含有竹花青素的保健品以及竹花青素的提取和测定方法与流程

本发明属于食品或保健药品领域，特别涉及一种含有竹花青素的保健品，其在制备抗氧化剂中的药物中的应用，在制备保健食品中的应用，并涉及一种竹花青素的提取和测定方法，

背景技术：
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虾青素(Astaxanthin)(3，3’-二羟基4，4’-二酮基β-胡萝卜素)是一种具有超强抗氧化活性的次生类胡萝卜素，是自然界中最强的抗氧化剂，其抗氧化活性是维生素E的500倍，也远高于其他常用的抗氧化剂。虾青素又称“虾黄素”，是一种从从河蟹虾外壳、牡蛎、鲑鱼及藻类、真菌中发现的一种特殊的红色类胡萝卜素，具有保护血管和眼睛，抗辐射、抗衰老、预防老年痴呆和癌症等功效，在药品、食品、化妆品、水产饲料添加剂等领域具有广泛的应用价值。天然虾青素常为某些海洋微生物和少量酵母菌作为次生代谢产物在体内合成，但由于提取技术难度高及受藻种或菌种自身问题等限制，普遍存在虾青素产量低、成本高等缺点，使天然虾青素产量有限。国内外学者对虾青素已进行了许多研究，主要集中在其功能及应用前景(曹秀明等，2011；Goswami G等，2010)、生物积累(耿予欢等，2009；李晓梦等，2006)和提取工艺(黄贤刚等，2009；刘宏超等，2011)等方面。目前，国际上已具备的虾青素生产工艺主要有化学合成和生物技术提取，化学合成的虾青素在结构、功能、应用和安全性等方面较天然虾青素均逊色不少，因此进行大规模生产一般倾向于天然虾青素的提取(肖素荣等，2011)。雨生红球藻培养法，法夫酵母发酵法，虾壳浸提法都具备实现天然虾青素产业化的潜力，但由于技术难度高及受藻种或菌种自身问题等限制，普遍存在虾青素产量低、成本高等缺点(阎毅等，2011)，使天然虾青素产量有限，价格高，其保健品的价格更是堪比黄金，大部分人难以承受。相比较而言，竹子是理想的虾青素加工厂，作为经济植物可实现规模化生产，且耕作简单、成本低，因而含虾青素的竹子是理想的虾青素加工厂。现有技术中未见有从含有竹花青素的保健品以及竹子中提取高含量的虾青素的提取工艺和测定方法的报道。

技术实现要素：

本发明旨在解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种含有竹花青素的保健品，在制备抗氧化剂中的药物中的应用，在制备保健食品中的应用，并涉及一种竹花青素的提取和测定方法，

为了实现本发明的上述目的，本发明采取了以下技术方案：

含有竹花青素的保健品，其以竹花青素提取物为有效成分，配以常规药品或食品辅剂。

根据所述的含有竹花青素的保健品，其中所述的竹叶为红秆香竹、七彩红竹、紫竹的干燥竹叶，竹花青素由下述方法提取而得：：取竹叶，选取1％HCL水溶液为提取溶剂，液料比20‐30:1，温度25℃，超声振荡提取法提取1-4次，30-40min，过滤。

根据所述的含有竹花青素的保健品，其由下述重量份的竹花青素提取物干粉15份，糊精10份，适量50％乙醇所组成，并由下述方法所制备：将上述组分按照常规制备颗粒剂的工艺制备：先对原辅料进行检验称重、制软材、制粒、干燥、整粒、成品分装、灭菌，颗粒剂规格：20g/袋。

本发明还提供了一种竹花青素的提取和测定方法，取竹叶，选取1％HCL水溶液为提取溶剂，液料比20‐30:1，温度25℃，超声振荡提取法提取1-4次，30-40min，过滤得竹花青素提取物，滤液浓缩并定容，测定色价和总花青素的含量。

如所述的一种竹花青素的提取和测定方法，进一步使用冷冻冻干机对所述竹花青素料进行冷冻干燥，冻干设置为：预冻至‐25℃以下，抽真空，开加热，当真空达0.03MPa时，设定为0℃，12小时后可渐进的调到30℃；所述的虾青素含量测定采用：将冷冻干燥好的样品粉碎、装袋、密封，进行虾青素含量测定，测定采用高效液相色谱法分离，其液相条件：色谱柱为WatersSpherisorb OSD2，5μm,4.6,250mm，液相型号为Waters Milford,MA,USA，进样量为20μl；流动相A相为乙腈/甲醇/Tris‐HCL，pH 8.0，体积比为84:2:14，B相为甲醇/乙酸乙酯，体积比为68:32；以1.2mL/min的流速线性梯度洗脱色素，从100％A相到100％的B相，每个梯度用时15分钟，随后用B相洗脱10分钟，通过比对各颜色组分和标准品的光谱吸收和相对保留时间来鉴定各组分，通过将峰面积的积分值与标准品对比将其转化为浓度值从而对各组分进行定量，标准品购买自sigma公司和Wako公司。

本发明同时提供所述的竹花青素在制备抗氧化剂中的药物中的应用。

本发明还提供了所述的竹花青素在制备抗氧化剂中的食品中的应用，按竹花青素提取物干粉:糊精按重量份15份:10份，适量50％乙醇,称重、制软材、制粒、干燥、整粒、成品分装、灭菌制成规格20g/袋的颗粒剂，将颗粒剂每日午时、睡前、佐餐或佐面包时服用，0.5-2袋/日，连续服用1个月或长期服用。

本发明此外还提供了含竹花青素的软胶囊，取竹花青素粉，逐渐加入少许水中，搅拌溶解均匀，再倒入上述核桃油中，搅拌，加入1﹪吐温-80混匀；过胶体磨混匀，过40目筛，灌胶软胶囊，干燥3天，灭菌，包装。

以及，含竹花青素的保健食品，在竹花青素基础上添加多种维生素、微量元素、不同中药的提取物，并配以不同辅料，制成易于携带和服用的不同固体或液体剂型。

还及，含竹花青素的保健食品，竹花青素提取物以1-9∶1的比例添加到固体果酱、液体牛奶、蜂蜜食品中。

本发明的产品特点确定竹花青素的提取工艺，从而全面保留了竹花青素中营养精华，并根据竹花青素功效和应用人群特点，采取了科学工艺将其制成携带方便、易于长期服用、口感宜人的产品形式。经科学分析和人体试食，本产品具有明显的抗氧化功能，同时能保护肝脏、抗电脑辐射和抗衰老(清除自由基)等作用，使得古代关于竹花青素神奇疗效的传说在现实中找到了验证，因此本产品具有广阔的市场前景。

附图说明：

图1七彩虹竹样品，1号为荭草苷，2号为牡荆苷，3号为异牡荆苷，4号为木犀草素；

图2混合标准品色谱图，1号为荭草苷，2号为牡荆苷，3号为异牡荆苷，4号为木犀草素；

图3 1号标准曲线；

图4 2号标准曲线；

图5 3号标准曲线；

图6 4号标准曲线；

图7竹子材料样本；

图8竹子材料样本的荧光组织化学影像。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

竹花青素的提取：分别取红秆香竹Chimonocalamus pallens cv.rutilans cv.nov.七彩红竹Indosasa amara f.striata f.nov.紫竹Phyllostachys nigra(Lodd.ex Lindl.)Munro(有色竹种)的竹秆和竹叶10kg，选取1％HCL水溶液为提取溶剂，液料比20‐30:1，温度25℃，超声振荡提取法提取1-4次，30-40min，过滤,分别得竹花青素680g、700g、980g。

实施例2：

竹花青素干粉960g，糊精640g，适量50％乙醇。将上述原辅料按照常规制备颗粒剂的工艺制备，即先对原辅料进行检验称重—制软材—制粒—干燥—整粒—成品分装—灭菌。颗粒剂规格：20g/袋。

实施例3：

竹花青素以1-9∶1的比例添加到果酱、牛奶、蜂蜜等固体和液体食品中去，可以增加食品中的竹叶清香味，同时也能发挥其保健功能。

实施例4：

取实施例1所得竹花青素4.2公斤，加入5％蜂蜡(210克)，加热溶解，置冷；另取469克竹花青素干粉，研细，逐渐加入150毫升水中，搅拌并混匀，再倒入大豆油中，搅拌，加入1％吐温-80(50克)，混匀。将上述配好的药液过胶体磨(混匀)，过40目筛，最后灌装软胶囊(规格：内容物0.5－1克)，干燥3天，灭菌，包装即得。

实施例5：

含有的竹花青素乳酸菌饮料配方(W％)：

按常规制作食品的方法制得本发明的上述饮料,具有竹叶清香。

实施例6：

以实施例2制备的颗粒剂每日可午时、睡前、佐餐或佐面包等服用，0.5-2袋/日，连续服用1个月或长期服用。

人群试食用结果：

为验证本产品功效，竹花青素保健品在40-80岁人群中进行了少量试食实验。花青素为众人皆知的具有多种营养价值的药食兼用品，但过去的花青素产品因提取方式、制剂形式和包装量等缺乏科学性和实用性，从而导致其功效难以得到全面和真正发挥。本发明的产品特点确定竹花青素的提取工艺，从而全面保留了竹花青素中营养精华，并根据竹花青素功效和应用人群特点，采取了科学工艺将其制成携带方便、易于长期服用、口感宜人的产品形式。经科学分析和人体试食，本产品具有明显的抗氧化功能，同时能保护肝脏、抗电脑辐射和抗衰老(清除自由基)等作用，使得古代关于竹花青素神奇疗效的传说在现实中找到了验证，因此本产品具有广阔的市场前景。

下面用本发明的试验例来进一步说明本发明方法步骤最优化的过程，证明本发明所存在的优益性、科学性和先进性。

试验例1：

取红秆香竹Chimonocalamus pallens cv.rutilans cv.nov.七彩红竹Indosasa amara f.striata f.nov.紫竹Phyllostachys nigra(Lodd.ex Lindl.)Munro(有色竹种)的竹秆和竹叶。

分别称取上述各种竹的竹叶1.0000±0.0005g，选取水、1％HCL水溶液、1％HCL‐乙醇溶液、1％HCL‐甲醇溶液为提取溶剂，液料比20‐30:1，温度25℃，超声振荡提取法提取1-4次，30-40min，过滤得竹花青素，滤液浓缩并定容到10mL容量瓶中，从中吸取1mL，定容到100mL容量瓶中，测定色价和总花青素的含量。

冻干：使用冷冻冻干机对上述已脱水处理的竹花青素进行冷冻干燥，冻干设置为：预冻至‐25℃以下，抽真空，开加热(当真空达0.03MPa时，设定为0℃，12小时后可渐进的调到30℃)；

虾青素含量测定：将冷冻干燥好的样品粉碎、装袋、密封，进行虾青素含量测定，测定采用高效液相色谱法分离，其液相条件：色谱柱为WatersSpherisorb OSD2(5μm,4.6,250mm)，液相型号为Waters(Milford,MA,USA)，进样量为20μl；流动相A相为乙腈/甲醇/Tris‐HCL(pH 8.0)，体积比为84:2:14，B相为甲醇/乙酸乙酯，体积比为68:32；以1.2mL/min的流速线性梯度洗脱色素，从100％A相到100％的B相，每个梯度用时15分钟，随后用B相洗脱10分钟，通过比对各颜色组分和标准品的光谱吸收和相对保留时间来鉴定各组分，通过将峰面积的积分值与标准品对比将其转化为浓度值从而对各组分进行定量，标准品购买自sigma公司和Wako公司。

竹花青素的代谢过程及含量测定：

本发明在对云南几种有色竹种的研究中首次发现这些竹种的竹秆和叶片的颜色呈现出红色到紫色的变化，根据化学显色剂法判断，该物质为花青素。同一株竹子在相同生长时期的竹秆、枝条、叶片中颜色深浅不一(图7)，采用组织化学定位的方法，利用显色剂和共聚焦显微影像记录后分析，在不同的生长发育时期，花青素等类黄酮物质所在部位也有很大差异(图8)。

通过对云南野生竹种的研究发现，红秆香竹Chimonocalamus pallens cv.rutilans cv.nov.七彩红竹Indosasa amara f.striata f.nov.紫竹Phyllostachys nigra(Lodd.ex Lindl.)Munro都是有色竹种，竹秆和竹叶在一定生长时期花青素含量很高，因此，本发明选用这其中具有代表性的紫竹为研究对象，首先对竹花青素提取和基本理化性质进行研究；通过对竹类植物中花青素稳定剂的提取分离，结构鉴定，含量检测，建立高稳定的竹花青素提取工艺路线，为开发高端竹花青素功能食品和保健品做好准备。由于花青素的高活性，极易失活，市场上还没有花青素纯品，所以提取高稳定性的花青素对花色素类色素开发具有重要的意义。

竹花青素的提取：

仪器和材料

赛特路斯万分之一电子天平BS210S型；数显恒温水浴锅HH–2型(国华电器有限公司)；721型分光光度计(四川分析仪器厂)

试剂：

甲醇(分析纯，重庆化学试剂总厂)；亚硝酸钠(化学纯，北京化工厂)；硝酸铝(分析纯，天津市化学试剂三厂)；氢氧化钠(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)无水乙醇、甲醇、纯净水、浓盐酸、氯化钾、柠檬酸、磷酸二氢钠,醋酸钠、醋酸、均为分析纯。

材料：

取竹叶，清除其中的杂质，进行粉碎、筛分。粉碎：每次取一定量的竹叶，粉碎一次，3s/次。

实验方法：

紫竹花色素提取的单因素实验：

根据报道，影响花色素含量较大的因素有提取方法、溶剂、提取时间、液料比、和提取次数五种，探索提取方法及上述五种因素对黄酮类化合物含量的影响。

溶剂考察试验：

分别称取1.0000±0.0005g竹叶，选取水、1％HCL水溶液、1％HCL‐乙醇溶液、1％HCL‐甲醇溶液为提取溶剂，液料比20:1，温度25℃，超声振荡提取法提取1次，30min，过滤，滤液浓缩并定容到10mL容量瓶中，从中吸取1mL，定容到100mL容量瓶中，测定色价和总花青素的含量。

提取方法的考察：

分别称取1.0000±0.0005g竹叶，首先以1％HCL甲醇溶液为提取溶剂，超声提取1次，30min,液料比为20：1，分别采用超声、回流、冷浸、索氏提取等方法进行实验，每种方法平行做3次。其中回流提取是在80℃恒温下。

提取时间考察：

分别称取1.0000±0.0005g竹叶，以液料比20：1，分别加入1％HCL甲醇溶液，超声法分别提取10min、20min、30min、40min提取一次，过滤，滤液浓缩，用甲醇定容于10ml的容量瓶，待测。

浸提次数考察：

分别称取1.0000±0.0005g竹叶，以液料比20：1，加入1％HCL甲溶液，超声10min，分别提取1、2、3、4次，过滤，滤液浓缩，用甲醇定容于10ml的容量瓶，待测。

液料比考察：

称取1.0000±0.0005g竹叶粉，分别以液料比10：1、20：1、25：1、30：1加入1％HCL乙醇溶液，超声提取1次，提取30min，过滤，滤液浓缩，用乙醇定容于10ml的容量瓶，待测。

正交实验：

通过单因素试验，以其结果为基础，选择液料比、提取时间和提取次数为考察因素，选用L₉(3⁴)进行正交试验，得最佳工艺。各考察因素及其水平见表1。正交试验设计见表1，根据表2中的各条件提取，取待测液1ml，测定其吸光度A值，分别计算其花青素的含量。

表1正交试验因素及其水平

表2正交试验设计表

验证实验：

根据正交试验设计结果和方差分析结果，优选出最佳提取工艺路线，并在此条件下重复三次，进行方法学验证。花青素的含量测定方法采用色价法。总花色素(total anthocyanins,ACY)的测定：利用花色素及黄酮的结构特性,当pH为1.0时,510nm处二者均有最大吸收峰；而当pH为4.5时，花色素转变为无色查尔酮形式，在510nm处无吸收，用示差法计算溶液中总花色素含量。

用移液管吸取2mL样品液,分别用pH1.0[0.2mol/LKCl：0.2mol/LHC1＝25：67,V/V]和pH4.5[0.2mol/LNaAc·3H2O∶0.2mol/LHAc＝1∶1,V/V]的缓冲液稀释至20mL,混匀,以2mL溶剂加18mL相应缓冲液作空白,分别在5l0nm和700nm处测定吸光值。总花色素的含量(以矢车菊色素‐3‐葡萄糖苷计)按下式计算：

其中:C‐样品浓度,mg/mL；V‐提取液的总体积,mL；m‐取样量,g；

结果与分析：

单因素实验结果：

表3溶剂考察结果

由表3可以看出，1％HCl-甲醇提取液色价和总花色素含量最高,1％HCl-乙醇次之,以水为溶剂的提取液色价和总花色素含量最低,而1％HCl-水提取效率比水高,且呈极显著差异,主要是因为H+对细胞膜的渗透作用以及对花色素类物质的保护作用。1％HCl甲醇和1％HCl乙醇作为溶剂,其提取效果间差异不显著,但都极显著好于水提,此结果与文献报道一致。

表4提取方法考察结果

不同提取方法比较结果可知，超声法和回流法提取的花色素的色价较高，但回流法经过加热会导致花色素转化，冷浸法提取效率低，耗费时间长，索氏提取法对设备要求较高，提取量较小，不适用于工业生产，综合比较的结果，选择超声提取法为竹花色素的提取方法。

表5提取时间考察结果

随着提取时间的加长，提取液的色价和总花色素的含量都有所增加，但30min后，随着时间的增长花色素总含量没有明显的改变，因此选择30-40min为提取时间。

表6提取次数考察结果

提取次数增加可增加花色素的溶出率，但超过3次后，花色素的含量没有明显变化，考虑到成本和效率，选择提取3-5次。

表7液料比考察结果

由表7可见,料液比越高，提取液色价和总花色素含量越高；但当料液比超过25:1后,提取液色价和总花色素含量虽然有所增大,但同20:1料液比没有显著差异,实际生产中可选用20-30:1料液比。

竹花青素的含量测定：

七彩虹竹秆在不同生长发育时期中黄酮类化合物的含量测定：

色谱条件：在200～900nm波长范围内选择不同波长进行分析测试，发现在280nm处最高，因此选择280nm为最佳检测波长。流动相用乙腈∶水，待测物的分离效果最好。柱温对样品测定有很大影响，温度低时，出峰时间长，而且峰严重拖尾；温度太高，则出峰太快，待测峰有部分重叠，实验发现，恒定柱温为35℃，待测峰的重现性和保留时间都比较理想。对照品、样品色谱图(见图1和图2)。结果表明，在现行色谱条件下4个标准品与其他组分得到了很好的分离，4个指标成分色谱峰理论塔板数均不小于2000，各指标成分的色谱峰与其他峰分离度均大于1.5。

线性关系考察：

分别精密吸取“2.3.3.3”项下制备的对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分别置100mL量瓶中，加甲醇定容,摇匀，配制成系列浓度的对照品溶液。按上述色谱条件测定峰面积，以色谱峰面积Y为纵坐标，样品浓度X(mg·mL^‐1)为横坐标，绘制标准曲线(如下表5，6，7，8；图3，4，5，6)。

经线性回归，得标准品1号、2号、3号、4号回归方程为：

对照品1号荭草苷；2号牡荆苷；3号异牡荆苷；4号木犀草素在0.01～0.05mg·mL‐1范围内线性关系良好。

精密度试验

吸取“2.3.3.3”项下制备的对照品储备液，重复进样5次，结果黄酮标准品峰面积的RSD(Relative Standard Deviation)分别为3.0％，0.8％，2.5％，2.8％。

重复性试验：

取同一批七彩虹竹样品溶液5份，分别按样品含量测定方法操作，测定峰面积，计算得混合标准品含量的RSD分别为1.5％，1.7％，2.5％，2.3％，1.9％。

稳定性试验：

取七彩虹竹供试品溶液，分别在0，4，8，12，16h，进样测定峰面积，结果混合标准品含量RSD分别为0.9％，1.2.％，2.2％，1.0％，2.5％，表明供试品溶液在16h内基本稳定。

回收率试验：

精密称取已知含量的七彩虹竹样品9份，每份约1.5g，分别加入对照品溶液，按供试品溶液制备方法操作，并按上述色谱条件测定峰面积，计算5种成分的回收率，测定结果，平均加样回收率均在95％‐105％置性区间，符合要求。

七彩虹竹秆在不同生长发育时期中黄酮类化合物的含量测定：

取不同生长发育时期的七彩虹竹样本，制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液，每次进样10μL，按照色谱条件测定峰面积，以外标法计算含量。

表5 1号标准品峰面积与浓度关系表

表6 2号标准品峰面积与浓度关系表

表7 3号标准品峰面积与浓度关系表

表8 4号标准品峰面积与浓度关系表