京尼平治疗结直肠癌的新用途的制作方法

本发明涉及医药
技术领域：
，涉及京尼平在医药领域的新用途，具体涉及京尼平在治疗结直肠癌方面的新用途。
背景技术：
：恶性肿瘤对人类健康和生命的威胁很大，它和心血管疾病已经成为医学上的两大难关。结直肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。本病多发生在中年以上的男性，以40～70岁最为多见，男女两性发病比例约为2:1。癌瘤大多数为腺癌，少数为鳞状上皮癌及粘液癌。本病可以通过淋巴、血液循环及直接蔓延等途径,播散到其他组织和脏器。癌肿只限于肠壁者预后较好，浸润到肠外者预后较差，年轻患者、癌瘤浸润广泛、有转移者或有并发症者预后不良。对于结直肠癌，最主要的治疗方法是根治性切除，但是复发和转移常常导致手术的失败和患者的死亡。目前，结直肠癌临床上采用的综合型治疗方法包括手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、免疫治疗、中医中药治疗等。近年来天然产物因为其安全、低毒等优点，被越来越多的应用到肿瘤的治疗当中。现在已经用于结直肠癌治疗的中药有美洲大蠊、冬虫夏草、人参皂苷等。但是目前对于结直肠癌而言，仍然缺乏令人满意的治疗药物和手段。因此，本领域迫切需要开发有效抑制和治疗结直肠癌的新药物。京尼平(genipin)是一种环烯醚萜化合物，是京尼平苷的苷元。京尼平纯品为白色或淡黄色晶体，其分子式为C11H14O5，分子量为226.23，熔点为120-121℃，旋光度[α]D+135°，易溶于甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，而在水中的溶解度较小，其结构如下：京尼平及京尼平苷是栀子和杜仲的主要药效成份。杜仲是杜仲科植物的干燥树皮，是一种名贵中药材，具有滋肝补肾、强筋骨、降血压和安胎等诸多功效，临床应用已有2000年的历史；栀子属于茜草科植物，是我国盛产的一种中药材，具有利胆、保肝等功效，在我国应用于临床治疗也有1600多年的历史。目前对京尼平的提取主要以栀子为原料。现代药理研究表明，京尼平具有保肝、利胆、镇痛、降血糖、抗血栓、抗病毒、抑菌抗炎以及抗老年痴呆等作用。此外，京尼平还被广泛用作生物交联剂，它可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，如人造骨骼等。鉴于我国栀子的种植面积很大，杜仲是我国独有的名贵药材，对其药效成分的深度开发将带来可观的社会效益和经济效益。对于京尼平的抗癌作用的研究，近几年来也成为热点。现有的研究报道，京尼平对肝癌细胞、乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、血癌细胞等都有抑制作用，但关于京尼平对于结直肠癌的作用还未见报道。技术实现要素：本发明目的是提供一种可有效抑制和治疗结直肠癌的新药物。在发明的第一方面，提供了一种京尼平的用途，它被用于制备治疗结直肠癌的药物。在另一优选例中,治疗结直肠癌的药物为抑制和/或杀灭结肠癌细胞和/或直肠癌细胞的药物。在另一优选例中,结直肠癌为结肠癌和/或直肠癌。在另一优选例中,京尼平可以和药学上可接受的载体或赋形剂混合制备临床可接受的药物制剂。在另一优选例中,京尼平的含量≥150uM。在发明的第二方面，提供了一种用于治疗结直肠癌的药物组合物，它含有药学上可接受的载体和安全有效量的京尼平。在发明的第三方面，提供了一种治疗结直肠癌的方法，包括步骤：给需要治疗的对象施用安全有效量的京尼平。京尼平体外筛选实验结果表明：京尼平对人结直肠癌细胞(HT29IC50＝453.6uM；HCT-8IC50＝383uM；HCT116IC50＝377.6uM)有明显的杀伤作用，裸小鼠原位移植瘤实验也证明京尼平可以抑制移植瘤的生长，该杀伤与抑制作用与京尼平可以诱导细胞凋亡，抑制细胞增值，促进细胞活性氧的产生有关。本发明的优点在于：京尼平在治疗结直肠癌方面表现出来的抑制癌细胞作用，可作为有效成分用来制备治疗结直肠癌的药物。从天然植物中分离得到的京尼平的新用途可以取代副作用大的治疗结肠癌的药物，可以减少其他药物的副作用，为临床治疗结直肠癌的治疗提供了新途径，具有重要的医学价值和社会、经济效益。附图说明图1显示了京尼平(150uM～600uM)对于三种结直肠癌细胞(HT29、HCT-8、HCT116)的增值速度的抑制作用(24h,n＝3)。注：横坐标为京尼平浓度，纵坐标为该条件下的抑制率。与阴性对照比较，*，p<0.05图2显示了京尼平(150uM～600uM)不同作用时间(12h、24h、36h)对于HCT116细胞增值速度的抑制作用(n＝3)。注：横坐标为京尼平浓度，纵坐标为该条件下的抑制率。与阴性对照相比，*，p<0.05图3显示了京尼平(200uM、300uM)对于HCT116细胞凋亡的促进作用。注：横坐标为京尼平浓度，纵坐标为各组凋亡细胞占总细胞的比例。与阴性对照相比，*，p<0.05，**，p<0.01图4显示了京尼平(200uM、300uM)对于HCT116细胞周期的阻滞作用。注：图像的比例为处于各个周期的细胞占总细胞的比例。与阴性对照相比，*，p<0.05，**，p<0.01图5显示了京尼平(200uM、400uM、600uM)对于HCT116细胞活性氧产生的促进作用。注：横坐标为京尼平浓度，纵坐标为给药组活性氧产生量与阴性对照组活性氧产生量的比值。与阴性对照相比，*，p<0.05，**，p<0.01图6显示了京尼平对HCT116细胞裸小鼠直肠原位移植瘤生长的抑制作用。注：横坐标为京尼平的用量，纵坐标为各组小鼠肿瘤的质量。与阴性对照相比，*，p<0.05，**，p<0.01图7显示了京尼平对HCT116细胞裸小鼠结肠原位移植瘤生长的抑制作用。注：横坐标为京尼平的用量，纵坐标为各组小鼠肿瘤的质量。与阴性对照相比，*，p<0.05，**，p<0.01具体实施方式下面结合实施例来更加详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。下列实施例中未标明的实验条件，通常按照常规条件，或者按照制造厂家建议的条件。实验材料：京尼平(98％)：西安开来生物工程有限公司HT29、HCT-8、HCT116:美国模式培养物集存库(ATCC)CCK-8：日本同仁化工AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒：索莱宝细胞周期PI染色试剂盒：凯基生物活性氧检测试剂盒：索莱宝裸小鼠(BALB/cnu/nu):重庆医科大学实验动物中心实施例1：京尼平对三种结直肠癌细胞增值的抑制作用实验方法：分别取对数生长期HT29、HCT-8、HCT116细胞，以7000/孔种于96孔板上，分别加入150uM～600uM的京尼平，设0.1％的DMSO组为对照组培养24小时，结束前加入10ulCCK-8，两小时后MicroplateReader450nm波长测OD值，根据下面的式子计算抑制率，并计算IC50。注：阴性OD均值＝阴性对照组OD值-空白对照组OD均值；受试药OD均值＝各受试药组OD均值-药物颜色对照组OD均值。实验结果：HT29在150uM、300uM、450uM、600uM京尼平的24小时作用下IR分别为95.91％、76.25％、47.09％、34.86％。HCT-8在150uM、300uM、450uM、600uM京尼平的24小时作用下IR分别为88.81％、67.5％、40.23％、21.37％。HCT116在150uM、300uM、450uM、600uM京尼平的24小时作用下IR分别为79.89％、60.02％、44.98％、30.13％。IC50见下表：表1：京尼平抑制三种结直肠癌细胞增值的IC50结果分析：京尼平对于三种结直肠癌细胞增值都具有明显的抑制作用，并且呈现剂量依赖性，京尼平浓度越大，抑制效果越好。京尼平对于结直肠癌细胞具有普遍的抑制效果。实施例2：不同作用时间下京尼平对HCT116细胞增值的抑制作用实验方法：分别取对数生长期HCT116细胞，以7000/孔种于96孔板上，分别加入150uM～600uM的京尼平，设0.1％的DMSO组为对照组培养12、24、36小时，结束前加入10ulCCK-8，两小时后MicroplateReader450nm波长测OD值，计算IR和IC50。实验结果：HCT116在150uM、300uM、450uM、600uM京尼平的12小时作用下IR分别为92.76％、66.24％、56.68％、34.81％。HCT116在150uM、300uM、450uM、600uM京尼平的24小时作用下IR分别为79.89％、60.02％、44.98％、30.13％。HCT116在150uM、300uM、450uM、600uM京尼平在36小时作用下IR分别为56.16％、26.77％、17.06％、8.55％。IC50见下表：表2：不同作用时间下京尼平抑制HCT116细胞增值的IC50时间(h)IC50(uM)12463.424377.636168.4结果分析：京尼平对于HCT116细胞增值的抑制效果呈现时间和剂量依赖性，剂量越大，作用时间越长，抑制效果越明显。实施例3：京尼平促进HCT116细胞凋亡实验方法：分别取对数生长期HCT116细胞，以50万/孔种于六孔板上，200uM、300uM京尼平处理24h，不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，收集于离心管中，按照试剂盒说明书，加入ANNEXINv和PI染料避光染细胞30分钟，流式细胞仪检测。实验结果：表3：京尼平对HCT116细胞凋亡的影响注：n＝3,*，p<0.05,**，p<0.01结果分析：京尼平可以诱导结直肠癌细胞HCT116的凋亡，从而杀灭结直肠癌细胞，抑制肿瘤的进一步发展。实施例4：京尼平诱导HCT116细胞G0/G1期停滞实验方法：分别取对数生长期HCT116细胞，以50万/孔种于六孔板上，200uM、300uM京尼平处理24h，胰蛋白酶消化细胞，收集于离心管中，按照试剂盒说明书，加入RNaseA去除RNA，再加入PI染料避光染细胞30分钟，流式细胞仪检测。实验结果：表4：京尼平对HCT116细胞周期的影响注：n＝3,*，p<0.05,**，p<0.01结果分析：京尼平可以使HCT116细胞周期分布发生明显变化，G0/G1期细胞相对增加，S期细胞相对减少，说明京尼平能将HCT116细胞阻滞在G0/G1期，减少DNA的合成，抑制细胞增殖，从而达到抗肿瘤的效果。实施例5：京尼平促进HCT116细胞活性氧的产生实验方法：分别取对数生长期HCT116细胞，以50万/孔种于六孔板上，200uM、400uM、600uM京尼平处理12h，胰蛋白酶消化细胞，收集于离心管中，按照试剂盒说明书，加入DCFH-DA染料避光染细胞30分钟，流式细胞仪检测。实验结果：表5：京尼平对HCT116细胞活性氧产生的影响注：n＝3,*，p<0.05,**，p<0.01结果分析：活性氧的产生是导致细胞的死亡的重要原因之一，京尼平通过促进HCT16细胞活性氧产生，从而促进细胞死亡，达到抗肿瘤的效果。实施例6：京尼平抑制裸小鼠直肠原位移植瘤的生长实验方法：1.直肠粘膜下瘤细胞接种：裸鼠称重后，经腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，固定小鼠呈仰卧位，手术野皮肤消毒处理。左手提起裸鼠尾巴并用手手指抵住骶尾部固定肛门直肠，右手持无齿手术眼科镊子，尖端垫上棉花，顺着肛门深入直肠腔内约0.3cm，向外轻柔旋转，将直肠粘膜外翻显露于扩张的肛门口外。距肛缘1cm-2cm处，肛门直肠交界处上方直肠粘膜下，以1ml注射器缓慢注射入0.1mlHCT116细胞悬液(含有细胞2×106个)。注射后观察1min，用棉签轻轻按摩肛门，使得外翻的直肠粘膜回纳。2.给药：小鼠于肿瘤细胞接种后第8天开始给药，每天一次，腹腔注射共14次，末次给药后次日处死小鼠，取出瘤块称重。3.观察指标与有效判断标准：肿瘤重量测定及抑瘤率(％)的计算，末次给药后次日称量体重，处死动物，全部解剖剥离瘤块，称量瘤重(g),并照相。按下式计算肿瘤重量抑瘤率(inhibitionrate,IR):IR＝(C-T)/C×100％(T为给药组平均瘤重，C为阴性对照组平均瘤重)。有效判断：抑瘤率<40％为无效，抑瘤率≥40％并经过统计学处理p<0.05为有效。实验结果：表6:京尼平对HCT116裸小鼠直肠原位移植瘤生长的影响注：n＝5,*，p<0.05,**，p<0.01结果分析：京尼平低、中、高各剂量均可抑制小鼠直肠原位移植癌生长，差别有极显著性(p<0.01)，且对肿瘤生长的抑制作用呈剂量依赖性。京尼平抑制直肠原位癌生长40mg/kg有效，80mg/kg效果更佳。实施例7：京尼平抑制裸小鼠结肠原位移植瘤的生长1.结肠浆膜下瘤细胞接种：裸鼠麻醉消毒处理后，眼科剪在腹部正中剪开1cm切口进入腹腔。用套上聚氨酯塑胶管的眼科镊，轻轻将结肠拉出体外，以无菌注射器在结肠壁浆膜下缓慢注射0.1mlHCT116细胞悬液(含有细胞2×106个)，可见结肠浆膜肿胀，拔出针尖，用棉球于近注射部位轻轻压迫，用75％酒精棉球擦拭肠壁针孔，杀灭肠壁上的肿瘤细胞，以防止腹腔种植，可吸收线全层缝合腹壁。2.给药：小鼠于肿瘤细胞接种后第8天开始给药，每天一次，腹腔注射共14次，末次给药后次日处死小鼠，取出瘤块称重。3.观察指标与有效判断标准：肿瘤重量测定及抑瘤率(％)的计算，末次给药后次日称量体重，处死动物，全部解剖剥离瘤块，称量瘤重(g),并照相。按下式计算肿瘤重量抑瘤率(inhibitionrate,IR):IR＝(C-T)/C×100％(T为给药组平均瘤重，C为阴性对照组平均瘤重)。有效判断：抑瘤率<40％为无效，抑瘤率≥40％并经过统计学处理p<0.05为有效。实验结果：表7:京尼平对HCT116裸小鼠结肠原位移植瘤生长的影响注：n＝5,*，p<0.05,**，p<0.01结果分析：京尼平低、中、高各剂量均可抑制小鼠结肠原位移植癌生长，差别有极显著性(p<0.01),且对肿瘤生长的抑制作用呈剂量依赖性。京尼平抑制结肠原位癌生长40mg/kg有效，80mg/kg效果更佳。当前第1页1 2 3