***p<0.001。图17a-17e：在s367处的p38介导的foxc2磷酸化调节转移。(a)用载体或sb203580处理用空载体(pmig)或foxc2(s367e)转导的4t1细胞。通过免疫印迹分析细胞裂解物的foxc2，β-肌动蛋白作为上样对照。(b)用载体或foxc2(s367e)转导的4t1细胞在载体或sb203580存在下进行球形测定。数据表示为形成的球体的平均数/1000个接种的细胞±sem。(c)将4t1-载体或4t1-foxc2(s367e)荧光素酶标记的细胞原位注射到小鼠中。每天用载体或sb203580处理小鼠，并通过生物发光每周监测原发性肿瘤生长。数据表示为随时间绘制的总光子通量并报告为平均值±sem。(d)植入后4周从(c)小鼠收获的肺的代表性生物发光图像。(e)定量(c)中从小鼠收获的肺的生物发光信号以确定转移的发生率。数据报告为平均值±sem。使用student's非配对双尾t检验计算p值。*p<0.05；与对照相比，***p<0.001。图18a-18l：p38介导的foxc2磷酸化直接调节zeb1表达。(a)用空载体(hmler-载体)或foxc2(hmler-foxc2)转导hmler细胞，通过qrt-pcr测定foxc2和zeb1的转录水平，以甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)作为参考基因。规范化模板加载的可变性。数据报告为平均值±sem。(b)通过免疫印迹分析来自指定细胞的细胞裂解物的foxc2和zeb1。β-肌动蛋白用作上样对照。(c)用针对foxc2和zeb1的抗体对hmle-snail和hmle-twist细胞进行免疫染色。细胞核用dapi复染。比例尺，20μm。(d)用针对foxc2和zeb1的抗体对用对照shrna(shcontrol)或foxc2shrna(shfoxc2)转导的hmle-snail细胞进行免疫染色。细胞核用dapi复染。比例尺，20μm。(e)通过用gapdh作为参照基因的qrt-pcr测定用对照shrna(shcontrol)或foxc2shrna(shfoxc2)转导的指定细胞中zeb1mrna的相对表达。数据报告为平均值±sem。(f)通过免疫印迹分析用对照shrna(shcontrol)或foxc2shrna(shfoxc2)转导的指定细胞中foxc2，zeb1和β-肌动蛋白的蛋白质水平。(g)通过qrt-pcr测定hmler载体和hmler-foxc2细胞中mir200b和mir200c的相对水平，其中u6小核rna作为内部对照。数据报告为平均值±sem。(h)用对照shrna(shcontrol)或foxc2shrna(shfoxc2)转导的hmle-snail细胞中mir200b和mir200c的mrna丰度通过qrt-pcr测定，其中u6小核rna作为内部对照。数据报告为平均值±sem。(i)使用hmler-foxc2细胞进行染色质免疫沉淀测定，以显示foxc2在zeb1启动子的转录起始位点的上游结合。y轴表示结合的foxc2的百分比，x轴表示与kb中的zeb1转录起始位点的距离。(j)用载体或sb203580处理的指定细胞中zeb1转录物的相对水平通过qrt-pcr测定，gapdh作为参照基因。数据报告为平均值±sem。(k)用载体或sb203580处理的来自指定细胞的细胞裂解物通过免疫印迹分析zeb1。β-肌动蛋白用作上样对照。(l)用空载体foxc2，foxc2(s367e)或foxc2(s367a)转导hmler细胞。用载体或sb203580处理这些细胞，并通过免疫印迹分析相应的裂解物的zeb1。β-肌动蛋白用作上样对照，使用student's非配对双尾t检验计算p值。*p<0.05；**p<0.01；与对照相比，***p<0.001。图19a-19d：sb203580处理降低foxc2免疫染色，但sb203580和p38shrna均不影响foxc2转录物水平。(a)用针对p-p38和foxc2的抗体对指定的细胞进行免疫染色。细胞核用dapi复染。比例尺，20μm。(b)用载体或sb203580处理指定的细胞，随后用针对foxc2的抗体进行免疫染色。细胞核用dapi复染。比例尺，20μm。(c)通过qrt-pcr测定用载体或sb203580处理的指定细胞中foxc2mpvna的相对表达。gapdh用作参考基因。(d)通过qrt-pcr测定用对照shrna(shcontrol)或p38shrna(shp38)转导的指定细胞中foxc2mrna的相对表达。gapdh用作参考基因。图20a-20c：p38与foxc2相互作用并在s367处使其磷酸化。(a，b)用myc-foxc2和ha-p38或p38的激酶去除突变体(ha-p38-dn)转染hek293t细胞，并用抗ha(p38)，抗myc(foxc2)或对照igg进行免疫沉淀(ip)，然后用所示抗体进行免疫印迹(ib)。(c)使用谷胱甘肽-琼脂糖-4b珠从大肠杆菌中纯化重组gst-foxc2融合蛋白：n末端截短的foxc2(氨基酸245-501)，c末端截短的foxc2(氨基酸1-244)，或具有丝氨酸367的丙氨酸取代(s367a)的n末端截短的foxc2(氨基酸245-501)。用重组活性p38对各洗脱液进行体外激酶测定。通过sds-page分离反应混合物，并通过放射自显影观察磷酸化蛋白质。用箭头指示磷酸化的gstfoxc2的电泳迁移率。没有推定的p38磷酸化位点的gst对照和c末端截短的foxc2(氨基酸1-244)在该测定中未显示任何磷酸化。下图描绘了蛋白质输入的考马斯蓝染色。图21a-21d：监测乳腺肿瘤进展和sb203580治疗的效果。(a)将荧光素酶标记的4t1细胞原位注射到小鼠中，随后每天用载体(左图)或sb203580(右图)处理。生物发光成像用于监测每周原发肿瘤生长。(b)定量来自(a)中来自小鼠的原发性肿瘤的生物发光信号，并将其绘制为原发性乳腺肿瘤随时间发射的总光子通量。(c)在植入和治疗后第3、4、5和6周收获的(a)中小鼠的肺的宏观图像。n＝每组5只小鼠。veh＝媒介物；sb＝sb203580。(d)在植入和治疗后5周，从(a)中描述的小鼠收获的肺切片的苏木精和伊红染色。比例尺，100μm。图22a-22d：p38抑制在实验性转移模型中损害定植。(a)通过尾静脉将荧光素酶标记的mda-mb-231细胞注射到nodscid小鼠中。植入后48小时开始，每天用载体或sb203580(每组n＝6只小鼠)处理小鼠。通过生物发光成像监测肺转移的出现。显示了植入后8周的代表性生物发光图像。(b)生成通过尾静脉注射荧光素酶标记的mda-mb-231细胞，随后每天用载体或sb203580处理的小鼠的kaplan-meier无事件存活曲线。n＝每组6只小鼠。使用gehan-breslow-wilcoxon方法比较kaplan-meier生存曲线并计算相应的p值。(c)用对照shrna(shcontrol)或p38shrna(shp38)转导的荧光素酶标记的mda-mb-231细胞通过尾静脉注射到nodscid小鼠中(每组n＝7只小鼠)。通过生物发光成像监测肺转移的出现。显示了植入后9周的代表性生物发光图像。(d)产生通过尾静脉注射荧光素酶标记的mda-mb-231细胞、用p38shrna(shp38)或对照shrna(shcontrol)转导的小鼠的kaplan-meier无事件存活曲线。n＝每组7只小鼠。使用gehan-breslow-wilcoxon方法比较kaplan-meier生存曲线并计算相应的p值。图23：p38抑制损害了侵袭性伪足的形成。将snail细胞接种在fitc-缀合的明胶上，并用载体或sb203580处理。16小时后，固定细胞并用荧光鬼笔环肽染色，荧光鬼笔环肽与f-肌动蛋白结合，细胞核用dapi复染，以促进细胞的可视化。白色箭头表示明胶降解区域，表现为细胞下方的点状黑色区域。显示了代表性的图像。比例尺，20μm。图24：通过微阵列分析确定，相对于载体转导的对应物，zeb1是hmler-foxc2细胞中最高度上调的基因之一。相对于载体转导的对应物(hmler-载体)过表达foxc2(hmler-foxc2)的hmler细胞的基因表达谱的微阵列分析。使用的平台是affymetrixhumangenomeu133plus2.0阵列，数据以geo登录号gse44335保存在geneexpressionomnibus中。使用5倍变化截止值和统计显著性错误发现率(fdr)<0.05的分析产生总共740个基因。热图表示上皮hmler-载体细胞和间充质hmler-foxc2细胞中基因的差异表达。热图的每一行代表特定的基因探针。如图所示，热图的每列代表来自hmler-载体(vector_l，vector_2，vector_3)或hmler-foxc2(foxc2_1，foxc2_2，foxc2_3)细胞的样品。热图中的每个有色细胞代表相应样品中特定探针的基因表达值。对应于不同zeb1和foxc2探针的细胞的位置用箭头表示。与hmler-载体细胞相比，hmler-foxc2中基因表达的相应倍数变化显示在热图的右侧。图25a-25d：p38抑制在体外损害干细胞特性。(a)用各种p38抑制剂处理hmler-snail细胞。将细胞接种在超低附着板中并培养7-10天。计数直径大于75μm的球体。数据报告为形成的球体数/1000个接种细胞+sem。诱导球形成减少50％的药物浓度：sb203580-20μm；ph797804-10nm；ly2228820-10nm；vx-702-50um。(b)用各种p38抑制剂处理sum159细胞。将细胞接种在超低附着板中并培养7-10天。计数直径大于75μm的球体。数据报告为形成的球体数/1000个接种细胞+sem。诱导球形成减少50％的药物浓度：sb203580-20μm；ph797804-100nm；ly2228820-300nmnm；vx-702-50um。(c)用各种p38抑制剂处理hmle-snail细胞。将细胞接种在超低附着板中并培养7-10天。计数直径大于75μm的球体。数据报告为形成的球体数/1000个接种细胞+sem。诱导球形成减少50％的药物浓度：sb203580-20μm；ph797804-300nm；ly2228820-3μm；vx-702不抑制球形成。(d)在治疗第2天用各种p38抑制剂治疗hmler-snail细胞的western印迹。诱导50％foxc2蛋白减少的药物浓度：sb203580-10μm；ph797804-50nm；tak-714-5um。白血病图26a-26d：筛选临床化合物库，鉴定了那些阻止间充质干细胞(msc)介导的对bcr-abl阳性(bcr-abl+)急性淋巴细胞白血病(all)细胞的支持的化合物。(a)筛选临床化合物库的示意图。在接种荧光素酶标记的bcr-abl+小鼠all细胞之前，用伊马替尼(1m；5μm)和单独的临床化合物(对于所有化合物6.6μm，除地塞米松[dex，50nm])预处理msc3天。继续治疗1天，通过相差显微镜检查共培养的细胞的白血病细胞簇，并通过生物发光成像检查毒性。(b)基于对msc或白血病细胞的毒性及其对白血病细胞簇形成的影响，将146种临床化合物分为四组。注意，第4组化合物(n＝99)未能阻止簇的形成，甚至第4组的一些化合物也增加了簇的数量(++)。na，不适用。(c)来自第1组和第2组的化合物阻止了msc下面的伊马替尼(im)诱导的白血病细胞簇形成。在用组1(3-10)或组2(11-15)化合物预处理的msc下形成的白血病细胞簇的定量。数据显示为平均值的平均值+标准误差。(d)第1组和第2组化合物靶向的关键信号传导途径成员。图27a-27f：将sb203580(sb)或地塞米松(dex)与伊马替尼(im)组合用于消除间充质干细胞(msc)介导的对bcr-abl阳性(bcr-abl+)急性淋巴细胞白血病(all)细胞的支持。(a)sb203580预防伊马替尼预处理的msc下面的白血病细胞簇形成。在指定的条件下将msc预处理(pre)4天，然后接种表达荧光素酶的白血病细胞，并继续处理24小时。左图，共培养的白血病细胞和msc的显微图像(黑色，小的圆形细胞是msc下面的聚集的白血病细胞，明亮的，小的圆形细胞是悬浮在培养基中的白血病细胞)。对，所有细胞簇的量化。(b)图a中显示的共培养的白血病细胞/msc的生物发光成像(发光强度表示培养物中活白血病细胞的总数)。(c)sb203580与伊马替尼共同预处理诱导白血病细胞凋亡。来自图a中所示的共培养样品的白血病细胞用膜联蛋白v染色并通过流式细胞术分析。注意，在伊马替尼(5μm)存在下，向培养物中添加sb203580(20μm)可防止白血病细胞簇形成并使敏化的白血病细胞免于伊马替尼治疗。ssc，侧向散射。(d)地塞米松靶向在伊马替尼预处理的msc下形成的白血病细胞簇。在接种表达荧光素酶的白血病细胞之前，在指定条件下预处理msc4天，并继续处理24小时。左侧，共培养的白血病细胞/msc的显微图像。对，所有细胞簇的量化。(e)图d中显示的共培养的白血病细胞/msc的生物发光成像(发光强度表示培养物中活白血病细胞的总数)。(f)用伊马替尼共同预处理地塞米松诱导白血病细胞凋亡。来自图d中描述的共培养样品的白血病细胞用膜联蛋白v染色并通过流式细胞术分析。注意，在伊马替尼(5μm)存在下，地塞米松(50nm)有效靶向成簇的白血病细胞。比例尺，50μm。数据显示为均值+均值的标准误差。*通过t检验确定，p<0.05。图28a-28b：sb203580(sb)与伊马替尼(im)的共同治疗逆转伊马替尼诱导的间充质干细胞(msc)中的分子改变。(a)向伊马替尼治疗中加入sb203580可阻止msc中p38mapk的活化。将msc在无血清培养基中饥饿2小时，并用伊马替尼和/或sb203580处理30分钟。mscs补充10％血清，并继续治疗30分钟。将来自在指定条件下处理的msc的蛋白质裂解物进行免疫印迹分析，将α-微管蛋白用作上样对照。(b)sb203580+伊马替尼预防msc中伊马替尼诱导的基因表达改变。mscs在指定条件下处理2天，并对已知诱导的选定基因进行实时逆转录聚合酶链反应分析(sort1，adipoq，rspo2，cxcll2，fgflo，fgfr2，il-7，sphk1和ogn)或抑制(timp3)在mscs中使用伊马替尼治疗。数据显示为均值+均值的标准误差。图29a-29d：sb203580(sb)与达沙替尼和地塞米松(dex)的组合可防止bcr-abl阳性(bcr-abl+)急性淋巴细胞白血病(all)中酪氨酸激酶抑制剂(tki)抗性的发展。(a)在指定条件下处理的小鼠中白血病的进展。将非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷小鼠静脉内移植荧光素酶标记的白血病细胞(2×106个细胞)，并通过生物发光成像证实注射的白血病细胞的植入。移植后5天，开始治疗。将小鼠分成以下治疗组：载体(n＝3)，sb203580(n＝3)，达沙替尼(n＝3)，达沙替尼+地塞米松(n＝8)和达沙替尼+地塞米松+sb203580(n＝8)。通过生物发光成像定期监测白血病负荷。对于所有处理组，在每个时间点将发光信号调节至相同的比例。(b)图a中小鼠的kaplan-meier存活分析。箭头表示治疗开始(移植后5天)。p值通过对数秩检验确定。(c)白血病小鼠骨髓样品中mcherry阳性(mcherry+)白血病细胞的凋亡分析。上图，在指定条件下处理的小鼠的生物发光图像(每组n＝2)。下图，通过mcherry+白血病细胞的流式细胞术分析细胞凋亡。下图中流式细胞术图中显示的代表性数据对应于上图中显示的小鼠组。(d)在移植后第23天和第27天检查外周血中的mcherry+白血病细胞。图30：伊马替尼诱导的间充质干细胞(msc)介导的耐药性的工作模型和克服bcr-abl阳性(bcr-abl+)急性淋巴细胞白血病(all)对酪氨酸激酶抑制剂(tki)的抗性的有效策略。在没有伊马替尼(最左边)的情况下，bcr-abl+all细胞的生长由bcr-abl信号传导驱动。在存在伊马替尼(im；左起第二)的情况下，msc经历形态学和功能变化并产生多个支持分子，从而激活all细胞中的替代信号传导途径，同时bcr-abl信号传导被伊马替尼阻断。结果，bcr-abl+all细胞从bcr-abl信号转换为替代信号以存活。伊马替尼+sb203580(sb；左起第三位)逆转伊马替尼介导的mscs形态和功能变化，并阻止msc介导的对白血病细胞的替代生存支持。伊马替尼+地塞米松(dex；左起第四位)也通过间接靶向白血病细胞中的存活信号传导有效地阻止msc提供替代的存活支持。因此，将tki与p38mapk抑制剂和地塞米松(左起第五位)联合使用可以帮助预防bcr-abl+all中tki耐药的发展。细长或多边形细胞是msc，而小圆细胞是白血病细胞(黑细胞是活细胞，灰细胞是凋亡细胞)。图31a-31d：临床化合物的筛选文库鉴定了那些阻止在伊马替尼(im)预处理的间充质干细胞(msc)下形成白血病细胞簇的文库。(a，b和c)个体临床化合物与伊马替尼组合对伊马替尼诱导的白血病细胞簇的影响。顶部，用于在96孔板1(a)，2(b)或3(c)中分布临床化合物的布局。底部，与伊马替尼和来自平板1(a)，2(b)或3(c)的临床化合物共同处理后观察到的白血病细胞簇数(来自3个不同视野的平均簇数)。请注意，突出显示的孔中的化合物有效地防止了在伊马替尼预处理的msc下形成白血病细胞簇。na表示对白血病细胞和/或msc显示出毒性的化合物；因此，这些孔不会产生白血病簇。(d)个体临床化合物与伊马替尼组合对白血病细胞活力的影响。在用荧光素酶标记的bcr-abl阳性(bcr-abl+)小鼠急性之前，用伊马替尼(5μm)和单独的临床化合物(对于所有化合物6.6μm，除地塞米松[dex，50nm])预处理msc3天。接种淋巴母细胞白血病(all)细胞。继续治疗1天，并通过生物发光成像测定共培养的细胞的毒性。板1、2和3中的每行化合物用于处理12孔板中的共培养的msc/白血病细胞。注意，空孔未经过任何处理。图32a-32b：sb203580(sb)与伊马替尼(im)共处理在不存在间充质干细胞(msc)的情况下不影响白血病细胞增殖或凋亡。(a)用sb203580(20μm)单独或与伊马替尼(10nm，50nm，0.1μm，0.5μm或10μm)组合处理的bcr-abl阳性(bcr-abl+)急性淋巴细胞白血病(all)细胞的增殖试验1μm持续2天。在不存在msc和il-7的情况下培养白血病细胞。数据显示平均值+平均值的标准误差。(b)sb203580与伊马替尼共同处理对白血病细胞凋亡的影响。在指定条件下培养2天后不含mscs和il-7。用膜联蛋白v染色白血病细胞并通过流式细胞术分析。图33：sb203580(sb)防止在伊马替尼(im)预处理的间充质干细胞(msc)下形成白血病细胞簇。在指定条件下对msc进行预处理(pre)4天，然后接种表达荧光素酶的白血病细胞；然后，继续治疗24小时。对应于来自图1的图像的更宽的微观视图。显示了27a.im-，媒介物对照。比例尺，50μm。图34：sb203580(sb)在伊马替尼(im)预处理的间充质干细胞(msc)下防止人白血病细胞簇形成。在指定条件下对msc进行预处理(pre)4天，然后接种bcr-abl阳性(bcr-abl+)人b细胞急性淋巴细胞白血病(all)细胞，并继续治疗24小时。左图，共培养的白血病细胞/msc的显微图像。右图，所有细胞簇的量化。比例尺，50μm。数据显示为均值+均值的标准误差。*通过t检验确定，p<0.05。图35：sb203580(sb)预处理白血病细胞不会阻止在伊马替尼(im)预处理的间充质干细胞(msc)下形成白血病细胞簇。用载体或sb203580sb(20μm)预处理白血病细胞2天，并接种到用伊马替尼(5μm)预处理4天的msc上。比例尺，50μm。说明性实施方案的描述前列腺癌富含干细胞特征的晚期前列腺腺癌以及变体雄激素受体(ar)-阴性神经内分泌/小细胞前列腺癌难以治疗，并且占每个前列腺癌相关死亡的高达30％。年。虽然现有的前列腺癌疗法如雄激素剥夺疗法(adt)会破坏肿瘤内的大部分ar阳性细胞，但由于ar*干细胞样细胞的持续存活，根除该群体最终会导致去势抵抗。。本公开通过组合p38mapk的抑制与抗癌疗法的组合来提供用于治疗癌症的方法和组合物，克服了与当前技术相关的挑战。发明人鉴定了p38mapk信号传导与已知促进癌干细胞和转移的转录因子foxc2之间的关键联系。他们证明了psa-/lopca细胞，emt/csc原型和受调节的ar表达之间存在直接联系，并确立了foxc2在诱导和维持adt抗性pcasc属性中的重要作用。本公开证明对adt不敏感的前列腺癌细胞以及高级/神经内分泌前列腺肿瘤的特征在于foxc2升高，并且使用良好耐受的p38-抑制剂靶向foxc2恢复上皮属性和adt敏感性。并且在肿瘤体积显著缩小的情况下减少体内循环肿瘤细胞的脱落。因此，本文提供了靶向具有干细胞样特性的前列腺癌细胞的ar-/lo群体的有形机制。乳腺癌转移能力取决于潜伏胚胎程序的异常激活，所述潜在胚胎程序称为上皮-间充质转换(emt)，其赋予肿瘤细胞干细胞特性以及迁移和侵入能力。forkhead转录因子foxc2最近被确定为多个emt程序的下游效应物，独立于emt诱导刺激，并且作为连接emt，干细胞特性和转移能力的关键参与者。因此，foxc2可以作为预防转移的潜在靶标。由于foxc2是转录因子，因此难以通过常规方法如小分子抑制剂进行靶向。在本公开中，发明人将丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶p38鉴定为foxc2稳定性和功能的可药用上游调节剂。实际上，证明foxc2在p38的丝氨酸367处被磷酸化，稳定foxc2蛋白水平，并引发其下游靶zeb1的表达。引人注目的是，p38的遗传或药理学抑制降低了foxc2和zeb1蛋白水平，恢复emt并选择性地预防转移而不影响原发性肿瘤生长。因此，p38的抑制损害体外emt和干细胞属性-包括迁移，侵袭性伪足形成，cd44hghcd24低抗原谱和球形成效率-并阻止肿瘤细胞从原位原发肿瘤部位进入循环。重要的是，磷酸化模拟foxc2(s367e)突变体在原位移植模型中对p38抑制是难以控制的，而不可磷酸化的foxc2(s367a)突变体不能引发emt并且上调zeb1。总之，证明foxc2以p38依赖性方式调节zeb1表达和转移，并证明p38-抑制剂作为用于治疗癌症的抗转移剂的效用，特别是与其他抗癌剂组合。白血病在进一步的研究中，发明人确定在msc和白血病细胞之间的任何点阻断伊马替尼诱导的替代存活信号转导消除了伊马替尼诱导的msc介导的药物抗性。筛选了一个临床化合物库，以鉴定可以预防mscs中伊马替尼脱靶效应并使白血病细胞对伊马替尼治疗敏感的化合物。本研究结果表明，p38mapk抑制剂(如sb203580)和糖皮质激素受体激动剂(如地塞米松)均可消除酪氨酸激酶抑制剂(tki)诱导的msc介导的bcr-abl阳性急性淋巴细胞白血病(all)生存支持。细胞和预防tki抵抗。因此，本公开的实施方案提供了通过施用p38抑制剂和/或糖皮质激素受体激动剂与tki组合来治疗白血病(例如all)的方法。i.定义如本文所用，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于表示没有特定组分被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。。因此，任何组合物的无意污染导致的特定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是一种组合物，其中用标准分析方法不能检测到任何量的特定组分。如本说明书中所使用的，“一个”或“一个”可以表示一个或多个。如本文在权利要求中所使用的，当与单词“包括”结合使用时，词语“一个”或“一个”可以表示一个或多于一个。权利要求中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅涉及替代方案的定义和“和/或”。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。在整个本申请中，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化，用于确定值的方法，或研究对象之间存在的变化。本申请全文中使用的术语“治疗益处”是指在癌症的医学治疗方面促进或增强患者健康的任何事物。这方面的非穷举性例子列表包括延长患者的生命任何时间；减少或延迟疾病的肿瘤发展；过度增殖减少；减少肿瘤生长；转移延迟；降低癌细胞或肿瘤细胞的增殖速度；在任何处理过的细胞或受处理细胞影响的任何细胞中诱导细胞凋亡；并且可以归因于患者病情的患者疼痛减轻。“有效量”至少是实现可测量的改善或预防特定病症所需的最小量。本文的有效量可以根据诸如疾病状态，年龄，性别和患者体重等因素以及抗体在个体中引发所需反应的能力而变化。有效量也是治疗有益效果超过治疗的任何毒性或有害作用的量。对于预防性使用，有益或期望的结果包括诸如消除或降低风险，减轻严重性或延迟疾病发作的结果，包括疾病的生化，组织学和/或行为症状，其并发症和中间病理表型呈现在疾病的发展过程中。对于治疗用途，有益或期望的结果包括临床结果，例如减少由疾病引起的一种或多种症状，提高患有该疾病的人的生活质量，减少治疗疾病所需的其他药物的剂量，增强另一种药物，例如通过靶向，延迟疾病的进展和/或延长存活期。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可以具有减少癌细胞数量的作用；减小肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上缓慢或有利地停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在某种程度上缓慢并且理想地停止)肿瘤转移；抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上缓解与该病症相关的一种或多种症状。有效量可以在一次或多次施用中施用。出于本发明的目的，有效量的药物，化合物或药物组合物是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景中所理解的，有效量的药物，化合物或药物组合物可以或可以不与另一种药物，化合物或药物组合物一起实现。因此，可以考虑“有效量”在施用一种或多种治疗剂的情况下，如果与一种或多种其他药剂联合，可以或可以实现所需的结果，则可以认为单一药剂以有效量给予。如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂，分散介质，载体，包衣，稀释剂，抗细菌和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂，缓冲剂，载体溶液，悬浮液，胶体等。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可以掺入组合物中。术语“药物制剂”是指这样的形式的制剂，其允许活性成分的生物活性有效，并且不含对制剂具有不可接受的毒性的其他组分。管理。这种制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(赋形剂，添加剂)是可以合理地给予受试哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的赋形剂。如本文所用，术语“治疗”是指旨在改变临床病理学过程中所治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。理想的治疗效果包括降低疾病进展速度，改善或缓解疾病状态，以及缓解或改善预后。例如，如果减轻或消除与癌症相关的一种或多种症状，则成功“治疗”个体，包括但不限于减少(或破坏)癌细胞的增殖，减少由疾病引起的症状，增加患有该疾病的人的生活质量，减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量，和/或延长个体的存活。“抗癌”剂能够对受试者中的癌细胞/肿瘤产生负面影响，例如，通过促进癌细胞的杀伤，诱导癌细胞中的细胞凋亡，降低癌细胞的生长速率，减少癌细胞的生长速率。转移的发生率或数量，减少肿瘤大小，抑制肿瘤生长，减少对肿瘤或癌细胞的血液供应，促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答，预防或抑制癌症的进展，或延长癌症的寿命受癌症的人。本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗体片段。生物活动。术语“p38mapk抑制剂”或“p38抑制剂”意指阻断通过p38map激酶途径的信号传导的任何化合物。在一些实施方案中，p38mapk抑制剂通过减少p38mapk的量，抑制或阻断p38mapk活化或抑制信号传导途径中的其他分子而起作用。如本文所用，术语“抑制剂”包括但不限于可以调节p38map激酶活性的任何合适的分子，化合物，蛋白质或其片段，核酸，制剂或物质。如本文所用，术语“bcr-abl”是指融合癌基因，其编码具有组成型活性bcr-abl酪氨酸激酶(tk)活性的嵌合bcr-abl蛋白。在本文中，由bcr-abl基因编码的蛋白酪氨酸激酶可包括例如bcr-ablp210融合蛋白(登录号：a1z199)和bcr-ablp185融合蛋白(登录号：q13745)。术语bcr-abl旨在包括备选的bcr-abl基因产物，并且还包括本领域技术人员使用的替代名称，例如bcr-abl致癌基因，bcr-abl原癌基因和bcr-abl癌蛋白。如本文所用，术语“bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂”，“bcr-abl激酶抑制剂”，“bcr-ablki”和“bcr-abltki”是指可以抑制bcr-的任何化合物或药剂。abltk在动物，特别是哺乳动物，例如人中的活性。在这种情况下，与不存在外源施用的化合物或药剂时的活性相比，抑制剂被理解为降低bcr-abl酪氨酸激酶的活性。该术语旨在包括间接或直接作用的化合物或试剂。如本领域所用，bcr-abltki通常是指一类已知抑制bcr-abltk的化合物，但可进一步抑制其他信号传导途径，例如src途径。如本文所用，术语“bcr-abl相关病症”是指与bcr-abl介导的活性相关或显示的病症或疾病，并且旨在包括bcr-abl的突变形式。在这种情况下，与bcr-abl相关的病症将受益于直接或间接bcr-abl抑制。ii.癌症a.前列腺癌前列腺癌是一种疾病，其中癌症在前列腺中发展，前列腺是雄性生殖系统中的腺体。2007年，报告了近220、000例新病例，超过27、000例死亡归因于这种恶性肿瘤。它发生在前列腺细胞突变并开始繁殖失控的时候。这些细胞可能从前列腺扩散(转移)到身体的其他部位，特别是骨骼和淋巴结。前列腺癌可能导致疼痛，排尿困难，勃起功能障碍和其他症状。前列腺癌的比率在世界范围内变化很大。虽然各国之间的费率差异很大，但在南亚和东亚最不常见，在欧洲更常见，在美国最常见。根据美国癌症协会的报告，前列腺癌在亚洲男性中最不常见，在黑人男性中最为常见，其中男性为白人。然而，这些高比率可能受到检测率增加的影响。在50岁以上的男性中，前列腺癌最常发生。这种癌症只能发生在男性身上，因为前列腺完全是男性生殖道。它是美国男性中最常见的癌症类型，除肺癌外，它导致的男性死亡人数超过任何其他癌症。然而，许多患有前列腺癌的男性从未出现症状，不接受任何治疗，最终死于其他原因。许多因素，包括遗传和饮食，都与前列腺癌的发展有关。前列腺癌筛查是寻找未预料到的癌症的尝试。筛查测试可能会导致更具体的后续测试，例如活组织检查，其中小部分前列腺被移除以进行更深入的研究。截至2006年，前列腺癌筛查选项包括直肠指检和前列腺特异性抗原(psa)血液检查。筛查前列腺癌是有争议的，因为尚不清楚筛查的益处是否超过后续诊断测试和癌症治疗的风险。前列腺癌是一种生长缓慢的癌症，在老年男性中非常常见。事实上，大多数前列腺癌从未发展到导致症状的程度，大多数前列腺癌患者在前列腺癌对其生命产生影响之前死于其他原因。psa筛查试验可以检测出这些永远不会危及生命的小癌症。在这些男性中进行psa测试可能会导致过度诊断，包括额外的测试和治疗。后续检查，如前列腺活检，可能会导致疼痛，出血和感染。前列腺癌治疗可能导致尿失禁和勃起功能障碍。因此，在psa筛查之前，必须仔细考虑诊断程序和治疗的风险和益处。前列腺癌筛查通常在50岁之后开始，但是这可以由于种族背景而变化。因此，美国家庭医生学会和美国医师学会建议医生讨论筛查的风险和益处，并根据患者的个人偏好来决定。尽管没有官方推荐的临界值，但许多医疗保健提供者仍停止监测年龄超过75岁的男性的psa，因为他们担心前列腺癌治疗可能会随着年龄的增长和预期寿命的降低而弊大于利。直肠指检(dre)是检查者将戴手套的润滑手指插入直肠以检查前列腺的大小，形状和质地的过程。不规则，坚硬或结块的区域需要进一步评估，因为它们可能含有癌症。尽管dre仅评估前列腺的背部，但85％的前列腺癌在前列腺的这部分中出现。可以在dre上感觉到的前列腺癌通常更先进。当用作唯一的筛查试验时，dre的使用从未被证明可以预防前列腺癌死亡。psa测试测量前列腺特异性抗原(由前列腺产生的酶)的血液水平。具体而言，psa是与激肽释放酶类似的丝氨酸蛋白酶。它的正常功能是在射精后液化凝胶状精液，使精子更容易穿过子宫颈。psa水平低于4ngml(毫微克/毫升)通常被认为是正常的，但是在50岁以下的个体中，有时截止值为2.5用于正常的上限，而超过4ngml的水平是被认为是异常的(尽管65岁以上的男性高达6.5ngml可能是可以接受的，这取决于每个实验室的参考范围)。psa水平在4到10ngml之间表明前列腺癌的风险高于正常水平，但风险似乎并未在这六个范围内上升。当psa水平高于10ngml时，与癌症的关联变得更强。然而，psa并不是一个完美的测试。一些患有前列腺癌的男性psa没有升高，大多数psa升高的男性没有前列腺癌。由于除癌症之外的许多原因，psa水平可以改变。高psa水平的两个常见原因是前列腺增大(良性前列腺肥大(bph))和前列腺感染(前列腺炎)。射精后和导管插入后数天也可以提高24小时。使用用于治疗bph或秃头的药物的男性的psa水平降低。这些药物，非那雄胺(作为proscar或propecia销售)和度他雄胺(作为avodart销售)可以将psa水平降低50％或更多。已经开发了几种评估psa的其他方式以避免简单psa筛选的缺点。使用年龄特异性参考范围可提高测试的灵敏度和特异性。psa随时间的上升速度，称为psa速度，已被用于评估psa水平在4和10ngml之间的男性，但截至2006年，它尚未被证实是有效的筛查测试。还研究了通过超声或磁共振成像测量的psa水平与前列腺的大小的比较。这种称为psa密度的比较成本高昂，截至2006年，尚未证明是有效的筛选试验。血液中的psa可以是游离的或与其他蛋白质结合。测量游离或结合的psa量可提供额外的筛选信息，但截至2006年，关于这些测量的有用性的问题限制了它们的广泛使用。当男性患有前列腺癌症状或筛查测试表明癌症风险增加时，提供更多侵入性评估。唯一可以充分证实前列腺癌诊断的检查是活组织检查，切除前列腺小块用于显微镜检查。然而，在活组织检查之前，可以使用若干其他工具来收集关于前列腺和泌尿道的更多信息。膀胱镜检查显示膀胱内的泌尿道，使用插入尿道的薄而柔韧的摄像管。经直肠超声检查使用来自直肠探针的声波创建前列腺图像。如果怀疑癌症，则提供活组织检查。在活组织检查期间，泌尿科医生通过直肠从前列腺获得组织样本。活检枪在不到一秒的时间内插入并移除特殊的空心针(通常在前列腺的每侧三到六个)。前列腺活检通常在门诊进行，很少需要住院治疗。百分之五十五的男性在前列腺活检期间报告不适。然后在显微镜下检查组织样品以确定是否存在癌细胞，并评估发现的任何癌症的微观特征。如果存在癌症，病理学家会报告肿瘤的等级。该等级表示肿瘤组织与正常前列腺组织的差异程度，并表明肿瘤可能生长的速度有多快。gleason系统用于对2至10的前列腺肿瘤进行分级，其中gleason评分为10表示最多的异常。病理学家为显微镜下观察到的最常见图案指定1到5的数字，然后对第二种最常见的图案进行相同的处理。这两个数字的总和是gleason得分。whitmore-jewett阶段是有时使用的另一种方法。对肿瘤进行适当分级至关重要，因为肿瘤的等级是用于确定治疗建议的主要因素之一。评估前列腺癌的重要部分是确定癌症已经扩散的阶段或程度。了解阶段有助于确定预后，在选择治疗时很有用。最常见的系统是四阶段tnm系统(缩写为tumornodesmetastases)。其成分包括肿瘤的大小，淋巴结的数量以及任何其他转移的存在任何分期系统所做的最重要的区别是癌症是否仍局限于前列腺。在tnm系统中，临床t1和t2癌症仅在前列腺中发现，而t3和t4癌症在其他地方传播。可以使用几种测试来寻找传播的证据。这些包括用于评估骨盆内扩散的计算机断层扫描，用于寻找向骨骼扩散的骨扫描，以及用于密切评估前列腺囊和精囊的直肠内线圈磁共振成像。由于骨转移区域骨密度增加，骨扫描应显示成骨细胞外观-与许多其他转移癌症相反。前列腺癌可以通过手术，放射疗法，激素疗法，偶尔化学疗法，质子疗法或这些的一些组合来治疗。该男性的年龄和潜在健康状况以及在显微镜下的扩散程度，外观以及癌症对初始治疗的反应对于确定疾病的结果是重要的。由于前列腺癌是一种老年男性的疾病，许多人会在慢慢前进的前列腺癌扩散或引起症状之前死于其他原因。这使得治疗选择变得困难。是否治疗局限性前列腺癌(包含在前列腺内的肿瘤)具有治疗意图的决定是患者在患者存活和生活质量方面的预期有益和有害影响之间的权衡。观察等待，也称为“主动监视”，是指在没有侵入性治疗的情况下进行观察和定期监测。在早期阶段，在老年男性中发现生长缓慢的前列腺癌时，通常会使用观察等待。当手术，放射治疗或激素治疗的风险超过可能的益处时，也可能会建议观察等待。如果出现症状，或者如果有迹象表明癌症生长正在加速(例如，psa快速上升，重复活检时gleason评分增加等)，则可以开始其他治疗。大多数选择观察等待早期肿瘤的男性最终都有肿瘤进展的迹象，他们可能需要在三年内开始治疗。虽然选择观察等待的男性避免了手术和放射的风险，但可能会增加转移(癌症扩散)的风险。对于年轻男性，主动监测的试验可能并不意味着完全避免治疗，但可能合理地允许延迟几年或更长时间，在此期间可以避免积极治疗对生活质量的影响。迄今公布的数据表明，精心挑选的男性不会错过这种方法治疗的窗口。在观察期间随着年龄的增长而出现的其他健康问题也可能使得更难以进行手术和放射治疗。当医生错误地命令不遵循推荐指南(异常dre和升高的psa)的活组织检查时，通常偶然发现临床上不显著的前列腺肿瘤。泌尿科医生必须检查psa是否因其他原因，前列腺炎等而未升高。泌尿科医生经常建议每年进行一次活检，以便在肿瘤临床无效时选择观察等待(没有异常的dre或psa)。可以通过这种方式监测肿瘤微小的肿瘤，并且患者可以决定仅在肿瘤扩大的情况下进行手术，这可能需要许多年或从未。手术切除前列腺或前列腺切除术是对于早期前列腺癌或对于未对放射疗法作出反应的癌症的常见治疗。最常见的类型是根治性耻骨后前列腺切除术，当外科医生通过腹部切口移除前列腺时。另一种类型是根治性会阴前列腺切除术，当外科医生通过会阴切口，阴囊和肛门之间的皮肤切除前列腺。根治性前列腺切除术也可以腹腔镜进行，通过腹部的一系列小(1cm)切口，有或没有手术机器人的帮助。对于尚未扩散到前列腺外的肿瘤，根治性前列腺切除术是有效的；治愈率取决于psa等级和gleason等级的风险因素。然而，它可能会导致神经损伤，从而显著改变前列腺癌幸存者的生活质量。最常见的严重并发症是尿失控和阳痿。所报告的两种并发症的发生率差异很大，取决于它们的评估方式，手术方式，术后多长时间以及设置(例如，学术系列与社区或基于人群的数据)。虽然阴茎感觉和达到性高潮的能力通常保持不变，但勃起和射精往往受损。西地那非(伟哥)，他达拉非(cialis)或伐地那非(levitra)等药物可能会恢复某种程度的效力。对于大多数患有器官局限性疾病的男性，更有限的“保留神经”技术可能有助于避免尿失禁和阳痿。当癌症很小时，传统上单独使用根治性前列腺切除术。如果在病理学上发现阳性边缘或局部晚期疾病，辅助放射疗法可以提供改善的存活率。当癌症对放射疗法没有反应时，也可以提供手术。然而，由于放射治疗导致组织改变，放射治疗后前列腺切除术具有较高的并发症风险。经尿道前列腺切除术，通常称为“turp”，是当从膀胱到阴茎(尿道)的管被前列腺增大阻塞时进行的外科手术。turp通常用于良性疾病，并不意味着对前列腺癌的确定性治疗。在turp期间，将小管(膀胱镜)放入阴茎中并切除阻塞的前列腺。在癌症已经扩散到前列腺之外的转移性疾病中，可以进行睾丸的去除(称为睾丸切除术)以降低睾酮水平并控制癌症生长。放射疗法，也称为放射疗法，使用电离辐射来杀死前列腺癌细胞。当被组织吸收时，电离辐射如ε和x射线会破坏细胞中的dna，从而增加细胞凋亡的可能性。在前列腺癌治疗中使用两种不同的放射疗法：外部束放射疗法和近距离放射疗法。外部束放射疗法使用线性加速器来产生高能x射线，其被射向朝向前列腺的束。称为强度调制放射治疗(imrt)的技术可用于调整辐射束以符合肿瘤的形状，允许更高剂量给予前列腺和精囊，对膀胱和直肠的损伤更小。外照射放射疗法通常在数周内进行，每日访问放射治疗中心。与传统治疗相比，新型放射治疗可能具有更少的副作用，其中之一是tomotherapy。对于具有低至中等风险特征的患者，永久性植入物近距离放射治疗是一种流行的治疗选择，可以在门诊病人的基础上进行，并且与具有相对低的发病率的良好的10年结果相关。它涉及在脊柱或全身麻醉下将约100个含有放射性物质(如碘l25或钯103)的小“种子”用针穿过会阴皮肤直接放入肿瘤中。这些种子发出的能量较低的x射线只能在短距离内传播。虽然种子最终变得惰性，但它们永久地保留在前列腺中。植入种子的男性接触他人的风险通常被认为是微不足道的。放射疗法通常用于前列腺癌治疗。它可以代替手术用于早期癌症，并且它还可以用于前列腺癌的晚期阶段以治疗疼痛的骨转移。当单独放射治疗不太可能治愈癌症时，放射治疗也可以与激素治疗相结合用于中度风险疾病。一些放射肿瘤学家将外部束辐射和近距离治疗结合起来用于中高风险情况。一项研究发现，与局部前列腺癌患者单独使用放射治疗相比，六个月的雄激素抑制治疗联合外照射组合改善了生存率。其他人使用外部光束放射疗法，近距离放射疗法和激素疗法的“三重模态”组合。放射疗法的不太常见的应用是当癌症压迫脊髓时，或者有时在手术后，例如在精囊中，淋巴结中，前列腺囊外或活组织切片中发现癌症时。。通常向男性提供放射疗法，其医疗问题使手术更具风险。放射治疗似乎治愈了局限于前列腺的小肿瘤，与手术一样。然而，截至2006年，一些问题仍未得到解决，例如是否应该对骨盆的其余部分进行放射治疗，吸收剂量应该是多少，以及是否应该同时给予激素治疗。在治疗几周后可能发生放射疗法的副作用。两种类型的放射治疗都可能由于放射性直肠炎以及尿失禁和阳痿而引起腹泻和直肠出血。症状往往会随着时间的推移而改善。接受过外照射放射治疗的男性患结肠癌和膀胱癌的风险较高。冷冻手术是另一种治疗前列腺癌的方法。它比根治性前列腺切除术侵入性小，并且全身麻醉不太常用。在超声引导下，金属杆穿过会阴的皮肤插入前列腺。高度纯化的氩气用于冷却棒，在-196℃(-320°f)冷冻周围组织。随着前列腺细胞内的水冻结，细胞死亡。通过填充有温热液体的导管保护尿道免于冻结。与其他治疗方法相比，冷冻手术通常会引起较少的尿控制问题，但阳痿最多可发生在百分之九十的时间。当用作前列腺癌的初始治疗和经验丰富的冷冻外科手术时，冷冻手术具有优于所有其他治疗的10年生化无疾病率，包括根治性前列腺切除术和任何形式的放射。冷冻手术也被证明优于激进的放射治疗后复发癌的前列腺切除术。激素疗法使用药物或手术来阻止前列腺癌细胞获得二氢睾酮(dht)，二氢睾酮是前列腺中产生的激素，并且是大多数前列腺癌细胞生长和扩散所必需的。阻断dht经常导致前列腺癌停止生长甚至缩小。然而，激素疗法很少能治愈前列腺癌，因为最初对激素疗法有反应的癌症通常会在一到两年后变得耐药。因此，当癌症从前列腺扩散时，通常使用激素疗法。也可以给予接受放射治疗或手术以帮助预防癌症复发的某些男性。用于前列腺癌的激素疗法靶向身体用于产生dht的途径。涉及睾丸，下丘脑和垂体，肾上腺和前列腺的反馈回路控制dht的血液水平。首先，dht的低血液水平刺激下丘脑产生促性腺激素释放激素(gnrh)。然后gnrh刺激垂体产生促黄体激素(lh)，lh刺激睾丸产生睾酮。最后，来自睾丸的睾酮和来自肾上腺的脱氢表雄酮刺激前列腺产生更多的dht。激素疗法可以通过在任何时候中断该途径来降低dht的水平。有几种形式的激素疗法。睾丸切除术是去除睾丸的手术。因为睾丸使大部分身体的睾丸激素，睾丸切除术后睾丸激素水平下降。现在前列腺不仅缺乏产生dht的睾酮激素，而且还没有足够的睾丸激素转化为dht。抗雄激素是药物，例如氟他胺，比卡鲁胺，尼鲁米特和醋酸环丙孕酮，其直接阻断前列腺癌细胞内睾酮和dht的作用。阻断肾上腺雄激素如dhea产生的药物包括酮康唑和氨基戊二酰亚胺。由于肾上腺仅占人体雄激素的5％左右，因此这些药物通常仅与其他可阻断睾丸产生的95％雄激素的方法结合使用。这些组合方法称为总雄激素阻断(tab)。tab也可以使用抗雄激素来实现可以以两种方式之一中断gnrh动作。gnrh拮抗剂直接抑制lh的产生，而gnrh激动剂在初始刺激作用后通过下调过程抑制lh。abarelix是gnrh拮抗剂的一个例子，而gnrh激动剂包括亮丙瑞林，戈舍瑞林，曲普瑞林和布舍瑞林。最初，gnrh激动剂增加lh的产生。然而，由于药物的持续供应与身体的自然生产节律不匹配，lh和gnrh的产生在几周后减少。b.乳腺癌1.背景乳腺癌是从乳房开始的癌症，通常在乳管或小叶的内衬中。有不同类型的乳腺癌，具有不同的阶段(传播)，侵略性和基因组成。通过最佳治疗，10年无病生存率从98％到10％不等。治疗选自手术，药物(化学疗法)和放射。在美国，2004年有216、000例浸润性乳腺癌和40、000例死亡。在世界范围内，乳腺癌是继肺癌之后第二种最常见的癌症类型(占所有癌症发病率的10.4％，两性均为计数)，并且排名第五癌症死亡的常见原因。2004年，乳腺癌在全球造成519、000人死亡(7％的癌症死亡；几乎占所有死亡人数的1％)。女性乳腺癌的发病率是男性的100倍，但两性的生存率相同。一些乳腺癌需要激素雌激素和孕酮生长，并且具有这些激素的受体。手术后，这些癌症用药物治疗，这些药物会干扰那些激素，通常是他莫昔芬，以及用于切断卵巢或其他地方雌激素产生的药物；这可能会损害卵巢并终止生育能力。手术后，低风险，激素敏感的乳腺癌可以单独使用激素治疗和放射治疗。没有激素受体的乳腺癌，或已经扩散到腋窝淋巴结或具有某些遗传特征的乳腺癌，风险较高，并且治疗更积极。在美国流行的一种标准方案是环磷酰胺加多柔比星(阿霉素)，称为ca；这些药物会破坏癌症中的dna，但也会在快速生长的正常细胞中造成严重的副作用。有时加入紫杉烷类药物，如多西紫杉醇，该制度称为cat；紫杉烷攻击癌细胞中的微管。在欧洲流行的等效治疗是环磷酰胺，甲氨蝶呤和氟尿嘧啶(cmf)。单克隆抗体，例如曲妥珠单抗(赫赛汀)，用于具有her2突变的癌细胞。通常将放射线添加到手术床中以控制手术遗漏的癌细胞，这通常延长存活期，尽管在接下来的几年中暴露于心脏可能导致损伤和心力衰竭。2.症状乳腺癌的第一症状或主观征兆通常是感觉与周围乳房组织不同的肿块。根据themerck手册，当女性感到肿块时，超过80％的乳腺癌病例被发现。根据美国癌症协会的说法，乳房x线照片可以发现医生检测到的第一个医学信号或乳腺癌的客观指征。在位于腋窝的淋巴结中发现的肿块也可指示乳腺癌。除了肿块以外的乳腺癌的适应症可能包括乳房大小或形状的变化，皮肤凹陷，乳头内翻或自发性单乳头溢液。疼痛(“乳房痛”)是确定乳腺癌存在与否的不可靠工具，但可能表明其他乳房健康问题。当乳腺癌细胞侵入真皮淋巴管-乳房皮肤中的小淋巴管时-其呈现可类似于皮肤炎症，因此被称为炎性乳腺癌(ibc)。炎症性乳腺癌的症状包括整个乳房的疼痛，肿胀，温暖和发红，以及称为“peaud'orange”的皮肤的橙皮纹理。另一种报道的乳腺癌症状复杂是乳腺paget病。这种综合征表现为湿疹样皮肤改变，如乳头皮肤发红和轻度剥落。随着佩吉特的进步，症状可能包括刺痛，瘙痒，敏感性增加，灼热和疼痛。乳头也可能有排出物。大约一半被诊断患有佩吉特的女性也有乳房肿块。有时，乳腺癌表现为转移性疾病，即已经扩散到原始器官之外的癌症。转移性乳腺癌会引起依赖于转移位置的症状。转移的常见部位包括骨，肝，肺和脑。不明原因的体重减轻偶尔会预示着一种隐匿性的乳腺癌，就像发烧或发冷的症状一样。骨关节疼痛有时可能是转移性乳腺癌的表现，黄疸或神经系统症状也是如此。这些症状是“非特异性的”，这意味着它们也可能是许多其他疾病的表现。3.风险因素已经鉴定的主要风险因素是性别，年龄，生育，激素，高脂肪饮食，酒精摄入，肥胖和诸如烟草使用，辐射和轮班工作的环境因素。95％的乳腺癌病例没有病因，而大约5％的新乳腺癌可归因于遗传性综合征。特别地，乳腺癌易感基因brca1和brca2的携带者乳腺癌和卵巢癌的风险增加30-40％，这取决于突变发生在蛋白质的哪个部分。专家认为，95％的遗传性乳腺癌可以追溯到这两个基因中的一个。遗传性乳腺癌可以采取特定部位遗传性乳腺癌的形式-仅影响乳房的癌症-或乳房-卵巢癌和其他癌症综合征。乳腺癌可以从女性和男性亲属那里继承。4.亚型乳腺癌亚型通常基于免疫组织化学分类。子类型定义通常如下：正常(er+，pr+，her2+，细胞角蛋白5/6+和her1+)管腔a(er+和/或pr+，her2-)管腔b(er+和/或pr+，her2+)三阴性(er-，pr-，her2-)her2+er-(er-，pr-和her2+)未分类的(er-，pr-，her2-，细胞角蛋白56-和her1-)在三阴性乳腺癌细胞的情况下，癌症的生长不是由雌激素或孕酮或来自her2蛋白的生长信号驱动的。同样地，这样的癌细胞对激素疗法没有反应，例如他莫昔芬或芳香酶抑制剂，或针对her2受体的疗法，例如赫赛汀。大约10-20％的乳腺癌被发现是三阴性。重要的是要识别这些类型的癌症，以便人们可以避免成功不同的治疗的昂贵和毒性作用，并专注于可用于治疗三阴性乳腺癌的治疗。与其他形式的乳腺癌一样，可以通过手术，放射疗法和/或化学疗法来治疗三阴性乳腺癌。一种特别有效的方法是“新辅助”疗法，其中在手术前提供化学和/或放射疗法。另一种药物疗法是使用聚(adp-核糖)聚合酶或parp抑制剂。5.传统筛查和诊断虽然上面讨论的筛选技术可用于确定癌症的可能性，但是需要进一步测试以确认筛查中检测到的肿块是否是癌症，而不是诸如简单囊肿的良性替代方案。在临床环境中，乳腺癌通常使用临床乳房检查(由训练有素的医生进行乳房检查)，乳房x线照相术和细针抽吸细胞学的“三重测试”来诊断。同时用于筛查的乳房x光检查和临床乳房检查都可以表明肿块是癌症的近似可能性，并且还可以识别任何其他病变。细针抽吸和细胞学(fnac)，作为使用局部麻醉剂的门诊手术，涉及尝试从肿块中提取一小部分液体。清澈的液体使得肿块不太可能是癌性的，但可以将血性液体送去在显微镜下检查以检查癌细胞。总之，这三种工具可用于诊断乳腺癌，具有良好的准确性。活组织检查的其他选择包括核心活组织检查，其中一部分乳房肿块被移除，以及切除活组织检查，其中整个肿块被移除。乳腺癌筛查是在其他健康个体中发现癌症的尝试。最常见的女性筛查方法是x射线乳房x光检查和临床乳房检查的组合。对于高于正常风险的女性，例如具有强烈癌症家族史的女性，其他工具可能包括基因检测或乳房磁共振成像。此外，根据系统评价，真空辅助乳房活检(vab)可以帮助在乳房x射线照相检测到的乳房中的患者中诊断乳腺癌。在本研究中，真空辅助乳腺活检诊断乳腺癌的总结估计如下：敏感性为98.1％，95％ci＝0.972-0.987，特异性为100％，95％ci＝0.997-0.999。然而，低估非典型导管增生(adh)和导管原位癌(dcis)的发生率为20.9％，95％ci＝0.177-0.245和11.2％，95％ci＝0.098-0.128。乳腺癌筛查是指测试其他健康的女性乳腺癌以试图获得早期诊断。假设早期检测将改善结果。已经采用了许多筛选试验，包括：临床和自我乳房检查，乳房x线照相术，遗传筛查，超声和磁共振成像。临床或自我乳房检查涉及感觉乳房有肿块或其他异常。研究证据不支持任何一种类型的乳房检查的有效性，因为当肿块大到足以发现它可能已经生长了几年并且很快就会大到可以在没有检查的情况下被发现。乳腺癌的乳房x光检查使用x射线检查乳房是否有任何不典型的肿块或肿块。对于高风险女性，例如癌症家族史较高的女性，建议在较早年龄进行乳房x光检查筛查，其他检测可能包括检测brca基因和/或磁共振成像的遗传筛查。乳房自我检查是过去大量提倡的一种筛查形式，但由于一些大型研究表明它对女性没有生存益处并且经常引起相当大的焦虑，因此已经不受欢迎。这被认为是因为已经检测到的癌症已经趋向于处于相对晚期阶段，而其他方法则在更常见的治愈性治疗的早期阶段推动识别癌症。x射线乳房x线照相术使用x射线检查乳房是否有任何不典型的肿块或肿块。一些国家的超过一定年龄的妇女建议定期进行乳房x光检查作为筛查工具。乳腺癌的基因测试通常涉及测试brca基因中的突变。除乳腺癌风险较高者外，这通常不是推荐的技术。6.治疗有时首先用手术治疗乳腺癌，然后用化学疗法，放射或两者治疗乳腺癌。根据预后和复发风险，治疗具有增加的侵略性。第1阶段癌症(和dcis)具有良好的预后，并且通常在有或没有化学疗法或放射的肿瘤切除术中进行治疗。虽然侵袭性her2+癌症也应该用曲妥珠单抗(赫赛汀)治疗。预后逐渐恶化和复发风险较高的2期和3期癌症通常通过手术(乳房肿瘤切除术或乳房切除术，有或没有淋巴结切除)，放射(有时)和化学疗法(加用曲妥珠单抗治疗her2+癌症)进行治疗。第4阶段，转移性癌症(即扩散到远处部位)是不可治愈的，并且通过来自手术，放射，化学疗法和靶向疗法的所有治疗的各种组合来管理。这些治疗使第4阶段乳腺癌的中位存活时间增加约6个月。乳腺癌治疗的主要方法是当肿瘤局部化时进行手术，可能的辅助激素治疗(使用他莫昔芬或芳香酶抑制剂)，化学疗法和/或放射疗法。目前，手术后的治疗建议(辅助治疗)遵循一种模式。根据临床标准(年龄，癌症类型，大小，转移)，患者大致分为高风险和低风险病例，每个风险类别遵循不同的治疗规则。治疗可能性包括放射疗法，化学疗法，激素疗法和免疫疗法。靶向癌症疗法是靶向癌细胞的特定特征的治疗，例如允许癌细胞以快速或异常方式生长的蛋白质。靶向治疗通常不如化学疗法对正常健康细胞造成伤害。一些靶向治疗是抗体，其作用类似于由一个人的免疫系统自然产生的抗体。这些类型的靶向疗法有时被称为免疫靶向疗法。目前有3种医生用于治疗乳腺癌的靶向疗法。(曲妥珠单抗)通过阻断癌细胞接收告诉细胞生长的化学信号的能力来对抗her2阳性乳腺癌。(拉帕替尼)通过阻断某些可导致细胞不受控制的蛋白质来对抗her2阳性乳腺癌。(贝伐单抗)通过阻断癌细胞生长和发挥作用的新血管的生长而发挥作用。激素(抗雌激素)疗法以两种方式对抗激素-受体-阳性乳腺癌：首先，通过降低体内激素雌激素的量，第二，通过阻断体内雌激素的作用。女性体内大多数雌激素是由卵巢制成的。雌激素使激素受体阳性的乳腺癌增长。因此，减少雌激素的数量或阻止其作用可以帮助缩小激素受体阳性乳腺癌，并降低激素受体阳性乳腺癌复发的风险(反复发作)。激素疗法药物对激素受体阴性乳腺癌无效。存在几种类型的激素疗法药物，包括芳香酶抑制剂，选择性雌激素受体调节剂和雌激素受体下调剂。在某些情况下，可以手术切除卵巢和输卵管以治疗激素受体阳性乳腺癌，或作为乳腺癌高风险女性的预防措施。也可以使用药物暂时关闭卵巢。在计划治疗中，医生还可以使用诸如oncotypedx的pcr测试或基于基因表达预测乳腺癌复发风险的微阵列测试。2007年2月，第一次乳腺癌预测试验获得了食品药品管理局的正式批准。这是一项新的基因检测，可帮助预测患有早期乳腺癌的女性是否会在5年或10年内复发，这可能有助于影响初始肿瘤治疗的积极程度。放射疗法还用于帮助破坏可能在手术后徘徊的癌细胞。当以正确剂量递送时，辐射可以将复发风险降低50-66％。c.白血病白血病是一组通常在骨髓中开始并导致大量异常白细胞的癌症。这些白细胞尚未完全发育，被称为胚细胞或白血病细胞。症状可能包括出血和瘀伤问题，感觉疲倦，发烧和感染风险增加。这些症状是由于缺乏正常的血细胞而发生的。诊断通常通过血液检查或骨髓活检进行。白血病的确切原因尚不清楚。据信不同种类的白血病具有不同的原因。据信，遗传和环境(非遗传)因素都参与其中。风险因素包括吸烟，电离辐射，某些化学物质(如苯)，既往化学疗法和唐氏综合症。有白血病家族史的人也有较高的风险。[5]有四种主要类型的白血病-急性淋巴细胞白血病(all)，急性髓性白血病(aml)，慢性淋巴细胞白血病(cll)和慢性粒细胞白血病(cml)-以及一些不太常见的类型。白血病和淋巴瘤都属于影响血液，骨髓和淋巴系统的更广泛的肿瘤组，称为造血和淋巴组织的肿瘤。除了根据需要的支持性护理和姑息治疗之外，治疗还可以包括化学疗法，放射疗法，靶向疗法和骨髓移植的某种组合。某些类型的白血病可以通过观察等待来管理。治疗的成功取决于白血病的类型和人的年龄。发达国家的成果有所改善。美国的平均五年生存率为57％。在15岁以下儿童中，五年生存率大于60％至85％，具体取决于白血病的类型。在患有急性白血病的儿童中，五年后无癌症，癌症不太可能恢复。费城染色体或费城易位是白血病癌细胞(例如，cml，aml和all细胞)的染色体22中的特定遗传异常。由于遗传物质在染色体9和染色体22之间的相互易位，该染色体是有缺陷的并且异常短，并且包含称为bcr-abl1的融合基因。该基因是染色体9的abl1基因并列在22号染色体的bcr基因上，编码一种杂合蛋白：一种“永远在线”的酪氨酸激酶信号蛋白，导致细胞不受控制地分裂。iii。治疗方法在某些实施方案中，本文描述的方法包括施用p38mapk抑制剂用于治疗癌症。预期用于治疗的癌症的实例包括肺癌，头颈癌，乳腺癌，胰腺癌，前列腺癌，肾癌，骨癌，睾丸癌，宫颈癌，胃肠癌，淋巴瘤，肺中的肿瘤前病变，结肠癌症，黑色素瘤和膀胱癌。在特定方面，癌症是前列腺癌，例如雄激素非依赖性，去势抵抗性前列腺癌。在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗受试者的癌症的方法，包括以有效治疗的量向受试者施用p38mapk抑制剂和抗癌疗法，其中所述受试者被鉴定为具有相对于参考水平表达高水平foxc2的癌细胞。在一些方面，受试者是人受试者。在特定方面，癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用p38mapk抑制剂，用于治疗受试者，特别是转移性癌症中的癌症。在某些方面，p38mapk抑制剂与至少一种抗癌治疗组合施用。预期用于治疗的转移性癌症的实例包括肺癌，头颈癌，乳腺癌，胰腺癌，前列腺癌，肾癌，骨癌，睾丸癌，宫颈癌，胃肠癌，淋巴瘤，肺中的肿瘤前病变，结肠癌，黑色素瘤和膀胱癌。在特定方面，癌症是转移性乳腺癌。在进一步的实施方案中，提供了用p38mapk抑制剂，糖皮质激素受体激动剂和/或酪氨酸激酶受体(tki)的组合治疗bcr-abl相关病症的方法。bcr-abl相关病症可以是费城染色体阳性白血病。在另一方面，bcr-abl功能障碍是bcr-abl基因的突变。bcrabl相关病症的实例包括癌症，例如白血病，淋巴瘤和实体瘤。在另一方面，癌症选自白血病和胃肠道间质瘤。在特定方面，白血病是慢性髓性白血病(cml)，急性淋巴细胞白血病(all)或费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(ph+all)。可以理解，其他癌症，例如与酪氨酸激酶功能障碍相关的癌症，可以从使用本发明中受益，包括例如癌，结肠，肾，肝，肺，胰腺，胃，甲状腺，睾丸，睾丸精原细胞瘤，鳞状细胞癌和其他血液肿瘤。在一些方面，bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂选自伊马替尼，达沙替尼，尼罗替尼，博舒替尼，普纳替尼，巴非替尼，saracatinib，tozasertib和rebastinib。在特定方面，bcr-abltki是伊马替尼或达沙替尼。示例性糖皮质激素受体激动剂是地塞米松，皮质醇，可的松，泼尼松龙，泼尼松，甲基强的松龙，曲霉素，氢化可的松和皮质酮。在一些实施方案中，所述个体患有对一种或多种抗癌疗法具有抗性(已被证明具有抗性)的癌症。在一些实施方案中，对抗癌疗法的抗性包括癌症或难治性癌症的复发。复发可以指治疗后在原始部位或新部位再次出现的癌症。在一些实施方案中，对抗癌疗法的抗性包括在用抗癌疗法治疗期间癌症的进展。在一些实施方案中，癌症处于早期或晚期。可以在本领域已知的各种模型中测试本文所述任何方法的功效，例如临床或临床前模型。合适的临床前模型在本文中举例说明，并且还可以包括但不限于id8卵巢癌，gem模型，b16黑素瘤，renca肾细胞癌，ct26结肠直肠癌，mc38结肠直肠癌和癌症的cloudman黑素瘤模型。预期特定p38抑制剂可直接在p38map激酶的上游或下游或在p38map激酶上表现出其调节作用。抑制剂调节的p38map激酶活性的实例包括抑制剂可以降低p38map激酶的转录和/或翻译，可以减少或抑制p38map激酶的翻译后修饰和/或细胞运输，或者可以缩短半衰期的那些。p38map激酶抑制剂还可以可逆地或不可逆地结合p38map激酶，使其酶活性失活，或以其他方式干扰其与下游底物的相互作用。已经鉴定了四种p38mapk同种型(分别为α，β，γ和δ)，每种均显示组织特异性表达模式。p38mapkα和β同种型在整个身体中普遍表达，并且存在于许多不同的细胞类型中。p38mapkα和β同种型被某些已知的小分子p38mapk抑制剂抑制。p38mapk抑制剂可以影响单个p38map激酶同种型(例如，ρ38α，ρ38β，ρ38γ或ρ38δ)，多于一种同种型，或p38map激酶的所有同种型。在一个具体实施方案中，抑制剂调节p38map激酶的同种型。用于本发明方法和组合物的p38mapk抑制剂的具体实例包括但不限于sb203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1h-咪唑)；sb202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑)；sb220025；n-(3-叔丁基-1-甲基-5-吡唑基)-n'-(4-(4-吡啶基甲基)苯基)脲；rpr200765a；ux-745；ux-702；ux-850；sclo-469；rwj-67657(rwjohnson药物研究所)；rdp-58(sangstatmedicalcorp.；由genzymecorp.收购)；scios-323(scio323；sciosinc.)；scios-469(scio-469；sciosinc.)；mkk3mkk6抑制剂(signalresearchdivision)；p38mek调节剂(信号研究部)；sb-210313类似物；sb-238039；hep-689(sb235699)；sb-239063；sb-239065；sb-242235(smithklinebeechampharmaceuticals)；vx-702和vx-745(vertexpharmaceuticalsinc.)；amg-548(amgeninc.)；astexp38激酶抑制剂(astextechnologyltd.)；rpr-200765类似物(aventissa)；拜耳p38激酶抑制剂(拜耳公司)；birb-796(boehringeringelheimpharmaceuticalsinc.)；celltechp38map激酶抑制剂(celltechgrouppic)；fr-167653(fujisawapharmaceuticalco.ltd。)；sb-681323和sb-281832(glaxosmithklinepic)；leopharmaceuticalsmap激酶抑制剂(leopharmaas)；merckco.p38map激酶抑制剂(merckresearchlaboratories)；sc-040和sc-xx906(monsantoco.)；腺苷a3拮抗剂(novartisag)；p38map激酶抑制剂(novartispharmaag)；cni-1493(picower医学研究所)；rpr-200765a(rhone-poulencrorerltd.)；和rochep38map激酶抑制剂(例如，r03201195和r04402257；rochebioscience)。参见，例如，roux等，microbiologyandmolecularbiologyreviews68(2)：320-344(2004)；engelman等，journalofbiologicalchemistry273(48)：32111-32120(1998)；jackson等，journalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics284(2)：687-692(1998)；kramer等，journalofbiologicalchemistry271(44)：27723-27729(1996)；和menko等，us20080193504。p38的其他抑制剂包括但不限于1、5-二芳基取代的吡唑和取代的吡唑化合物(美国专利号6,509,361和美国专利号6,335,336)；取代的吡啶基化合物(us20030139462)；喹唑啉衍生物(美国专利号6,541,477，美国专利号6,184,226，美国专利号6,509,363和美国专利号6,635,644)；芳基脲和杂芳基类似物(美国专利号)；杂环脲(wo1999/32110)；其他尿素化合物(w0199932463，w0199852558，wo199900357和wo199958502)；和取代的咪唑化合物和取代的三唑化合物(美国专利no.6,560,871和美国专利no.6,599,910)。其他化合物描述于公开的pct申请wo96/21452，wo96/40143，wo97/25046，wo97/35856，wo98/25619，wo98/56377，wo98/57966，wo99/32110，wo99中。32121，wo99/32463，wo99/61440，wo99/64400，wo00/10563，wo00/17204，wo00/19824，wo00/41698，wo00/64422，wo00/71535，wo0138324，wo01/64679，wo01/66539和wo01/66540，其各自通过引用整体并入本文。关于p38mapk抑制性化合物的其他指导可见于美国专利申请系列no.美国专利申请09575,060(现为美国专利no.6,867,209)，10157,048(现为美国专利no.6,864,260)，10146,703、10156,997和10156,996，所有这些专利在此引入作为参考。如果直接作用于p38map激酶，在一个实施方案中，抑制剂可以表现出约5μm或更低的ic50值，例如约500mm或更低，例如约100nm或更低。在一个相关的实施方案中，抑制剂应表现出相对于p38amap激酶同种型的ic50值，其比在相当的测定中针对其他p38map激酶同种型测试相同的抑制剂时观察到的ic50值低约10倍。在一些实施方案中，p38抑制剂通过静脉内，肌肉内，皮下，局部，口服，透皮，腹膜内，眼内，通过植入，吸入，鞘内，心室内或鼻内施用。可以施用有效量的p38抑制剂用于预防或治疗疾病。p38抑制剂的适当剂量可以根据待治疗的疾病类型，疾病的严重程度和病程，个体的临床状况，个体的临床病史和对治疗的反应以及主治医师的自由裁量权来确定。。例如，无论是通过一次或多次施用，给予人的p38抑制剂的治疗有效量将在约0.01至约50mgkg患者体重的范围内。在一些实施方案中，化合物为约0.01至约45mgkg，约0.01至约40mgkg，约0.01至约35mgkg，约0.01至约30mgkg，约0.01至约25mgkg。每天施用kg，约0.01至约20mgkg，约0.01至约15mgkg，约0.01至约10mgkg，约0.01至约5mgkg，或约0.01至约1mgkg，例如。在一些实施方案中，化合物以15mgkg施用。然而，其他剂量方案可能是有用的。在一个实施方案中，本文所述的p38mapk抑制剂以约100mg，约200mg，约300mg，约400mg，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg的剂量施用于人。在21天周期的第1天，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg或约1400mg。剂量可以单剂量或多剂量(例如2或3剂量)施用，例如输注。通过常规技术可以容易地监测该疗法的进展。肿瘤内注射或注射到肿瘤脉管系统中特别考虑用于离散的，固体的，可接近的肿瘤。地方，区域或系统管理也可能是适当的。对于>4cm的肿瘤，施用量约为4-10ml(特别是10ml)，而对于<4cm的肿瘤，则使用约1-3ml的肿瘤(特别是3ml))。作为单剂量递送的多次注射包含约0.1至约0.5ml体积。a.联合治疗可以以本领域已知的任何合适方式施用组合疗法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括将p38抑制剂与至少一种用于治疗受试者的癌症的抗癌治疗组合施用。例如，p38抑制剂和抗癌剂可以顺序(在不同时间)或同时(在同一时间)施用。在一些实施方案中，p38抑制剂在作为抗癌剂的单独组合物中。在一些实施方案中，p38抑制剂与抗癌剂在相同的组合物中。可以在本领域已知的各种模型中测试本文所述任何方法的功效，例如临床或临床前模型。合适的临床前模型在本文中举例说明，并且还可以包括但不限于id8卵巢癌，gem模型，b16黑素瘤，renca肾细胞癌，ct26结肠直肠癌，mc38结肠直肠癌和癌症的cloudman黑素瘤模型。p38抑制剂和抗癌剂可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用。在一些实施方案中，p38抑制剂通过静脉内，肌肉内，皮下，局部，口服，透皮，腹膜内，眼内，通过植入，吸入，鞘内，心室内或鼻内施用。在一些实施方案中，抗癌剂通过静脉内，肌肉内，皮下，局部，口服，透皮，腹膜内，眼内，通过植入，吸入，鞘内，心室内或鼻内施用。可以施用有效量的p38抑制剂和抗癌剂以预防或治疗疾病。p38抑制剂和抗癌剂的适当剂量可以根据待治疗的疾病类型，疾病的严重程度和病程，个体的临床状况，个体的临床病史和对治疗的反应以及主治医生的自由裁量权。在一些实施方案中，用p38抑制剂和抗癌剂的组合治疗是协同的，由此相对于作为单一药剂的至少一种抗癌剂的有效剂量，组合中有效剂量的p38抑制剂降低。例如，无论是通过一次或多次施用，给予人的p38抑制剂和抗癌剂的治疗有效量将在约0.01至约50mgkg患者体重的范围内。在一些实施方案中，使用的化合物为例如每日施用约0.01至约45mgkg，约0.01至约40mgkg，约0.01至约35mgkg，约0.01至约30mgkg，约0.01至约25mg。kg，约0.01至约20mgkg，约0.01至约15mgkg，约0.01至约10mgkg，约0.01至约5mgkg，或约0.01至约1mgkg。在一些实施方案中，化合物以15mgkg施用。然而，其他剂量方案可能是有用的。在一个实施方案中，本文所述的p38mapk抑制剂在21天周期的第1天以约100mg，约200mg，约300mg，约400mg，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg或约1400mg的剂量施用于人。剂量可以单剂量或多剂量(例如2或3剂量)施用，例如输注。通过常规技术可以容易地监测该疗法的进展。肿瘤内注射或注射到肿瘤脉管系统中特别考虑用于离散的，固体的，可接近的肿瘤。地方，区域或系统管理也可能是适当的。对于>4cm的肿瘤，给予的体积约为4-10ml(特别是10ml)，而对于<4cm的肿瘤，将使用约1-3ml的体积(特别是3ml)。作为单剂量递送的多次注射包含约0.1至约0.5ml体积。“抗癌”剂能够对受试者的癌症产生负面影响，例如，通过杀死癌细胞，诱导癌细胞中的细胞凋亡，降低癌细胞的生长速率，降低转移的发生率或数量，减少肿瘤大小，抑制肿瘤生长，减少对肿瘤或癌细胞的血液供应，促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答，预防或抑制癌症的进展，或增加患有癌症的受试者的寿命。更一般地，这些其他组合物将以有效杀死或抑制细胞增殖的组合量提供。该过程可涉及同时使细胞与抗癌肽或纳米颗粒复合物和一种或多种因子或多种因子接触。这可以通过使细胞与包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂接触，或通过使细胞与两种不同的组合物或制剂接触同时进行，其中一种组合物包含抗癌肽或纳米颗粒复合物和另一个包括第二个代理人。在特定实施方案中，抗癌肽可以是一种药剂，并且抗癌纳米颗粒复合物可以是其他药剂。可以使用各种组合，其中p38抑制剂是“a”，并且一种或多种抗癌剂，例如放射疗法或化学疗法，是“b”：在某些实施方案中，考虑到载体的毒性(如果有的话)，将本发明实施方案的组合疗法给予患者将遵循化学治疗剂施用的一般方案。预计将根据需要重复治疗周期。还预期各种标准疗法以及外科手术干预可以与所述的过度增殖细胞疗法组合应用。a.化学疗法癌症疗法还包括多种组合疗法。在一些方面，p38mapk抑制剂与化学治疗剂联合施用(或配制)。例如，在一些方面，化学治疗剂是蛋白激酶抑制剂，例如egfr，vegfr，akt，erbl，erb2，erbb，syk，bcr-abl，jak，src，gsk-3，pi3k，ras，raf，mapk，mapkk，mtor，c-kit，eph受体或braf抑制剂。蛋白激酶抑制剂的非限制性实例包括：阿法替尼，阿昔替尼，贝伐珠单抗，bosutinib，西妥昔单抗，克唑替尼，达沙替尼，厄洛替尼，fostamatinib，吉非替尼，伊马替尼，拉帕替尼，乐伐替尼，莫立替尼，尼洛替尼，帕尼单抗，帕唑帕尼，培加他尼，兰尼单抗，芦可替尼，塞卡替尼，索拉非尼，舒尼替尼，曲妥珠单抗，凡德他尼，ap23451，威罗菲尼，mk-2206，gsk690693，a-443654，vqd-002，米替福新，哌立福辛，cal101，px-866，ly294002，雷帕霉素，坦罗莫司，依维莫司，ridaforolimus，阿沃西地，染料木素，司美替尼，azd-6244，瓦他拉尼，p1446a-05，ag-024322，zd1839，p276-00，gw572016或其混合物。进一步的组合化学疗法包括，例如，烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐诸如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷诸如苯并多巴，卡波醌，美妥多巴和脲多巴；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲基蜜胺，三亚乙基蜜胺，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基蜜胺；乙酸配质(特别是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡来斯他汀；cc-1065(包括其阿多来新，卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(特别是，念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物，kw-2189和cb1-tm1)；柳珊瑚素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑素；氮芥诸如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺，雌莫司汀，异环磷酰胺，氮芥，氧化氮芥盐酸盐，美法仑，新氮芥，苯芥胆甾醇，泼尼莫司汀，曲磷胺，尿嘧啶芥；亚硝基脲诸如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素诸如烯二炔抗生素(例如，加利刹霉素，特别是加利刹霉素γll和加利刹霉素ωll)；达内霉素，包括达内霉素a；双膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团，阿克拉霉素，放线菌素，安曲霉素，偶氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素c，carabicin，去甲柔红霉素，嗜癌素，色霉素，更生霉素，柔红霉素，地托比星，6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸，多柔比星(包括吗啉代-多柔比星，氰吗啉代-多柔比星，2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星，依索比星，伊达比星，麻西罗霉素，丝裂霉素诸如丝裂霉素c，麦考酚酸，诺拉霉素，橄榄霉素，培洛霉素，泊非霉素，嘌罗霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑霉素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他汀，佐柔比星；抗代谢药诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物诸如二甲叶酸，喋罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨，6-巯嘌呤，硫咪嘌呤，硫代鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨，阿扎胞苷，6-氮杂尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷；雄激素诸如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯；抗-肾上腺诸如米托坦，曲洛司坦；叶酸补加物诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；百垂布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类化合物诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；psk多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙基胺；单端孢霉烯(特别是t-2毒素，粘液霉素a，杆孢菌素a和蛇形菌素)；氨基甲酸酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露糖醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷("ara-c")；环磷酰胺；紫杉类化合物，例如，紫杉醇和多西他赛、吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位络合物诸如顺铂，奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊本膦酸盐；伊立替康(例如，cpt-11)；拓扑异构酶抑制物rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄醇诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂，丙卡巴肼，普卡霉素，吉西他滨，诺维本，法呢基-蛋白转移酶抑制物，反铂，和上述任何一种的药学上可接受的盐，酸或衍生物。在某些实施方案中，可将本文提供的组合物与吉非替尼联合使用。在其他实施方案中，本发明的实施方案可以与gleevac组合实施(例如，可以向患者施用约400至约800mg/天的gleevac)。在某些实施方案中，一种或多种化学治疗剂可以与本文提供的组合物组合使用。b.放射治疗导致dna损伤并且已广泛使用的其他因素包括通常称为γ射线，x射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其他形式的dna损伤因子，例如微波和紫外线照射。很可能所有这些因素都会对dna，dna的前体，dna的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。x射线的剂量范围从50至200伦琴的日剂量延长的时间段(3至4周)，到单剂量的2000至6000伦琴。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期，发射的辐射强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述将治疗组合物和化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与其直接并置的过程。目标细胞。为了实现细胞杀伤或停滞，将两种药剂以有效杀死细胞或防止其分裂的组合量递送至细胞。c.免疫治疗通常，免疫疗法依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是，例如，对肿瘤细胞表面上的某些标记物具有特异性的抗体。单独的抗体可以作为治疗的效应物，或者它可以募集其他细胞以实际影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂，放射性核素，蓖麻毒素a链，霍乱毒素，百日咳毒素等)缀合，仅用作靶向剂。或者，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述表面分子直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性t细胞和nk细胞。因此，免疫疗法可以与本发明实施方案的tusc2疗法一起用作组合疗法的一部分。下面讨论联合治疗的一般方法。通常，肿瘤细胞必须带有一些易于靶向的标记，即不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标志物，并且这些中的任何一种都适合于在本发明实施方案的背景下靶向。常见肿瘤标志物包括癌胚抗原，前列腺特异性抗原，尿肿瘤相关抗原，胎儿抗原，酪氨酸酶(p97)，gp68，tag-72，hmfg，唾液酸lewis抗原，muca，mucb，plap，雌激素受体，层粘连蛋白受体，erbb和pl55。d.基因治疗在另一个实施方案中，二级治疗是基因治疗，其中治疗性多核苷酸在治疗组合物之前，之后或同时施用。用于表达基因产物的病毒载体是本领域熟知的，包括诸如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，疱疹病毒，慢病毒，包括痘苗病毒的痘病毒和包括sv40的乳头瘤病毒等真核表达系统。或者，表达构建体的施用可以用基于脂质的载体如脂质体或dotap：胆固醇囊泡完成。所有这些方法都是本领域公知的(参见例如sambrook等，1989；ausubel等，1998；ausubel，1996)。编码以下基因产物之一的载体的递送将对靶组织具有组合的抗过度增殖作用。多种蛋白质包括在本发明的实施方案中，其中一些在下面描述。e.细胞增殖的抑制剂如上所述，肿瘤抑制癌基因起到抑制过度细胞增殖的作用。这些基因的失活破坏了它们的抑制活性，导致不受调节的增殖。可用作根据本发明实施方案的二级治疗的基因包括p53，p16，rb，apc，dcc，nf-1，nf-2，wt-1，men-1，men-ii，zac1，p73，vhl，mmac1pten，dbccr-1，fcc，rsk-3，p27，p27p16融合，p21p27融合，抗血栓形成基因(如cox-1，tfpi)，pgs，dp，e2f，ras，myc，neu，raf，erb，fins，trk，ret，gsp，hst，abl，ela，p300，参与血管生成的基因(如vegf，fgf，血小板反应蛋白，bai-1，gdaif或其受体)，mcc和其他基因列于表iv。ii.程序性细胞死亡的调节剂细胞凋亡或程序性细胞死亡是正常胚胎发育，维持成体组织内稳态和抑制癌发生的必需过程(kerr等，1972)。bcl-2蛋白家族和ice样蛋白酶已被证明是其他系统中细胞凋亡的重要调节因子和效应子。与滤泡性淋巴瘤相关的bcl-2蛋白在控制细胞凋亡和增强细胞存活方面起着重要作用，以应对多种凋亡刺激(bakhshi等，1985；cleary和sklar，proc.nat'l.acad.set。美国，82(21)：7439-43、1985；cleary等，1986；tsujimoto等，1985；tsujimoto和croce，1986)。现在认识到进化上保守的bcl-2蛋白是相关蛋白家族的成员，其可以归类为死亡激动剂或死亡拮抗剂。在其发现之后，显示bcl-2起到抑制由各种刺激引发的细胞死亡的作用。而且，现在显然存在bcl-2细胞死亡调节蛋白家族，其具有共同的结构和序列同源性。已显示这些不同的家族成员具有与bcl-2相似的功能(例如，bcixl，bclw，bcls，mcl-1，al，bfl-1)或抵消bcl-2功能并促进细胞死亡(例如，bax，bak，bik，bim，bid，bad，harakiri)。e.手术大约60％的患有癌症的人将接受某种类型的手术，包括预防性，诊断性或分期，治愈性和姑息性手术。治愈性手术是可以与其他疗法结合使用的癌症治疗，例如本文提供的治疗，化学疗法，放射疗法，激素疗法，基因疗法，免疫疗法和/或替代疗法。治愈性手术包括切除，其中全部或部分癌组织被物理移除，切除和/或破坏。肿瘤切除是指至少部分肿瘤的物理移除。除肿瘤切除外，手术治疗还包括激光手术，冷冻手术，电外科手术和手术治疗(mohs手术)。进一步预期本发明的实施方案可以与去除浅表癌症，癌前病变或偶然量的正常组织联合使用。在切除所有癌细胞，组织或肿瘤的一部分后，可以在体内形成腔。可以通过灌注，直接注射或局部施用该区域以及另外的抗癌疗法来完成治疗。这种治疗可以重复，例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5重复一次。，6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以是不同的剂量。f.其他药剂预期其他药剂可与本文提供的组合物组合使用以改善治疗的治疗功效。这些另外的药剂包括免疫调节剂，影响细胞表面受体和gap连接上调的药剂，细胞抑制剂和分化剂，细胞粘附抑制剂，或增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α，β和γ；il-2和其他细胞因子；f42k和其他细胞因子类似物；或mip-1，mip-1β，mcp-1，rantes和其他趋化因子。进一步预期细胞表面受体或其配体如fasfas配体，dr4或dr5trail的上调将通过对过度增殖细胞建立自分泌或旁分泌作用来增强本文提供的组合物的凋亡诱导能力。通过提高gap连接的数量来增加细胞间信号传导将增加对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可以与本文提供的组合物组合使用，以改善治疗的抗体增殖功效。预期细胞粘附抑制剂可改善本发明的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(fak)抑制剂和洛伐他汀。进一步预期增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂，例如抗体c225，可以与本文提供的组合物组合使用以改善治疗功效。b.药物制剂本文提供的药物组合物包含有效量的p38mapk抑制剂。在其他实施方案中，本文提供的药物组合物包含有效量的一种或多种抗癌剂和p38mapk抑制剂。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当地施用于动物(例如人)时不产生不利，过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，本领域技术人员已知制备含有至少p38mapk抑制剂和任选的抗癌剂的药物组合物，如remington'spharmaceuticalsciences，18thed。mackprintingcompany，1990，在此引入作为参考。此外，对于动物(例如人)施用，应理解制剂应满足fda生物标准办公室要求的无菌，致热原性，一般安全性和纯度标准。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂，分散介质，包衣，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如，抗菌剂，抗真菌剂)，等渗剂，吸收延迟剂，盐，防腐剂，药物。，药物稳定剂，凝胶，粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂，甜味剂，调味剂，染料，类似物质及其组合，如本领域普通技术人员所知(参见，例如，remington'spharmaceutical)sciences，18thed.mackprintingcompany，1990，pp.1289-1329，通过引用并入本文。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑其在治疗或药物组合物中的用途。在某些实施方案中，药物组合物可包含不同类型的载体，这取决于它是以固体，液体还是气溶胶形式施用，以及它是否需要对于注射这样的施用途径是无菌的。在某些实施方案中，本文提供的药物组合物可以静脉内，皮内，动脉内，腹膜内，病灶内，颅内，关节内，胸膜内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，局部，肿瘤内，肌肉内，腹膜内，皮下，结膜下施用。，囊内，粘膜，心包内，脐内，眼内，口服，局部，局部，吸入(例如气溶胶吸入)，注射，输注，连续输注，直接局部灌注靶细胞，通过导管，通过灌洗，在乳膏中，脂质组合物(例如，脂质体)，或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或前述的任何组合(参见，例如，remington'spharmaceuticalsciences，18thed.mackprintingcompany，1990，在此通过引用并入)。在某些实施方案中，腹膜内施用药物组合物。在进一步的实施方案中，腹膜内施用药物组合物以治疗癌症(例如癌性肿瘤)。例如，可以腹膜内施用药物组合物以治疗胃肠癌。在某些实施方案中，可能不希望将药物组合物施用到肿瘤中或肿瘤附近。在某些优选的实施方案中，口服施用药物组合物以治疗癌症(例如，胃肠癌)。在某些实施方案中，施用于患者的组合物的实际剂量可以通过物理和生理因素确定，例如体重，病症的严重程度，所治疗疾病的类型，先前或同时的治疗干预，特发性疾病。患者和施用途径。在任何情况下，负责施用的从业者将确定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。在某些实施方案中，药物组合物可包含，例如，至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可占单位重量的约2％至约75％，或约25％至约60％，和其中可衍生的任何范围。在其他非限制性实例中，剂量还可包含每次施用约1微克/kg/体重，约5微克/kg体重，约10微克/kg体重，约15微克/kg体重，约20微克/千克/体重，约25微克/千克/体重，约30微克/千克/体重，约35微克/千克/体重，约0.04毫克/千克/体重，约0.05毫克/千克/千克体重，约0.06毫克/千克/体重，约0.07毫克/千克/体重，约0.08毫克/千克/体重，约0.09毫克/千克/体重，约0.1毫克/千克/体重，约0.2毫克/千克/体重，约0.5mgkg/体重或更多，以及其中可衍生的任何范围。在本文所列数字的可导出范围的非限制性实例中，可以基于上述数值施用约0.01mgkg/体重至约0.1mgkg/体重，约0.04μg/kg/体重至约0.08mgkg/体重等的范围。在组合物为液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等)，脂质(例如，甘油三酯，植物油，脂质体)及其组合。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，可以保持适当的流动性；通过分散在载体(例如液体多元醇或脂质)中维持所需的粒度；通过使用表面活性剂，例如羟丙基纤维素；或其组合这些方法。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖，氯化钠或其组合。在其他实施方案中，可以在本实施方案中使用滴眼剂，鼻腔溶液或喷雾剂，气溶胶或吸入剂。通常将这种组合物设计成与靶组织类型相容。在一个非限制性实例中，鼻腔溶液通常是水溶液，设计用于以滴剂或喷雾剂的形式给予鼻腔。制备鼻溶液使得它们在许多方面与鼻分泌物相似，从而保持正常的纤毛作用。因此，在优选的实施方案中，含水鼻用溶液通常是等渗的或略微缓冲的，以保持ph为约5.5至约6.5。此外，如果需要，可以在制剂中包括抗微生物防腐剂，类似于眼科制剂，药物或适当的药物稳定剂中使用的那些。例如，各种商业鼻用制剂是已知的并且包括诸如抗生素或抗组胺药的药物。在某些优选的实施方案中，口服组合物可包含一种或多种粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂，调味剂及其组合。在某些实施方案中，组合物可包含下列中的一种或多种：粘合剂，例如黄蓍胶，阿拉伯树胶，玉米淀粉，明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙，甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉，马铃薯淀粉，海藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖，乳糖，糖精或其组合；调味剂，例如薄荷，冬青油，樱桃调味料，橙子调味料等；或其组合如上所述。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有载体如液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂，丸剂或胶囊可以用虫胶，糖或两者包衣。适用于其他施用方式的其他制剂包括栓剂。栓剂是各种重量和形状的固体剂型，通常是药物，用于插入直肠，阴道或尿道。插入后，栓剂软化，融化或溶解在腔体液中。通常，对于栓剂，传统载体可包括例如聚亚烷基二醇，甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可以由含有例如约0.5％至约10％，优选约1％至约2％的活性成分的混合物形成。iv.实施例包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。实施例1-抑制foxc2恢复具有干细胞样特性的前列腺癌细胞中的上皮表型和药物敏感性psa-/lo前列腺癌干细胞样细胞表现出增强的emt特性。最近显示来自原发性人前列腺肿瘤以及来自各种pca细胞系的细胞的psa-/lo亚群代表自我更新。类似于pcasc的肿瘤增殖细胞(qin等，2012)。之前也证实，在乳腺癌中，emt是产生这种肿瘤增殖的干细胞样细胞的主要来源(hollier等，2013)。为了研究emt和psa之间的关系，从表达psa-启动子驱动gfp表达的雄激素反应性lncap细胞系中分离psa+和psa-/lo亚级分，如先前在qin等人，2012中所述，和分析了充分表征的emt标记物的表达。与psa+(gfp+)部分相比，psa-/lo(gfp-/lo)细胞明显出现更多的间充质(图1a)。qrtpcr(图1b)和蛋白质印迹(图1c)分析显示干细胞样p如所预期的，sa_1°细胞表现出显著减少的前列腺上皮分化(pd)标志物ar和psa的表达，同时已知的干细胞标志物bmi1和sox2以及ne分化标志物的表达升高(图1b)。另外，psa-/lo细胞还表现出上皮标志物e-钙粘蛋白的显著降低的表达，以及间充质标志物和中枢emt调节剂foxc2的表达增加(图1b，c)。免疫荧光染色进一步证实了e-钙粘蛋白的表达和质膜定位的丧失，伴随着csc标志物zeb1(wellner等，2009；chaffer等，2013)和psa-/lo细胞中的foxc2的表达的增加(图1d)。)。这些结果表明，即使在雄激素依赖性lncap细胞系中，类似于干细胞样细胞的psa-/lo细胞也显示出emt表型以及ne样特征。雄激素非依赖性转移性pca细胞系具有增加的emti干细胞样特征。虽然lncap细胞具有雄激素依赖性和侵袭性差，但雄激素非依赖性du145和pc3细胞侵袭性更强且具有显著更高的转移潜能(pulukuri等，2005)。观察到lncap细胞主要表现出上皮特征，包括ar的表达。psa和e-钙粘蛋白(图1e，f)。另一方面，du145和pc3细胞表现出显著增加的emt相关间充质标志物以及ne分化标志物的表达，同时e-钙粘蛋白水平丧失(图1e，f)。有趣的是，foxc2的表达局限于雄激素非依赖性转移细胞系-du145和pc3，并且在弱侵袭性非转移性lncap细胞中几乎检测不到(图1f)。由于已知foxc2赋予肿瘤细胞在乳腺癌中具有干细胞属性，因此测试这些pca细胞系的干细胞特性，包括它们形成前列腺的能力，以及干细胞相关细胞表面标志物cd44和cd24的表达(hurt等，2008)。与它们在非贴壁培养物中降低的球形成能力相关，弱侵袭性lncap细胞含有少于1％cd44hicd24lo干细胞富集的部分(图1g，h)。相反，超过85％的转移性du145细胞是cd44hicd24lo(图1g，h)，与其他已知干细胞标志物bmi1和sox2的表达增加一致(图1e)。还观察到表达高水平内源性foxc2-du145和pc3的两种pca细胞系形成显著更高数量的肿瘤球(图ie)，表明与具有非常低的foxc2表达的lncap细胞相比更高的干细胞样潜力。有趣的是，具有较高转移潜能和增强的干细胞特性的pca细胞始终缺乏arpsa表达(图1e，f)。foxc2表达预示与arpsa表达缺失，较差的gleason评分和复发的pca相关的雄激素非依赖性状态。先前发现foxc2不在分化的乳腺癌细胞中表达，但在emt后显著上调，并且富含csc级分(hollier等，2009)。因此检查了pca细胞中emt的诱导是否会同样导致foxc2的上调。实际上，发现snail或zeb1的过表达导致emt和ne转分化的诱导，并且最重要的是，foxc2的显著上调，伴随雄激素依赖性lncap细胞中arpsa表达的丧失(图2a、c、d)。相反，在高转移性du145细胞中抑制emt诱导基因如snail或zeb1导致foxc2表达或ne样特征的显著丧失，arpsa表达的恢复(图2b，e，f)。总之，这些发现表明foxc2可能在pca细胞中的各种emt途径的下游起作用。为了进一步研究foxc2在前列腺肿瘤进展中的生理学意义，分析了包含非复发性和复发性pca样品的gds4109geo数据库。值得注意的是，foxc2表达在复发样品中显著更高(图2g)。此外，在2个独立的可公开获得的数据集[gse17356(图2h)和tcga(图2i)中发现显著增加的foxc2水平与高gleason分级之间的直接相关性。为了证实这些观察结果的相关性，对患者来源的原发性前列腺组织样本中的foxc2蛋白进行了ihc分析，范围从良性前列腺增生(bph)到前列腺上皮内瘤变(pin)，再到高级gleason7。有趣的是，相关性在foxc2的高表达和高gleason分级之间发现了相关的不良临床结果(图2j，图8)，重申了早先的观察结果。此外，在以缺乏ar为特征的人前列腺侵袭性小细胞癌中，观察到foxc2的显著升高的表达(图9)。类似地，在人类前列腺肿瘤的患者衍生的异种移植物(pdx)模型中，例如去势抗性，神经内分泌特征和ar的丧失(tzelepi等人，2012；aparicio等人，2011)，一致地观察到增加的foxc2表达(图10)。总之，这些数据表明foxc2在pca细胞中的表达与雄激素非依赖性状态分离，其与增加的严重性相关。foxc2的强制表达诱导emt/csc表型和增加的药物抗性。由于foxc2在几种不同的emt诱导剂的下游被诱导，并且其本身能够增强多种独立emt信号的作用(taube等人，2010)，因此询问foxc2的异位表达将如何影响上皮样lncap的行为。细胞，雄激素依赖性的。事实上，foxc2的过表达导致产生显示经典间充质表型的细胞(图3a-上图)并诱导emt标记物的表达(图3b，c)，以及显著上调已知的干细胞标志物，bmi1和sox2(图3b)，以及常见的临床ne标志物(图3b)。这也伴随着肿瘤球形成的显著增加(图3d)，表明增强的干细胞样功能。同样，foxc2诱导的emt与psa-启动子活性的降低(通过gfp损失确定)相关(图3a-下图)，以及ar表达的丧失(图3b，c)。还观察到使用mts细胞，foxc2表达使得雄激素依赖性lncap细胞对恩杂鲁胺(图3e)(常见的抗雄激素)和多西紫杉醇(图3f)(pca中常用的化学治疗剂)的抗性越来越强。生存测定。foxc2的抑制降低了干细胞样特性，并恢复了arpsa表达以及药物敏感性。为了证实foxc2介导的emt在pca细胞中干细胞属性的产生和维持中的贡献，foxc2表达在雄激素非依赖性du145细胞中被稳定敲低，已显示(图1)显著含有高干细胞富集的部分。foxc2表达的丧失导致在du145细胞中获得均匀的上皮表型，其已知具有异质形态(图3g)，以及emt和ne样特征的逆转(图3h，i)。有趣的是，当foxc2表达丧失时，观察到arpsa水平的显著上调(图3h-j)。这伴随着du145细胞中自我更新潜能和干细胞特性的大量降低(图3k，l，m)，包括bmi1和sox2的表达(图3h)。du145细胞是雄激素非依赖性的并且对ar抑制剂恩杂鲁胺不敏感，甚至在10μm27。然而，这些细胞中foxc2的抑制使得它们甚至在100nm时对恩杂鲁胺更敏感，如通过mts细胞存活测定所确定的(图3n)。pca中多西紫杉醇抗性的出现仍然是重要的治疗障碍，并且du145细胞代表了用于研究改变多西紫杉醇抗性的机制的良好模型系统(tamaki等，2014)。有趣的是，foxc2表达的丧失使得du145细胞对100nm多西紫杉醇处理更敏感(图3o)。总之，这些结果表明foxc2表达对于诱导与arpsa表达丧失和雄激素非依赖性和化学抗性的出现相关的pcasc属性是必要且足够的。foxc2通过zeb1(已知的转录阻遏物)调节ar。值得注意的是，尽管foxc2在所研究的大多数细胞类型中起转录激活剂的作用，但其在pca细胞中的表达导致arpsa水平的急剧损失。在这种情况下，揭示我们实验室在乳腺癌细胞中进行的平行研究是恰当的，这证明foxc2通过已知的转录抑制因子zebl间接发挥其抑制作用。因此，研究了类似的连接是否在pca细胞中起作用。在过量表达foxc2的lncap细胞中，观察到zeb1的强制性丧失显著地消除了foxc2的ar抑制作用(图4a)，以及它们的干细胞样特性(图4b)和对恩杂鲁胺的抗性(图4c)。此外，缺乏foxc2表达的du145细胞中zeb1的过表达足以引起ar水平的显著下调(图4d)，球形成能力的恢复(图4e)和对恩杂鲁胺的抗性(图4f)。这些数据表明，与ar表达缺失相关的foxc2决定的pcasc属性和adt抗性的出现是由zeb1介导的。p38mapk信号传导的激活与foxc2相关的emt/干细胞样特征相关。已知p38丝裂原活化蛋白激酶(mapk)在细胞增殖，分化，凋亡，侵袭和迁移-分布中发挥关键作用，这些在癌症进展过程中均发生显著改变(koul等，2013)。在一项使用乳腺癌细胞的平行研究中，发现foxc2不仅具有p38-mapk14的功能性磷酸化位点，而且foxc2和p38(磷酸-p38)的活性形式在经历过emt的细胞中始终很高，以及富含csc的细胞群。事实上，观察到具有固有间充质和干细胞特性的pca细胞(du145pc3相对于lncap，或psahi相对于psa-/lo)表现出显著增加的p-p38及其直接靶标，激活转录因子-2(patf2)(图5a-d)，其与foxc2表达强烈相关(图1b-f，图5c，d)。使用转化生长因子-β1(tgf-β)在另一种前列腺emt诱导模型中进一步测试foxc2表达和p38活化之间的这种相关性。tgfβ是p38信号传导的充分表征的激活剂，并且已经显示在包括前列腺在内的多种上皮细胞类型中诱导emt(shiota等，2012)。用tgfβ处理lncap细胞导致中度诱导emt，foxc2表达，以及p38信号传导的同时激活(图5e)和增加的干细胞样功能(图5f)。相反，使用ly364947抑制du145细胞中的tgfβ信号传导导致foxc2表达和p38信号传导的伴随丧失(图5e)，具有显著降低的肿瘤形成能力(图5f)。总之，所有上述数据表明，通过干扰p38信号传导靶向foxc2可提供预防雄激素不敏感性pca细胞中csc产生/功能的治疗溶液。有趣的是，在人foxc2蛋白上发现了在共有序列内携带的潜在p38磷酸化位点(图5g)。接下来，在pca细胞中研究了该推定位点在促进foxc2介导的干细胞功能方面的功能相关性。虽然模拟组成型p38磷酸化的s367e-foxc2突变体的表达增强了球形成和与ar损失相关的zeb1表达，但s367a-foxc2突变体(代表f38c2的非p38-可磷酸化形式)导致干细胞功能和zeb1表达，伴随ar表达的恢复(图5h，i)。这些结果表明foxc2可能是pca细胞中p38的直接靶标，而且，s367位点在介导这些细胞中的foxc2功能中起关键作用。p38信号传导的抑制导致emt的逆转和干细胞样特性的显著降低。用p38信号传导的特异性化学抑制剂sb203580处理du145细胞7天，导致它们获得上皮表型(图6a)，迁移潜能显著降低(图6b，c)。这伴随着foxc2表达和随后的emt/csc特征的显著丧失(图6d，e)，包括cd44hicd241d部分的显著减少(图6f，g)，bmi1和sox2的表达(图6d)和肿瘤球形成(图6h)。有趣的是，使用sb203580抑制p38信号传导和foxc2表达导致du145细胞中ar和psa表达的恢复(图6d，e，i)。在sb203580处理后第0-7天逐步进行qrtpcr，发现ar，psa和e-钙粘蛋白的表达在48小时后立即一直增加，但在第7天达到最高水平(图11)。有趣的是，这样的arpsa表达的恢复与sb203580预处理引起的foxc2同时丧失，使这些细胞显著重新敏化，随后与sb203580和恩杂鲁胺(图6j)或多西紫杉醇(图6k)共同处理，表明组合方法可能有效靶向对adt和标准化学疗法具有抗性的高侵袭性pca细胞。用恩杂鲁胺治疗组合抑制p38信号传导显著降低了肿瘤大小。为了研究抑制foxc2依赖性emt/csc属性对体内肿瘤形成的影响，在形成可触知肿瘤后，向nodscid小鼠皮下注射du145细胞并开始体内治疗。治疗计划/时间表如图2所示。虽然与载体治疗组相比，用sb203580或恩杂鲁胺单独治疗的小鼠的肿瘤大小没有明显变化，但用sb203580和恩杂鲁胺的组合治疗的小鼠显示出肿瘤体积和重量的显著降低(图7b-e，图12)。这表明虽然亲本du145细胞开始时具有恩杂鲁胺抗性，但是用p38抑制剂和恩杂鲁胺共同处理细胞再次赋予对adt的易感性。在体外结果的直接证实中(图6)，这种组合治疗在携带侵袭性du145肿瘤的小鼠中，降低foxc2表达和随后的emt/cscne特征，并促进肿瘤中arpsa表达的恢复(图7f，g)。长期以来，已经认识到emt为肿瘤细胞提供“护照”，允许它们侵入组织边界并进入循环。然后这些“改变的”循环肿瘤细胞(ctc)继续播下种子以进行远处转移。为了支持促进前列腺肿瘤细胞流入循环的foxc2介导的emt/csc特性的重要作用，我们确实观察到组合治疗显著减少了小鼠中ctc的数量，定量为从血液中分离的rfp阳性ctc集落(图7h)。重要的是要注意，通过其下游靶标psa的上调判断，侵入性ar-/lodu145pca细胞中foxc2的抑制足以恢复ar表达和功能(图3、6、7)。恢复arpsa表达和相关的上皮状态与干细胞功能的丧失(使用sb203580，或直接，通过foxc2抑制)使这些雄激素非依赖性细胞再次对多西紫杉醇和恩杂鲁胺敏感，致瘤基因大量丧失类似的特征(图3、6、7)。这些观察结果进一步支持了雄激素和ar在前列腺中表现出至关重要的肿瘤抑制作用的观点。正是在这种背景下，提出了伴随使用p38抑制剂，其提供了阻止foxc2介导的emt/csc属性的双重益处，同时恢复了ar衍生的保护。总之，已经证明foxc2是前列腺癌干细胞样特征的重要决定因素，决定了生化转变为adt-和化学抗性(图7i)。因此，本文提供了一种新颖且有形的方法，以至少部分地通过全身抑制p38信号传导来体内靶向foxc2功能。靶向foxc2通过阻止emt以及ne转分化来减少前列腺肿瘤细胞的可塑性。未来的努力将直接用于检查foxc2功能的分子基础，因为它代表了在支持变异形式的pca(如nepc或小细胞前列腺癌)的患者的显著亚群中决定干细胞功能和肿瘤进展的基本机制的基础，其定义为缺乏arpsa表达，以及adt后出现的转移性crpc。实施例2-材料和方法细胞系：从atcc获得经鉴定的lncap，du145和pc3细胞，并在含有10％胎牛血清(fbs)和青霉素/链霉素的rpmi中培养。过表达emt转录因子和shrna的细胞也在相同的培养基中培养。将hek293t细胞在含有10％fbs和青霉素/链霉素的dmem中培养。最近证实，用于该研究的所有细胞系均对支原体污染呈阴性。tgfβ，ly364947和sb203580分别以5ngml，1μm和5μm的终浓度使用。抑制剂实验-细胞培养：为了评估抑制p38mapk信号传导的效果，用溶解在水中的5μmsb20358045(emd-millipore)处理细胞7天。为了评估p38mapk抑制和ar拮抗剂恩杂鲁胺(scher等，2012)(selleckchem)或化学治疗多西紫杉醇(lclaboratories)的联合作用，将细胞与sb203580和恩杂鲁胺/多西紫杉醇共同处理7天。重要的是要注意，在我们的实验中用于治疗pca细胞的sb203580的浓度导致p38mapk信号传导的选择性抑制，如(davies等，2000)中所建议的。没有观察到另一种潜在靶标akt1的磷酸化的明显变化。表1：靶shrna序列靶shrna序列(5’to3’)foxc2(#4)ccagtgcagcatgcgagcgatfoxc2(#5)agaacatcatgaccctgcgaazeb1(625)taatttgtaacgttattgczeb1(184)tattctctatcttttgccgsnail(1)acttcttgacatctgagtgsnail(2)tgtggagcagggacattcg表2：抗体表3：引物序列载体：先前已在qin等人，lull中描述了pcs-psap-egfp-dsred载体的使用。pqxip-zeb1由harikrishnanakshatri博士(印第安纳波利斯印第安纳大学)和pbabepuro-snail，pbabepuro-foxc2和pmig-foxc2由robertweinberg博士(whiteheadinstitute，麻省理工学院)提供。通过定点诱变产生s367e-foxc2和s367a-foxc2突变体构建体，并亚克隆到逆转录病毒载体mscv-ires-gfp中。具有shfoxc2和shsnail的plk01慢病毒载体和具有shzeb1的pgipz慢病毒载体从mdandersonshrnacorefacility获得。靶向foxc25'utr的不同区域的两个独立shrna序列用于foxc2敲低，具有类似的结果(显示的数据代表其中之一)。同样，对于shsnail和shzebl也是如此。靶向萤火虫荧光素酶(shff3)的shrna用作对照。序列详细信息见表1。循环肿瘤细胞的分离：在处死小鼠后立即通过静脉穿刺在edta处理的收集管中分离～100μl血液并储存在冰上。在30分钟内，将血液以1200rpm旋转5分钟，并将沉淀重悬于1mlack-裂解缓冲液(lifetech)中并进一步温育3-5分钟。用pbs洗涤细胞一次，重悬浮于含有10％fbs和penstrep的rpmi中，并在10cm组织培养皿上培养。在培养3-4天后计数rfp阳性集落(源自注射到小鼠中的标记的du145细胞)并定量。如前所述(sarkar等，2015)进行免疫印迹，免疫荧光，rtpcr，伤口愈合和肿瘤球测定。抗体和引物细节分别在表2和3中提供。使用celltiter96aqueousone-solutioncellproliferationassay试剂盒(promega)评估细胞活力(mts)。免疫组织化学：代表bph，pin，晚期gleasongrade7和nepc的人前列腺肿瘤组织样品获自drs。nupam和kiranmahajan。病理评估由两位独立的病理学家进行，他们同意ihc评分和标记的阳性模式表达。ihc评分本身使用h-score系统以“盲法”方式(其中记分员无法获得疾病分类/组分配信息)进行，包括强度(0至3+)和阳性细胞百分比(从0到100％)，最终得分范围从0到300。流式细胞术：使用bdinflux分选仪如先前(hollier等，2013)所述进行psahi和psa-lo细胞和cd44hi和cd24lo细胞的荧光激活细胞分选(facs)。动物实验：～4周龄雄性nod.cb17-prkdcscidj小鼠购自jacksonlaboratory(maine，usa)。所有动物程序均由utmdacc的机构动物护理和使用委员会验证和批准。为了研究原发性前列腺肿瘤形成，将2x106rfp-荧光素酶标记的du145细胞皮下注射到6周龄雄性nodscid小鼠的两侧。一旦可触及可触及的肿瘤，将携带肿瘤的小鼠随机分成4组，每24小时开始药物治疗，持续5天/周。将sb203580(0.2μmol，100μl/20g小鼠)，恩杂鲁胺(10mgkg)或两种药物(或媒介物)的组合皮下施用，并如前所述评估肿瘤生长(hollier等，2013)。在评估实验结果时，研究人员对组分配不知情。在治疗期结束时，切除肿瘤，使用卡尺计算平均直径，并记录肿瘤重量。然后处理肿瘤用于rna分离和/或在福尔马林中固定，石蜡包埋，切片并用苏木精/曙红和patf2-，ar-和foxc2抗体染色。统计学分析：除非另有说明，否则所有样品一式三份进行测定。所有体外实验重复至少3次，每次研究中所有动物实验包括每组至少5只小鼠。除非另有说明，否则数据表示为平均值±sem，并且使用学生的非配对双尾t检验计算显著性。实施例3-通过p38磷酸化foxc2的丝氨酸367调节zeb1和乳腺癌转移，而不影响原发性肿瘤生长foxc2表达与显示间充质细胞和干细胞性状的细胞中的p38活化相关。为了鉴定可能调节foxc2功能的激酶，使用scansite分析其氨基酸序列的推定磷酸化位点，scansite是一种在线搜索引擎，可识别可能被已知丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶磷酸化的短蛋白序列基序(obbenauer等，2003))。在高严格条件下，我们鉴定了与foxc2的丝氨酸367(s367)相关的p38的进化上保守的共有磷酸化基序(图13a)。由于foxc2表达仅限于具有干细胞特性的细胞，因此推测如果p38是foxc2功能的主要上游正调节剂，则p38，磷酸化p38(p-p38)的活性/磷酸化形式将是仅存在于表达foxc2的细胞中。因此，永生化人乳腺上皮细胞(hmle)(elenbaas等，2001)通过异位表达snail，twist，tgfi或goosecoid(gsc)以及两种富含csc的人乳腺癌细胞系实验诱导经历emt。分析已知表达高水平内源性foxc2的(sum159，mda-mb-231)。使用免疫印迹(图13b)和免疫荧光(图19a)，在表达foxc2的干细胞富集的间充质乳腺细胞系中检测到显著升高的p-p38水平相对于其更分化的上皮对应物(hmle-载体，mcf7)(图13b；19a)。值得注意的是，在所有病例中都发现了可比较的p38总水平(图13b)。为了检查p-p38和foxc2之间的功能关系，用吡啶基咪唑sb203580处理一系列细胞系，其通过结合atp结合口袋抑制p38催化活性，而不阻止上游激酶的p38磷酸化(kumar等)。al。，1999)。相对于载体处理的对照，sb203580引起foxc2蛋白水平的一致且显著的降低，表明p38调节foxc2稳态水平(图13c，19b)。为了证实p38的参与，使用了使p38水平降低50-70％的shrna，并且与对照shrna相比，观察到foxc2蛋白水平显著降低(图1d)。重要的是，sb203580和p38shrna都不具有对foxc2转录物水平的可辨别的作用(图19c，19d)。此外，蛋白酶体抑制剂mg132在sb203580处理后拯救了foxc2的蛋白水解降解(图13e)。与伤口部位的emt活化一致(yan等，2010)，发现p-p38和foxc2在上皮hmle细胞单层中诱导的划痕前缘的细胞核中积累。伤后9小时诱导(图13f)。此外，sb203580处理消除了foxc2在前沿的上调(但不是p-p38的上调，因为sb203580不影响p38磷酸化)。总之，这些发现揭示了磷酸化p38的存在和foxc2表达在显示间充质细胞之间的显著的相关性和干细胞的性状，以及在诱导伤口愈合期间经历emt，并且表明p38的乳腺上皮细胞中调节foxc2蛋白水平通过翻译后机制。p38在s367处使foxc2磷酸化。为了确定p38和foxc2是否彼此相互作用，我们在mda-mb-231细胞中进行了相互免疫共沉淀研究，发现内源性p38与foxc2共免疫沉淀，反之亦然(图14a，14b)。ha标记的p38和myc标记foxc2共表达在hek293t细胞，免疫沉淀或者ha或myc和通过分别与myc-和ha-抗体的免疫印迹(图14c和14d)进行分析所得到的免疫沉淀物。这些数据证实了foxc2和p38之间的直接相互作用，其取决于p38的活化状态，因为当转染期间p38(ha-p38-dn)的激酶死亡突变体被取代时它被消除(图14d)。这表明，除其他因素外，p38与foxc2的相互作用取决于p38催化裂缝的构型。为了证实foxc2用作p38底物，进行了体外激酶测定(图14e)。用n末端截短的foxc2检测foxc2的p38的依赖性磷酸化，包括氨基酸245-501，但不具有c-末端截短的foxc2，编号氨基酸1-244，缺乏推定的p38磷酸化位点的。此外，当s367突变为不可磷酸化的丙氨酸残基时，未观察到foxc2磷酸化(s367a；图14e)。总之，这些数据表明p-p38与foxc2物理相互作用并在s367处使其磷酸化。靶向p38选择性地抑制转移，使原发性肿瘤生长不减弱。考虑到foxc2在赋予转移能力方面的作用，上述数据表明，使用p38抑制剂破坏p38-foxc2相互作用可能会扰乱肿瘤进展。为了研究这一点，采用了4t1小鼠乳腺癌模型，该模型概括了人乳腺癌的许多特征。最值得注意的是，4t1细胞可自发地从原位implantation-乳腺gland-一个站点以在同系野生型免疫活性小鼠宿主中肺转移(aslakson等人，1992；珀拉斯凯等人，2001)。首先，在用sb203580处理4t1细胞后证实了内源foxc2蛋白水平的显著降低(图15a)。接下来，将荧光素酶标记的4t1细胞原位植入40只雌性balbc小鼠的第四乳房脂肪垫中，并每天用载体或sb203580(每组20只小鼠)处理它们。使用卡尺测量和生物发光每周监测肿瘤进展。从植入后第3周开始，每组5只小鼠被处死并通过手术切除原发性肿瘤并通过外科手术切除肺。出乎意料的是，sb203580处理的小鼠相对于媒介物处理的对应物形成了相似大小的原发性肿瘤(图15b，左图)。通过卡尺测量(图15c)和由这些肿瘤发射的生物发光信号(图20a，20b)证实了这一观察结果。实际上，在该时间过程中载体和sb203580处理的原发性肿瘤的潜伏期和生长速率没有显著差异(图15c和20b)。与对原发性肿瘤的观察相反，用sb203580全身治疗的小鼠表现出明显更少的肺转移，如相对于载体处理的对应物显著降低的生物发光信号所证明的(图15b，右图和15d)。与这些观察结果一致，宏观和组织学检查显示载体处理的小鼠的肺中存在多个结节，而sb203580处理的对应物的肺中的结节少得多(图20c，20d)。总的来说，这些发现表明p38抑制选择性地预防转移，而不影响原发性肿瘤的形成和生长。在植入后3-6周期间，从媒介物和sb203580处理的对应物收集血液，并量化从血液中分离并作为rfp阳性集落培养的循环肿瘤细胞(ctc)的数量。引人注目的是，虽然ctc能够从载体处理的小鼠中恢复，但即使植入后3周，也没有从sb203580处理的小鼠中回收ctc直到第5周，并且在第6周，很少有ctc从sb203580处理的小鼠中回收。(图15e)。有趣的是，p38和foxc2都与肿瘤血管生成有关(yoshizuka等，2012；kume等，2012)。然而，通过cd31免疫组织化学和图像分析量化的微血管密度分析未显示与载体处理的对应物相比sb203580处理的小鼠的原发性肿瘤的脉管系统的显著差异，这可能解释了sb203580中缺乏ctc。处理过的老鼠。这些发现表明p38抑制会损害ctcs的内渗。由于许多乳腺癌患者具有隐匿性微转移，在诊断时，转移通常归因于原发性肿瘤手术切除之前或期间肿瘤细胞的全身性传播(pantel等，1999；fehm等，2008)，检查p38抑制是否也可以预防定植和进展为巨大转移。为此，采用实验性转移模型，其绕过转移级联的早期步骤。通过nodscid小鼠的尾静脉注射荧光素酶标记的mda-mb-231细胞，并使用生物发光监测肺转移的出现。与使用4t1模型的观察结果一致，在植入后48小时开始每天注射sb203580与载体处理的小鼠相比显著降低了转移负荷并延长了无事件存活(图21a，21b)。为了消除“脱靶”效应的可能性，给小鼠静脉内注射表达对照shrna或p38shrna的mda-mb-231细胞。这些数据表明p38抑制也可以减少远端部位的定植。结论是，尽管p38抑制不会显著影响原发性肿瘤的生长，但它会对ctc数量，肺定植以及最终的转移产生负面影响。p38抑制在体外损害emt和干细胞性状。上述发现表明p38可能调节与导航/完成侵袭-转移级联相关的特定细胞属性(valastyan等，2011)。由于foxc2敲低阻止了emt和干细胞特性的获得，因此研究了p38抑制对这些相互缠绕过程的影响。为了确定抑制p38是否阻碍emt的起始，使用两种动态emt诱导模型。首先，用引发emt的tgfβ处理mcf10a永生化人乳腺上皮细胞。发现通过伴随sb203580处理抑制p38抑制foxc2和间充质标志物(纤连蛋白，波形蛋白)的上调并防止tgfβ处理的细胞中上皮标志物e-钙粘蛋白的下调(图16a)。其次，使用诱导型emt系统，其中包含emt诱导转录因子snail或twist的融合蛋白和雌激素受体(er)的雌激素结合结构域在上皮hmle细胞中稳定表达(hmle-snail-er)。，hmle-twist-er)。er-配体他莫昔芬(4-oht)的加入促进了snail-er和twist-er蛋白的核转位并引发emt。虽然单独4-oht处理引发emt(图16b，泳道4、5)，但同时暴露于4-oht和sb203580的hmle-snail-er细胞未能经历emt或上调foxc2(图4b，泳道9，10)。另外，4-oht处理的hmle-snail-er和hmle-twist-er细胞在sb203580暴露后未能获得球形成潜力(图16c)和干细胞相关的cd44高cd24低标记物谱(图16d)。。类似地，p38shrna消除了hmle-twist-er细胞经历emt的能力(图4e，比较泳道4至8)并反应于4-oht处理形成球体(图16f)。总之，这些结果表明p38抑制损害了emt的起始和由众所周知的emt诱导剂引起的干细胞属性的获得。接下来确定p38抑制是否损害了建立的emt表型的维持。实际上，发现间充质hmle-snail，hmle-twist，mda-mb-231和sum159细胞暴露于sb203580引起间充质和干细胞性状的不同程度的抑制(图16g-16l)。因此，相对于溶媒处理，sb203580处理改变了emt标记的表达(图16g)，并且显著减少了球形成(图16h)和显示cd44高cd24低抗原谱的细胞百分比(图161)。细胞。与emt赋予增加的迁移潜力的事实一致，sb203580显著降低了划痕/伤口愈合测定中间充质细胞的迁移能力(图16j)。此外，与对照shrna对应物相比，表达靶向p38或foxc2的shrna的hmle细胞显示出显著降低的迁移能力(图16k)。这些结果证明了p38介导的foxc2磷酸化在引发伤口闭合中的重要作用，这与我们早先的观察结果一致，即在受伤的sb203580处理的hmle单层的前沿缺乏foxc2核染色(图13f)，其未能重新填充划痕造成的空白。研究了p38抑制对侵袭潜力的影响，其与侵袭伪足的形成密切相关。这些基于肌动蛋白的特化细胞膜突起分泌基质金属蛋白酶，使附近的细胞外基质降解(eckert等，2011)。通过评估细胞降解fitc-缀合的明胶的能力来量化侵袭性伪足的形成。使用该测定法，发现载体处理的hmle-snail和hmle-twist细胞在16小时内降解了下面的细胞外基质，而sb203580处理的对应物未能达到相同程度(图16l；22)。总的来说，这些结果表明p38信号传导不仅在emt程序的启动中发挥关键作用，由各种emt诱导剂发起，而且它还积极维持emt的维持及其赋予的干细胞属性。p38通过foxc2控制emt和干细胞性状。确定foxc2是p38底物后，接下来确定foxc2(s367)的磷酸化是否对获得emt和干细胞性状至关重要。为此，产生磷酸化模拟foxc2(s367e)和不可磷酸化的foxc2(s367a)突变体，并评估它们相对于野生型foxc2(称为foxc2)赋予间充质和干细胞性状的能力。foxc2和foxc2(s367e)均在ras转化的hmle细胞(hmler)中引发emt，如通过获得细长的纺锤形形态(图17a)，e-钙粘蛋白的丧失和间充质标记物的获得所证明的(图17b，车道2和3)。相反，foxc2(s367a)突变体-尽管以相当的水平令人惊讶地表达-未能诱导emt(图17a和b，泳道4)。此外，foxc2或foxc2(s367e)突变体的异位表达增强了hmler细胞的球形成潜力(图17c)并促进向cd44高cd24低抗原谱21的转变(图17d)。此外，尽管sb203580如预期的那样降低了hmler-foxc2细胞的球形成能力，但hmler-foxc2(s367e)细胞即使在sb203580存在下也保留了形成球体的能力(图17e)。在上述测定中，不可磷酸化的foxc2(s367a)突变体不促进球形成(图17c和e)并且与cd44lowcd24high上皮细胞表面标志物谱相关(图17d)。最后，尽管sb203580抑制hmler-载体(>70％)和hmler-foxc2细胞(>70％)的迁移，但hmler-foxc2(s367e)细胞在伤口闭合中仅表现出适度降低(<30％)(图.17f)。总的来说，这些发现表明p38介导的foxc2的s367残基的磷酸化使其能够在体外赋予组合的emt和干细胞属性。p38介导的foxc2磷酸化促进转移。接下来测试p38介导的foxc2磷酸化是否增强其赋予转移能力的能力。首先，证明了尽管sb203580处理载体转导的4t1细胞消除了内源性foxc2蛋白水平，但磷酸化模拟foxc2(s367e)水平保持不变(图18a)。因此，尽管sb203580损害了载体转导的4t1细胞的球形成效率，但4t1-foxc2(s367e)细胞对p38抑制是难以控制的(图18b)。接下来，将表达空载体或foxc2(s367e)的荧光素酶标记的4t1细胞原位植入balbc小鼠的乳房脂肪垫中，随后用sb203580处理这些小鼠。与早期发现类似，在携带4t1-载体或4t1-f0xc2(s367e)细胞的小鼠中，sb203580处理后原发性肿瘤生长没有显著差异(图18c)。此外，与媒介物处理的对应物相比，携带4t1-载体细胞的sb203580处理的小鼠中肺转移的发生率降低了>20倍(图18d和18e)。形成鲜明对比的是，在携带4t1-f0xc2(s367e)细胞的小鼠中可以检测到许多肺结节，并且最重要的是，与载体处理的4t1载体相比，sb203580未能显著降低转移负荷(图18d和18e)。和4t1-f0xc2(s367e)对应物。p38介导的foxc2磷酸化调节zeb1表达。为了鉴定p-p38和foxc2的潜在下游介质，分析了来自hmler-foxc2细胞的相对于hmler-载体对应物的先前微阵列数据(geo登录号：gse44335)，并且转录因子zeb1被鉴定为高度上调的基因之一。(116倍)在hmler-foxc2细胞中(图23)。首先，通过qrt-pcr在hmler-foxc2细胞和hmler-载体细胞中证实了升高水平的foxc2和zeb1转录物(图19a)。此外，免疫印迹揭示诱导经历emt和富含csc的细胞系的细胞中升高的foxc2和zeb1蛋白水平之间的正相关性(图19b)。在细胞水平，免疫荧光证明foxc2和zeb1共定位于hmle-snail和hmle-twist细胞的细胞核中(图19c)，并且foxc2敲低引起zeb1染色强度的显著降低(图19d)。因此，在一组细胞系中shrna介导的foxc2抑制产生zeb1mrna降低>50倍(图19e)和zeb1蛋白水平降低>80％(图19f)。此外，与zeb1和mir-200家族成员的相互调节一致(burk等人，2008)，与载体转导的对应物相比，在hmler-foxc2细胞中观察到mir-200b和mir-200c的水平降低(图19g)。相反，与对照shrna转导的对应物相比，在foxc2敲低后，在mir-200b中发现增加>50倍，并且mir-200c增加>1000倍(图19h)。为了确定foxc2是否直接调节mir-200或zeb1表达，分析了染色体1和12上的mir-200簇的启动子区以及zeb1启动子，并鉴定了zeb1启动子内的保守的foxc2结合元件。实际上，使用染色质免疫沉淀，发现foxc2优先结合zeb1转录起始位点上游约12.5kb(～12.5kb)的区域(图19i)，因此证实foxc2是zeb1的直接转录调节物。与foxc2转录调节zeb1的发现一致，并且p38抑制减少foxc2表达，与载体处理的细胞相比，sb203580处理后zeb1mrna和蛋白质水平降低>60倍(图19j和19k)。此外，为了支持p38介导的foxc2磷酸化调节zeb1表达的观点，仅在hmler-foxc2和hmler-foxc2(s367e)细胞中检测到升高的zeb1蛋白水平(图19l，泳道2和3)，但不是在hmler-foxc2(s367a)细胞中(图19l，泳道4)。此外，当用sb203580处理表达foxc2变体的hmler细胞时，hmler-foxc2细胞中的zeb1蛋白水平降低(图19l，泳道6)，但在hmler-foxc2(s367e)细胞中保持相对高水平(图19k，泳道7)。总之，这些发现证明p38介导的foxc2磷酸化直接调节zeb1的表达。先前报道了foxc2是emt，干细胞特性和转移能力的关键调节剂。然而，foxc2是转录因子的事实使得其在药理学上难以抑制(darnell等人，2002)。在此，丝氨酸/苏氨酸特异性激酶p38被鉴定为foxc2功能的可药用上游调节剂。在s367，p38对foxc2的磷酸化调节foxc2蛋白质稳定性，促进其下游靶标zeb1的表达，并调节其赋予体外emt特性和干细胞属性以及体内转移能力的能力。该发现支持存在两种csc亚型：具有肿瘤起始能力的csc，其支持原发性肿瘤生长，并且csc具有促进转移性生长的双重肿瘤起始和转移能力。抑制p38-foxc2信号传导仅阻止转移而不是原发性肿瘤的发现表明p38-foxc2途径可用于区分肿瘤起始csc和转移能力csc。总之，该研究将p38介导的foxc2磷酸化与其下游靶标zeb1，emt，干细胞性状和转移能力的调节联系起来，并且证明了p38抑制剂减弱foxc2依赖性转移的潜在效用。实施例4-材料和方法细胞培养：表达空载体(pwzl)，snail，twist，goosecoid(gsc)或活化形式的tgfβ1，v12h-ras转化的hmle(hmler)和hmler-foxc2的永生化人乳腺上皮(hmle)细胞。如前所述维持细胞(elenbaas等，2001)对于4-羟基-他莫昔芬(4-oht)处理，hmle-snail-er或hmle-twist-er细胞暴露于20nm4-oht达到指定的数量。天。如所述培养mcf7，mda-mb-231和sum159人乳腺癌细胞和4t1小鼠乳腺癌细胞。如所述(hollier等，2013)培养人非致瘤性mcf10a细胞，并用2.5ngmltgfβ处理3天以引发emt。将细胞培养24小时，然后加入20μmab203580(calbiochem，sandiego，ca，usa)。质粒，shrna和转导：已经描述了编码ha标记的p38(ha-p38)和激酶死p38(ha-p38-dn)的表达载体(kawano等，2003)。从pbabepuro-foxc2pcr扩增foxc2并亚克隆到pcdna3.1myc-his载体中。通过定点诱变产生foxc2-突变体构建体并亚克隆到逆转录病毒载体mscv-ires-gfp中。使用的引物是：foxc2(s367e)正向，5'-cgagcggccccacggagcccctgagcgctctcaacc-3'；反向，5'-ggttgagagcgctcaggggctccgtggggccgctcg-3'和foxc2(s367a)前进，5'-cgagcggccccacggcacccctgagcgctctcaacc-3'；反向，5'-ggttgagagcgctcaggggtgccgtggggccgctcg-3'。为了抑制p38和foxc2表达，使用表达shrna的慢病毒系统(openbiosystems，huntsville，al，usa)。靶向p38和foxc2的shrna序列分别是ttcacagctagattactag和cctgagcgagcagaattacta。靶向萤火虫荧光素酶(shcontrol)的shrna用作对照。如前所述进行靶细胞的慢病毒或逆转录病毒转导(stewart等，2003)。在2μg/ml嘌呤霉素中选择稳定的转导子。免疫印迹，免疫荧光和抗体：如前所述进行免疫印迹和免疫荧光(mani等，2008)。一抗如下：β-肌动蛋白(sigma，stlouis，mo，usa；a3853)，小鼠抗人foxc2(dr.naoyukimiura，hamamatsuuniversityschoolofmedicine，日本)，山羊多克隆抗foxc2(santacruz)biotechnology，dallas，tx，usa；sc-21397)，p-p38(cellsignaling，danvers，ma，usa；4511)，p38(cellsignaling；9211)，e-cadherin(bdbiosciences，sanjose，ca，usa)；61081)，纤连蛋白(bdbiosciences；610077)，波形蛋白(novusbiologicals，littleton，co，usa；nb200-623)，zeb1(novusbiologicals；nbp1-05987)和ha(covance，princeton，nj，usa；mms-101p)。共免疫沉淀：将细胞裂解物与抗体在4℃温育过夜。在4℃下加入蛋白ag-琼脂糖珠(50μl；pierce，waltham，ma，usa)12小时。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(roche，nutley，nj，usa)的冰冷放射免疫沉淀缓冲液(sigma)洗涤珠子。通过在样品缓冲液中煮沸洗脱结合的蛋白质，通过sds-page分离并通过免疫印迹分析。体外激酶测定：将谷胱甘肽-s-转移酶-(gst)-标记的foxc2截短突变体亚克隆到pgex-6p-1中并在大肠杆菌中表达。通过离心清除细胞裂解物，并将gst-foxc2融合蛋白在4℃下吸附在谷胱甘肽-琼脂糖-4b珠(sigma)上2小时。用裂解缓冲液洗涤珠子，用还原型谷胱甘肽洗脱gst-foxc2融合蛋白。将洗脱液(200ng)与100ng重组活性p38a(invitrogen，grandisland，ny，usa；pv3304)在60mmmgcl2、60μmatp，50mmtris-hcl(ph7.5)存在下孵育，12mmdtt，蛋白酶和磷酸酶抑制剂(roche)和0.7μc[γ-32p]ρτρ，在室温下30分钟。qrt-pcr：如前所述(hollier等，2013)，使用针对mrna的sybrgreen(appliedbiosystems，waltham，ma，usa)和针对微rna的taqman(appliedbiosystems)进行qrt-pcr。染色质免疫沉淀：如先前所述(hollier等，2013)进行染色质免疫沉淀。emt和干细胞特性的测定：侵袭性伪足的定量(eckert等，2011)，划痕/伤口愈合测定(sarkar等，2015)荧光激活细胞分选(facs)和球形成测定(mani等人，2008)如前所述进行。动物研究：nodscid和balbc小鼠购自jacksonlaboratory(barharbor，me，usa)。为了检查原发性肿瘤形成和自发转移，将荧光素酶标记的4t1细胞(1×104或5×104)注射到balbc小鼠的腹股沟乳腺脂肪垫中。对于实验性转移研究，通过尾静脉将0.5×106荧光素酶标记的mda-mb-231细胞注射到nodscid小鼠中。此后，每天皮下给予载体或sb203580(在100μl/-20g小鼠中0.2μmol8)。通过皮下注射d-荧光素(150mgkg；caliperlifesciences，hopkinton，ma，usa)和生物发光成像(ivis成像系统200系列；xenogencorporation，perkinelmer，waltham，ma，每周一次)评估小鼠的肿瘤生长和转移。美国)。用卡尺测量原发肿瘤大小，作为两个垂直直径(mm2)的乘积。在指定的时间点，对原发性肿瘤和肺进行手术切除，成像和处理以进行组织学检查。ctc的计数：用红色荧光蛋白(rfp)/荧光素酶标记的4t1细胞原位注射小鼠。从注射后第3周开始，通过心脏穿刺在edta包被的管中收集血液，并用氯化铵-钾裂解缓冲液(invitrogen)处理。将细胞在含有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的rpmi-1640培养基中培养。3天后计数rfp阳性集落。实施例5-p38mapk抑制剂预防bcr-abl+all中间充质干细胞介导的酪氨酸激酶抑制剂抗性临床化合物筛选鉴定了减少伊马替尼诱导的msc介导的白血病细胞保护的药剂：以前证实，伊马替尼治疗msc和白血病细胞共培养物，诱导msc中的形态学，分子和功能改变，并且在msc下面形成所有细胞簇。还显示，尽管伊马替尼抑制bcr-abl信号传导，但白血病细胞依赖于msc介导的信号传导存活，这导致白血病细胞对伊马替尼的抗性(mallampati等，2015)。在当前的研究中，筛选了146种临床化合物的文库，以鉴定能够抑制白血病细胞中伊马替尼诱导的msc介导的信号传导并破坏白血病细胞簇的试剂(图26a)。通过显微镜检查确定化合物的有效性，并通过共培养的msc和白血病细胞的生物发光成像确定化合物的毒性。基于筛选结果，将这些化合物分为四组(图26b和图26a-d)。第1组化合物(n＝8)对白血病细胞或msc没有明显的毒性，但是有效地阻碍了用伊马替尼预处理的msc形成白血病细胞簇。在伊马替尼存在下，第2组化合物(n＝5)对白血病细胞(包括成簇的白血病细胞)表现出毒性，但对msc没有毒性。第3组化合物(n＝34)对msc和白血病细胞都有毒性。第4组化合物(n＝99)显示对白血病细胞或msc没有毒性，并且不能破坏伊马替尼诱导的白血病细胞簇形成。鉴于这些结果，研究了来自第1组和第2组的化合物。第1组化合物通过破坏msc与白血病细胞之间的相互作用直接阻止伊马替尼诱导的白血病细胞簇形成，而当存在伊马替尼时，第2组化合物通过引发对聚集的白血病细胞的毒性而消除白血病细胞簇(图26c和图31a-d)。检测信号通路状态显示第1组化合物靶向p160rock和prk2(化合物y-27632)，akt(化合物deguelin)，gsk3(化合物chir99021)，chk1(化合物sb218078)和p38mapk(化合物sb202190，sb203580，pd169316，和vx-702)。第2组化合物靶向糖皮质激素受体(复方地塞米松)；parp(化合物azd2281和ag014699)；pi3kalpha(化合物pik75)；和c-kit，fgfr，pdgfr和vegfr(化合物chir258；图26d)。这些发现表明，在msc或白血病细胞中靶向抑制任何几种信号传导途径可以抵消伊马替尼诱导的脱靶存活支持。p38mapk抑制剂sb203580和地塞米松预防伊马替尼诱导的msc介导的对白血病细胞的支持：来自第1组的8种化合物中的4种是p38mapk抑制剂，并且p38mapk抑制剂sb203580有效抑制伊马替尼诱导的白血病细胞的形成。簇(图26c)。单独的sb203580不影响白血病细胞的增殖或凋亡(图27b-c)。用sb203580和伊马替尼治疗白血病细胞(不用msc培养)不会改变伊马替尼对白血病细胞的作用(图32)。然而，当在接种白血病细胞之前用伊马替尼预处理msc时，添加sb203580完全阻止了白血病细胞簇的形成(图27a和图33)。此外，在这些条件下，sb203580和伊马替尼一起减少增殖(图27b)和增加白血病细胞的凋亡(图2c7)。类似地，发现sb203580和伊马替尼的组合还阻止了来自患者的bcr-abl+all细胞中伊马替尼诱导的簇的形成(图34)。这些研究结果表明，与sb203580和伊马替尼联合治疗可以预防伊马替尼诱导的mscs与白血病细胞之间的相互作用，消除msc对白血病细胞的支持，并使白血病细胞对伊马替尼敏感。为了确定sb203580对白血病细胞的作用是否在预防伊马替尼诱导的白血病细胞簇中起作用，用sb203580预处理白血病细胞，然后将它们接种到伊马替尼预处理的msc上。sb203580预处理的白血病细胞和对照之间白血病细胞簇形成的效率没有显著差异，表明sb203580通过其对msc的作用而不是直接影响白血病细胞而阻止白血病细胞簇形成(图35)。这些发现与我们的观察结果一致，当用sb203580处理msc时，伊马替尼诱导的msc从小而细长的细胞到大的多角形细胞的形态学改变被逆转(图33)。地塞米松是用于bcr-abl+all诱导治疗的cvad或hyper-cvad方案的组成部分，并且通常与伊马替尼组合(daver等，2015)。在146种临床化合物的初步筛选中，地塞米松甚至在纳摩尔浓度下也消除了白血病细胞簇，而其他化合物在微摩尔浓度下有效。当与伊马替尼组合时，地塞米松有效靶向白血病细胞簇(图27d)。然而，与sb203580不同，地塞米松不能阻止伊马替尼诱导的白血病细胞簇的初始形成。与单独的伊马替尼或地塞米松相比，地塞米松加伊马替尼显著降低白血病细胞增殖并诱导细胞凋亡(图27e-f)。这些研究结果表明，地塞米松和伊马替尼一起有效地靶向伊马替尼诱导的白血病细胞簇，并消除伊马替尼诱导的msc介导的对白血病细胞的支持。sb203580共处理逆转了伊马替尼诱导的msc中的分子改变：以确定伊马替尼治疗是否激活msc中的p38mapk以及sb203580和伊马替尼的组合是否可以阻止p38mapk的活化，pdgfr-α/β的磷酸化，测量伊马替尼的已知靶标和p38mapk的下游效应物atf2(humphreys等人，2013)。伊马替尼处理的msc具有降低的pdgfr-α/β的磷酸化，表明伊马替尼治疗在msc中是有效的(图28a)。单独用伊马替尼处理的msc具有比对照更高的atf2磷酸化，但这在用伊马替尼和sb203580处理的msc中不明显。之前，发现伊马替尼治疗改变了与化学吸引，粘附和细胞存活相关的基因网络的表达(mallampati等，2015)。sb203580和伊马替尼共处理逆转了这种伊马替尼诱导的msc中基因表达的改变(图28b)。这些基因表达结果支持我们发现p38mapk抑制剂消除伊马替尼的脱靶效应。达沙替尼+地塞米松+sb203580预防bcr-abl+all小鼠模型中的tki抗性：为了测试sb203580在体内治疗bcr-abl+all的功效，我们用小鼠bcr-abl+all细胞移植nod-scid小鼠。然后用达沙替尼，地塞米松和sb203580的各种组合处理小鼠。使用达沙替尼代替伊马替尼，因为达沙替尼与伊马替尼具有相同的体外诱导白血病细胞簇形成的倾向，并且在体内治疗bcr-abl+all方面比伊马替尼更有效(boulos等，2011)。包括地塞米松是因为发现地塞米松诱导mscall细胞共培养的成簇白血病细胞凋亡。通过生物发光成像和通过流式细胞术定量外周血样品中的mcherry+all细胞来监测白血病进展。与载体对照相比，单独用sb203580治疗不会减缓白血病进展或延长存活期。如所预期的，用达沙替尼或达沙替尼+地塞米松治疗的小鼠具有显著慢于白血病进展和比对照小鼠更长的存活。然而，相对于所有其他治疗组，用达沙替尼+地塞米松+sb203580治疗的小鼠的治疗功效显著增强(p<0.0001)(图29a-b)。与这些生物发光和存活分析结果一致，来自用达沙替尼+地塞米松+sb203580处理的小鼠的骨髓白血病细胞显示出比用达沙替尼+地塞米松处理的小鼠更高的凋亡率(图29c)。此外，在移植后第23天和第27天用达沙替尼+地塞米松+sb203580治疗的小鼠的外周血中基本上不存在mcherry+白血病细胞，此时mcherry+白血病细胞占优势并且在用达沙替尼+地塞米松治疗的小鼠中容易检测到(图29d)。)。这些研究结果表明，将sb203580与标准治疗相结合可有效预防对tkis的耐药性，并改善bcr-abl+all患者的预后。体内发现证明，将sb203580与有效的bcr-abltki达沙替尼和地塞米松组合基本上防止了tki抗性并改善了总体结果。鉴于这些发现，提出了工作模型(图30)，其说明当bcr-abl被抑制时msc和白血病细胞之间的信号传导链以及与p38mapk抑制剂和地塞米松的组合疗法的后果。总之，这些研究结果表明，将p38mapk抑制剂与目前的诱导和/或维持治疗相结合将有助于消除伊马替尼耐药的起源，并为bcr-abl+all患者带来有希望的结果。实施例6-材料和方法病毒载体，细胞培养和临床化合物筛选：如前所述制备病毒载体和bcr-abl+小鼠all细胞(mallampati等，2015)。简而言之，为了产生bcr-abl+小鼠all细胞，用编码p190bcr-abl的病毒转导骨髓来源的祖细胞-b细胞，该病毒也共表达荧光报告基因mcherry。之后，这些转化细胞在随后的病毒转导中用荧光素酶标记。先前还描述了用于msc，白血病细胞和msc/白血病细胞的共培养的培养条件(mallampati等，2014)。临床化合物文库购自johns.dunngulfcoastconsortiumforchemicalgenomics(houston，tx)。对于临床化合物筛选实验，用伊马替尼(5μm)处理op9细胞(小鼠原代msc系；atcc，manassas，va)和来自文库的每种临床化合物(对于所有化合物，6.6μm，除地塞米松[50nm]])3天。然后，将荧光素酶标记的bcr-abl+小鼠all细胞接种到msc上。继续治疗1天，并通过相差显微镜评估样品在预处理的msc下面形成白血病细胞簇。为了确定化合物在mscs或白血病细胞中的毒性，我们通过显微镜和/或生物发光成像检查了mscall细胞共培养物。对于后筛选实验，在接种all细胞之前，用伊马替尼(5μm)和/或sb203580(20μm)或地塞米松(50nm)处理msc4天，并继续处理1天。显微术：使用axioobserver.zl显微镜，axiocammr相机和axiovision软件(zeiss，oberkochen，germany)获得共培养的msc和all细胞的相差图像。对于筛选，簇被定义为msc下超过五个白血病细胞的组。白血病细胞簇的总数是来自三个不同视野(10x物镜)的平均簇数。对于筛选后实验，簇被定义为msc下超过10个白血病细胞的组。白血病细胞簇的总数是来自10个不同视野(10x物镜)的平均簇数。mscall细胞共培养物的生物发光成像：为了测量细胞增殖，将msc和荧光素酶标记的白血病细胞的共培养物与d-荧光素(biosynth，itasca，il)混合至终浓度为0.5mg/毫升。将样品在室温下温育1分钟，并用ivislumina成像系统(perkinelmer，waltham，ma)成像。患者样本：从患有bcr-abl+all白血病(n＝3)的患者获得外周血样本，并通过使样本经受ack红细胞裂解缓冲液(lonza，basel，switzerland)来分离白血病细胞。该研究由德克萨斯大学md安德森癌症中心(德克萨斯州休斯顿)的机构审查委员会批准，并根据赫尔辛基宣言进行。所有患者均提供书面知情同意书细胞凋亡测定：在用膜联蛋白v(bdbiosciences，sanjose，ca)染色细胞后，使用bdlsrfortessa或accuric6流式细胞仪(bdbiosciences)通过流式细胞术分析白血病细胞凋亡。通过flowjo软件(ashland，or)分析数据。蛋白质印迹分析：在提取缓冲液(tris-hcl[ph7.5、50mm]；氯化钠[50mm]；二硫苏糖醇[1mm]；乙二胺四乙酸[2mm]；1％)中对msc进行裂解。np-40；0.1％脱氧胆酸钠；和0.1％十二烷基硫酸钠)，补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(roche，basel，switzerland)。通过蛋白质测定试剂(bio-radlaboratories，hercules，ca)测量裂解物中的蛋白质浓度。对于western印迹分析，裂解物(35μg)在含有5％β-巯基乙醇的十二烷基硫酸钠laemmli样品缓冲液中变性，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，印迹到聚偏二氟乙烯膜(bio-radlaboratories)上，和用含有0.2％吐温20的磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs)中的5％脱脂奶粉封闭。检测膜的磷酸化pdgfr-α/β，总pdgfr-β，磷酸化atf2，总atf2和a-微管蛋白与相应的抗体(在具有0.2％吐温20和1％脱脂奶粉的pbs中1：1000稀释；cellsignalingtechnology，danvers，ma)。然后将印迹与缀合有辣根过氧化物酶的抗兔二抗(在含有0.2％吐温20和1％脱脂奶粉的pbs中1：3000稀释；sigma-aldrich，st.louis，mo)一起孵育，并检测条带。化学发光检测系统(piercebiotechnology，rockford，il)。定量实时聚合酶链反应分析：根据制造商的说明书，用superscriptiii第一链合成系统(invitrogen，carlsbad，ca)逆转录从msc分离的总rna(100ng)。使用引物(200nm)和sybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems，fostercity，ca)在abiprism7900ht序列检测系统(thermofisherscientific，waltham，ma)上进行定量实时聚合酶链式反应(pcr)分析。)。先前详述了所用基因特异性引物的序列(mallampati等，2015)。将测量标准化为β-肌动蛋白的表达。在归一化至对照细胞中的表达水平后计算相对基因表达，其任意设定为1。动物研究：所有小鼠研究由md安德森癌症中心的机构动物护理和使用委员会审查和批准。非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷(nod-scid)小鼠在mdanderson的兽医学和外科系的高屏障条件下饲养。为了产生体内白血病模型，给6至8周龄的nod-scid小鼠静脉内注射表达荧光素酶和mcherry的bcr-abl+小鼠白血病细胞(2×106个细胞)；通过生物发光成像确认移植细胞的植入。对于生物发光成像，每只小鼠腹膜内注射d-荧光素(150mgkg)并使用ivislumina成像系统(perkinelmer)成像。移植后5天开始白血病治疗。小鼠接受口服达沙替尼(溶于柠檬酸[80mm])，剂量为每天10mgkg体重，一周5天。地塞米松以1mgkg体重/天的剂量口服施用，sb203580(溶于0.9％盐水溶液)以每天每天40mgkg体重的剂量腹膜内注射，每周5天。继续治疗直至小鼠死于疾病。在开始药物处理后4天收获来自小鼠的骨髓样品。将来自后腿的长骨之一轻轻地接地，并如前所述收集和处理骨髓样品(sun等，2013)。将外周血标本从小鼠尾尖直接收获到补充有乙二胺四乙酸(2mm)的pbs中。将红细胞进行裂解并用补充有α最低必需培养基的20％胎牛血清中和。在裂解红细胞后，通过流式细胞术分析检测外周血中的mcherry+白血病细胞。统计分析：对于组之间的统计比较，使用学生配对t检验，并且p值<0.05被认为是统计学显著的。用graphpadprism软件(graphpadsoftware，inc，lajolla，ca)进行kaplan-meier存活分析。p值通过对数秩检验确定，p<0.0001被认为是统计学显著的。根据本公开，无需过度实验即可制备和实施本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以对所述方法和步骤或所述方法的步骤顺序进行变化。这里不脱离本发明的概念，精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时可以获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神，范围和概念内。参考文献在以下参考文献中，它们提供了补充本文所述的那些的示例性程序或其他细节，通过引用具体地并入本文。aggarwalr，zhangt，smallej，armstrongaj.neuroendocrineprostatecancer:subtypes，biology，andclinicaloutcomes.journalofthenationalcomprehensivecancernetwork:jnccn2014；12:719-726.aparicioa，tzelepiv，araujojc，guocc，liangs，troncosopetal.neuroendocrineprostatecancerxenograftswithlarge-cellandsmall-cellfeaturesderivedfromasinglepatient'stumor:morphological，immunohistochemical，andgeneexpressionprofiles.prostate2011；71:846-856.aslaksoncj，millerfr.selectiveeventsinthemetastaticprocessdefinedbyanalysisofthesequentialdisseminationofsubpopulationsofamousemammarytumor.cancerresearch1992；52:1399-1405.burku，schubertj，wellneru，schmalhofero，vincane，spadernasetal.areciprocalrepressionbetweenzeb1andmembersofthemir-200familypromotesemtandinvasionincancercells.emboreports2008；9:582-589.castillov，valenzuelar，huidobroc，contrerashr，castellonea.functionalcharacteristicsofcancerstemcellsandtheirroleindrugresistanceofprostatecancer.intjoncol2014；45:985-994.chaffercl，marjanovicnd，leet，bellg，kleercg，reinhardtfetal.poisedchromatinatthezeb1promoterenablesbreastcancercellplasticityandenhancestumorigenicity.cell2013；154:61-74.cher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