乙酰半胱氨酸在制备预防、治疗术后认知功能障碍和血脑屏障受损所介导脑病药物中的应用的制作方法

本发明属于制药领域，涉及乙酰半胱胺酸在治疗术后认知功能障碍药物领域的新用途，具体涉及在治疗麻醉和手术打击后记忆功能、新物体探索欲望下降方面中的用途。

背景技术：

术后认知功能障碍(POCD，Postoperative Cognitive Dysfunction)被认为是由麻醉、手术等多种因素共同作用所致的中枢神经功能减退。

术后认知功能障碍(POCD)是中枢神经系统(CNS，Central Nervous System)在退变的基础上由麻醉和手术创伤诱发的中枢神经功能减退，目前的实验研究主要侧重于中枢神经炎症激活后对中枢神经的最终影响，关注的是手术创伤引起POCD的下游终末表现，但是手术创伤通过什么上游环节最终激活中枢神经炎症反应并不明确。CNS内本身缺乏抗原递呈细胞，血脑屏障(BBB，blood-brainbarrier)的存在又维持CNS内环境相对稳定，所以CNS被认为是免疫特赦器官(Immune privilege)，正常情况下无法直接感知并激活炎症反应。手术创伤促发外周炎症反应，只有破坏了CNS的内稳态机制才能进一步激活中枢神经系统的炎症级联反应，最终导致POCD。血脑屏障不仅是维持CNS内稳态的重要结构，也是沟通外周和中枢的调控界面，是导致POCD上游(手术创伤引起外周炎症反应)、下游(中枢神经炎症反应激活)相互沟通作用的中心环节。

近年来，随着麻醉学科以及外科医疗技术的快速发展，高龄患者接受麻醉和手术治疗的安全性大大提高，但是老年患者术后认知功能障碍的发生率却日益增加，这一认知功能损伤短则存在数天或数月，长则持续数年甚至终身，严重影响病人术后的生存质量、职业功能以及社会功能。不仅给患者本人带来极大的精神痛苦以及身体上的折磨，同时也给其家人带来巨大的经济上的压力。在临床治疗方面，目前尚无值得推荐的简单而有效的治疗方法，一般采用注意营养、液体、电解质平衡和加强心理支持。此外，神经保护也认为是POCD的治疗方法之一，但是这些措施在临床治疗中却收效甚微。因此深入探索术后认知功能障碍的发生机制，尤其是尽快寻找有效的干预措施是当今医学界广泛关注的焦点和研究热点。

近年来人们认识到脑保护的目标应从单一的神经保护转变为对神经血管单元的多种成分的保护，提出了神经血管单元(NVΜ，neurovascular unit)的概念。它的结构基础是神经元、血脑屏障(包括内皮细胞、内皮细胞之间的紧密连接、基底膜、星形胶质细胞的足突和周细胞)、小胶质细胞以及维持脑组织完整性的细胞外基质。其中血脑屏障是神经血管单元的核心组成部分，对维持脑内环境恒定、保障中枢神经系统的正常活动具有重要意义。

近期研究发现，脑微血管内皮功能障碍与术后认知功能障碍的发生密切相关。手术创伤可诱发外周炎症因子高表达，导致全身炎症反应，进而破坏BBB的完整性。而脑内的微血管内皮细胞可能是全身性炎症反应作用于BBB的靶点。研究发现，包括TNF-α在内的炎性因子能够损伤内皮细胞的功能并且穿透血脑屏障，TNF-α可引起血脑屏障的破坏以及脑内纤维蛋白原的沉积、脑内小胶质细胞活化，最终导致海马等脑区的功能紊乱；另一方面，近期实验还发现，七氟醚可加重手术诱导大鼠海马部位的BBB通透性增加，而反映内皮紧密连接的闭合蛋白occludin以及紧密连接蛋白claudin-5的含量也显著下降，老年大鼠发生认知功能的损伤。由此可见，BBB的完整性与POCD密切相关。有趣的是，术后认知功能障碍还在老年人群中呈高发状态，这和老龄患者BBB内皮细胞屏障应激能力、清除能力下调也密切相关。因此，血管内皮损伤导致血脑屏障功能破坏可能是是导致术后认知功能障碍的核心因素。

最近的研究发现，基质金属蛋白酶9(MMP-9，Matrix Metalloproteinase-9)可能在在破坏血脑屏障中起到尤为重要的作用，参与多种疾病的病理进程。MMP-9隶属于基质金属蛋白酶(MMPs)家族，是一种蛋白水解酶，它由单核巨噬细胞、中性粒细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等多种细胞分泌，可降解细胞外很多种基质成分。此外，MMP-9又不仅仅被动地作为炎性反应的下游产物而出现，它还对许多促炎因子发挥正反馈作用，是炎性反应持续的重要“增效剂”。MMP-9的生成增加不仅可导致血脑屏障结构的破坏，还促进炎症反应的生成。基质金属蛋白酶介导多个病理过程中的血脑屏障破坏。缺血性卒中的再灌注阶段，其作用于血脑屏障内皮细胞之间的紧密连接和基底膜而导致血脑屏障受损，导致通透性增加和脑水肿形成，而利用MMP抑制剂可以减少紧密连接蛋白的降解减轻BBB功能紊乱，减轻脑水肿的发生发展。有趣的是，来自于临床的研究发现，在术后24h之内发生术后认知功能障碍的患者外周血中MMP-9水平显著升高，这一结果提示，MMP-9可能在在POCD的发生和发展中起到重要作用。

其次，发明人还采用伊文氏蓝的检测方法探索了外周应用MMP-9抑制剂对于血脑屏障的保护性作用；结果发现，与单纯手术创伤组相比较，手术前静脉注射MMP-9抑制剂，可以显著减少小鼠的血脑屏障的渗漏现象。这说明，MMP-9对于围术期血脑屏障的损伤具有很好的保护性作用。但是由于MMP-9抑制剂作为试验用试剂，应用于临床还十分遥远，因此亟待寻找一种特别的“老药”造福现有患者。

但是，由于MMP-9抑制剂作为试验用试剂，应用于临床还十分遥远，因此，利用相同作用机理，应用于由血脑屏障所参与介导的诸如术后认知障碍等疾病的药物亟待研发。

技术实现要素：

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有制备治疗由手术麻醉诱导的认知功能损伤的药物的技术空白，提出了本发明。

因此，本发明其中的一个目的是解决现有技术中的不足，提供乙酰半胱氨酸在制备治疗由手术麻醉诱导的认知功能损伤的药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：乙酰半胱氨酸在制备治疗由手术麻醉诱导的认知功能损伤的药物中的应用。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述乙酰半胱氨酸，其为以乙酰半胱氨酸为活性成分，添加辅料或辅助性成分制备为制剂。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述乙酰半胱氨酸，其为将乙酰半胱氨酸与其他药物制成复方制剂。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述制剂，其为注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述复方制剂，其为注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

本发明的另一个目的是解决现有技术中的不足，提供一种乙酰半胱氨酸在制备治疗由血脑屏障受损所介导的脑病药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：乙酰半胱氨酸在制备治疗由血脑屏障受损所介导的脑病药物中的应用。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述乙酰半胱氨酸，其为以乙酰半胱氨酸为活性成分，添加辅料或辅助性成分制备为制剂。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述乙酰半胱氨酸，其为将乙酰半胱氨酸与其他药物制成复方制剂。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述制剂，其为注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述复方制剂，其为注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次公开了乙酰半胱氨酸作为一种来源丰富，具有良好安全性的药物成分，可以用于预防和治疗术后认知功能障碍和保护血脑屏障。

(2)本发明所采用的乙酰半胱氨酸，其已在临床中用于治疗肾病特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病等等，在预防和治疗术后认知功能障碍和保护血脑屏障的效果，同采用仍作为试验试用剂的MMP抑制剂效果相当。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为麻醉手术创伤诱导的血浆MMP-9及MMP-2变化的时程曲线的示意图，表明麻醉和手术创伤可诱导外周血MMP-9，而不是MMP2快速和强烈的高表达。

图2为静脉注射MMP-9抑制剂对手术麻醉创伤所导致的小鼠恐惧记忆及新物体识别能力影响的示意图，表明术前静脉注射MMP-9抑制剂可以显著缓解由手术麻醉创伤所导致的小鼠恐惧记忆能力的下降，以及新物体识别能力的下降。

图3为静脉注射MMP-9抑制剂对手术麻醉创伤所导致的小鼠血脑屏障通透性以及海马IL-1β水平影响的示意图，表明手术前静脉注射MMP-9抑制剂，可以显著减少小鼠的血脑屏障的渗漏现象；显著减少由手术导致的海马炎症因子IL-1β水平的升高。

图4为术前应用乙酰半胱胺酸可以剂量依赖的缓解由手术创伤所致的恐惧记忆损伤和新物体识别能力下降的示意图，表明术前应用乙酰半胱胺酸可以缓解由手术麻醉创伤所导致的小鼠恐惧记忆能力的下降，以及新物体识别能力的下降。

图5为术前应用乙酰半胱胺酸可剂量依赖的抑制由手术创伤诱导的小鼠血浆MMP-9高表达示意图，表明术前应用乙酰半胱胺酸可以显著缓解由麻醉手术创伤诱导的MMP-9水平的升高。

图6为乙酰半胱胺酸还可以保护由手术创伤所致的血脑屏障损伤，还可以剂量依赖的抑制海马炎症因子IL-1β水平升高的示意图，表明与单纯手术创伤组相比较，手术前应用乙酰半胱胺酸，可以剂量依赖的抑制缓解小鼠的血脑屏障的渗漏现象；显著减少由手术导致的海马炎症因子IL-1β水平的升高。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

术后认知功能障碍的发生可延长患者的住院时间，增加并发症的发生，增加患者的病死率。研究发现，由外周炎症反应以及巨噬细胞等免疫细胞介导的血脑屏障功能障碍，进而导致的海马炎症浸润是促进认知功能损伤的重要因素。但是，介导这一过程的关键性分子仍不清楚。因此，本实施例主要公开术后认知功能障碍的最新的研究结果，同时也公开了乙酰半胱胺酸对于术后认知功能障碍的疗效和治疗机制，专业领域技术人员可以在其他的阿片类药物中重现类似的研究结果。

实施例1：

有理由推测，MMP-9或者MMP-2可能是介导PCOD过程中内皮细胞损伤，进而导致POCD的发病的重要因素。针对这一推测，在前期针对MMP-9以及MMP-2在POCD发病过程中的重要作用加以详细论证。试验结果发现，手术和麻醉创伤可以引发外周血MMP-9，而不是MMP-2在POCD的发病过程中快速强烈的升高(图1)；并且导致脑内微血管内皮细胞功能的失调。而提前给予小鼠静脉注射MMP-9抑制剂可以显著缓解由手术麻醉创伤所导致的恐惧记忆能力的下降，以及新物体识别能力的下降(图1)。这说明，麻醉和手术所诱导的MMP-9水平的上调对于认知功能的损伤起到重要作用。

具体试验内容如下。

a)试验动物：

健康雄性C57BL/6J,12-14 3-3.5月龄小鼠，清洁级。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。

b)手术及麻醉方法：2.1％异氟烷，氧浓度0.3吸入全麻。在无菌条件下，给予左后腿胫骨平台开放髓内针固定术。手术全程无菌条件下进行，所有的器械设备高压灭菌。手术区域刮毛并用碘酒消毒。在小鼠的左后腿胫骨平台中央插入0.38mm的髓内针后切开皮肤，然后切开骨膜，再行骨切开术(截骨术)。结束后用8/0的手术缝线缝合皮肤，等待小鼠自然苏醒。在手术过程中，周围环境温度在36-37度之间。手术后所有小鼠腹腔注射生理盐水2ml。

小鼠随机分为七组：分别为空白对照组，麻醉+手术后0.5h组，麻醉+手术后1h组，麻醉+手术后2h组，麻醉+手术后6h组，麻醉+手术后12h组，麻醉+手术后24h组。第一组为空白对照组，不做任何处理；第2～7组小鼠分别于手术后第0.5h，1h，2h，6h，12h，24h于深度异氟烷麻醉下心脏穿刺取血，取血后30min内高速离心机12000rpm离心25min后取上清(血浆)。

c)基质金属蛋白酶检测方法

明胶酶谱法是检测明胶酶活性的经典方法。工作原理：含有明胶酶的样品在电泳过程中，SDS先与之结合(可逆性结合)，破坏其氢键、疏水键而使明胶酶不能发挥其分解明胶的作用；当将胶置在有二价金属离子存在的缓冲系统(Trition)中洗脱后，由于SDS被Trition结合而去除，从而使明胶酶恢复了活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的底物明胶。最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9的活性成正比。

d)试验结果描述

如图1所示：与对照组比较，小鼠经麻醉手术创伤后第1，2，6，12h血浆MMP-9水平显著升高，而MMP-2在术后各时间点无显著变化。以上结果表明：麻醉和手术创伤可诱导外周血MMP-9，而不是MMP2快速和强烈的高表达。

实施例2：

N-乙酰半胱氨酸是一类粘液溶解剂，还可以作为对乙酰氨基酚的解毒剂，临床上也用于治疗肾病特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病等等。尤其重要的是，乙酰半胱氨酸有极佳的安全历史，其丰富的半胱氨酸残基对于干预基质金属蛋白酶活化过程中“半胱氨酸开关”具有极大地潜力。

基质金属蛋白酶含有一个独特的结构即“半胱氨酸开关”，半胱氨酸开关包含2个关键部分；一个是在肽领域的半胱氨酸残基，另外是在催化结构域的锌结合位点。当半胱氨酸残基被S-亚硝基化、氧化、烷基化修饰时，和锌结合位点的半胱氨酸残基将发生解离，导致基质金属蛋白酶被激活。因此，半胱氨酸残基的修饰对于MMP-9/2活化至关重要。

实验结果表明，术前静脉注射MMP-9抑制剂可以显著缓解由手术麻醉创伤所导致的小鼠恐惧记忆能力的下降，以及新物体识别能力的下降。

具体试验内容如下。

a)试验动物：健康雄性C57BL/6J,12-14 3-3.5月龄小鼠，清洁级。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。

b)药品与试剂

二甲基亚砜(DMSO，dimethyl sulfoxide)，(sigma公司)，MMP-9抑制剂(5μg/μl，100μl，Millipore公司)，配制方法：取50μlDMSO加入100μlMMP9抑制剂使其充分溶解，后用生理盐水稀释MMP9抑制剂浓度至1％，DMSO浓度为3％。

c)手术及麻醉方法：2.1％异氟烷，氧浓度0.3吸入全麻。4h后在无菌条件下，给予左后腿胫骨平台开放髓内针固定术。手术全程无菌条件下进行，所有的器械设备高压灭菌。手术区域刮毛并用碘酒消毒。在小鼠的左后腿胫骨平台中央插入0.38mm的髓内针后切开皮肤，然后切开骨膜，再行骨切开术(截骨术)。结束后用8/0的手术缝线缝合皮肤，等待小鼠自然苏醒。在手术过程中，周围环境温度在36-37度之间。在切皮之前皮下注射镇痛药布诺啡(0.1mg/kg)。手术后所有小鼠腹腔注射生理盐水2ml。

动物分组及给药方式：小鼠分为5组分别为空白对照组(Con)、手术+DMSO组、手术+MMP-9抑制剂组、MMP-9抑制剂单给药组。

空白组：不做任何处理；手术+DMSO组：在手术开始前10min小鼠尾静脉注射3％的DMSO，给药后进行条件性恐惧记忆训练，训练后半小时内行异氟烷麻醉+胫骨平台骨折固定术；手术+MMP-9抑制剂组：在手术开始前尾静脉注射MMP-9抑制剂20μg(200μl)，给药后进行条件性恐惧记忆训练、MMP-9抑制剂单给药组：在开始行为学测定前尾静脉注射MMP9抑制剂20μg(200μl)。

d)小鼠恐惧记忆测定：在一个自动化系统中，进行背景依赖的条件恐惧性恐惧记忆(Med Associates，Inc，St.Albans，VT)，单独暴露于背景(3分钟)，后跟一个30秒的声音(10千赫；75分贝)和足部电击(2s；0.7mA横流)。72小时后在180s内每隔10s记录背景依赖的静止状态，观察者不知道实验条件，结果以不动时间占总观察时间的百分比表示，在进行麻醉和手术前30min进行训练，手术后第3天进行测试。

e)小鼠新物体识别测定：手术后第7天进行。在一个直径30cm，高度40cm的圆柱形避光装置中进行，适应期时将小鼠依次放入没有任何物体的实验装置中，使其自由探索以便适应进行实验的环境。间隔1h后进行熟悉期训练，熟悉期时在实验装置底板的相对位置放入两个完全相同的物体(A1和A2)，将小鼠以背对两个物体的方式放入实验装置中，一定时间后将动物取出放回动物饲养笼中。间隔1h后，进行测试期实验。测试期和熟悉期过程类似，只是将两个完全相同的物体中的一个换成另一个不同物体，相对于熟悉期的两个物体测试期时的物体分别被称为熟悉物体(A3)和新奇物体(B)。实验动物对新奇物体的偏爱可以用“辨别指数”这一指标进行量化，“辨别指数”一般用D2(d2)表示，是由测试期实验时动物对新奇物体的探索时间和对熟悉物体的探索次数计算得到的，具体的计算公式是:D2＝(N-F)/(N+F)，“N”表示测试期时动物对新奇物体的探索次数，“F”表示测试期时动物对熟悉物体的探索次数，“辨别指数”考虑到了动物之间不同的探索活动水平。

f)试验结果描述：结果发现，与空白对照组相比较，术前静脉注射MMP-9抑制剂可以显著缓解由手术麻醉创伤所导致的小鼠恐惧记忆能力的下降(图2)，以及新物体识别能力的下降而单给抑制剂组和单给DMSO组与手术组相比较差异无显著性(图2)。

因此，术前静脉注射MMP-9抑制剂可以显著缓解由手术麻醉创伤所导致的小鼠恐惧记忆能力的下降，以及新物体识别能力的下降。

实施例3：

对动物进行静脉注射MMP-9抑制剂对手术麻醉创伤所导致的小鼠血脑屏障通透性以及海马IL-1β水平的影响的测定实验，实验结果表明，与单纯手术创伤组相比较，手术前静脉注射MMP-9抑制剂，可以显著减少手术诱导的小鼠的血脑屏障的渗漏现象以及海马IL-1β水平的升高。

具体试验内容如下。

a)试验动物：

健康雄性C57BL/6J,12-14 3-3.5月龄小鼠，清洁级。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。

b)药品与试剂

DMSO，公司，配制方法；MMP-9抑制剂，公司，配制方法。DMSO，(sigma公司)，MMP-9抑制剂(5μg/μl，100μl)，Millipore公司，配制方法：取50μlDMSO加入100μlMMP9抑制剂使其充分溶解，后用生理盐水稀释MMP9抑制剂浓度至1％，DMSO浓度为3％。伊文氏蓝：

c)手术及麻醉方法：2.1％异氟烷，氧浓度0.3吸入全麻。4h后在无菌条件下，给予左后腿胫骨平台开放髓内针固定术。手术全程无菌条件下进行，所有的器械设备高压灭菌。手术区域刮毛并用碘酒消毒。在小鼠的左后腿胫骨平台中央插入0.38mm的髓内针后切开皮肤，然后切开骨膜，再行骨切开术(截骨术)。结束后用8/0的手术缝线缝合皮肤，等待小鼠自然苏醒。在手术过程中，周围环境温度在36-37度之间。在切皮之前皮下注射镇痛药布诺啡(0.1mg/kg)。手术后所有小鼠腹腔注射生理盐水2ml。

动物分组及给药方式：小鼠分为5组分别为空白对照组(Con)、手术+DMSO组、手术+MMP-9抑制剂组、MMP-9抑制剂单给药组。空白组：不做任何处理；手术+DMSO组：在手术开始前10min小鼠尾静脉注射3％的DMSO，给药后行异氟烷麻醉+胫骨平台骨折固定术；手术+MMP-9抑制剂组：在手术开始前尾静脉注射MMP-9抑制剂20μg(200μl)，给药后行异氟烷麻醉+胫骨平台骨折固定术、MMP-9抑制剂单给药组：尾静脉注射MMP9抑制剂20μg(200μl)。

d)伊文氏蓝法测定血脑屏障通透性

e)蛋白电泳方法

组织蛋白免疫印迹：取海马称重后，按照1:20(质量:体积)比例加入裂解液，冰上超声处理10s后，沸水浴中5min变性，15,000转离心15min，吸取上清，20μl/管分装，-70℃保存。取10μl样品/泳道上样于10％SDS-PAGE进行凝胶电泳，4℃110V电转90min。5％BSA-TBS封闭1小时后，加入IL-1β抗体(1:1,000，R&D公司)、β-actin抗体(1：2000，santa)4℃过夜。TBST漂洗10min×3次后，加入HRP标记二抗羊抗兔-HRP二抗(1:1000，R&D)室温孵育3小时后加入ECL(Pierce)发光底物显色。用分子显影仪(Gel DocTM XR,170-8170)联合Quantity One-4.6.5(Bio-Rad Laboratories)软件分析数据。用目的蛋白灰度值与胞浆蛋白内参GAPDH灰度值之比进行半定量分析。

f)试验结果描述：

结果发现，与单纯手术创伤组相比较，手术前静脉注射MMP-9抑制剂，可以显著减少小鼠的血脑屏障的渗漏现象(图3A)；显著减少由手术导致的海马炎症因子IL-1β水平的升高(图3B)。

实施例4：

对动物进行应用乙酰半胱胺酸对由手术麻醉创伤所导致的小鼠恐惧记忆能力和新物体识别能力的影响的测定试验，试验结果表明，术前应用乙酰半胱胺酸可以剂量依赖的缓解由手术创伤所致的恐惧记忆损伤和新物体识别能力的下降(图4)。

a)试验动物：

健康雄性C57BL/6J,12-14 3-3.5月龄小鼠，清洁级。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。

b)药品与试剂

乙酰半胱胺酸(sigma公司)生理盐水溶解。

c)手术及麻醉方法：2.1％异氟烷，氧浓度0.3吸入全麻。4h后在无菌条件下，给予左后腿胫骨平台开放髓内针固定术。手术全程无菌条件下进行，所有的器械设备高压灭菌。手术区域刮毛并用碘酒消毒。在小鼠的左后腿胫骨平台中央插入0.38mm的髓内针后切开皮肤，然后切开骨膜，再行骨切开术(截骨术)。结束后用8/0的手术缝线缝合皮肤，等待小鼠自然苏醒。在手术过程中，周围环境温度在36-37度之间。在切皮之前皮下注射镇痛药布诺啡(0.1mg/kg)。手术后所有小鼠腹腔注射生理盐水2ml。

小鼠随机分为六组：分别为口服生理盐水组，口服生理盐水+手术组，NAC100mg/kg+手术组，NAC200mg/kg+手术组，NAC400mg/kg+手术组，口服NAC400mg/kg组。第一组为对照组，连续口服生理盐水3天后取材；第2～6组小鼠分别灌胃给予100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg，每日3次，共给予3天的乙酰半胱胺酸。之后行异氟烷麻醉+胫骨平台骨折固定术，各组小鼠分别于手术后6h取材。

d)小鼠恐惧记忆测定：在一个自动化系统中，进行背景依赖的条件恐惧性恐惧记忆(Med Associates，Inc，St.Albans，VT)，单独暴露于背景(3分钟)，后跟一个30秒的声音(10千赫；75分贝)和足部电击(2s；0.7mA横流)。72小时后在180s内每隔10s记录背景依赖的静止状态，观察者不知道实验条件，结果以不动时间占总观察时间的百分比表示，在进行麻醉和手术前30min进行训练，手术后第3天进行测试。

e)小鼠新物体识别测定：手术后第7天进行。在一个直径30cm，高度40cm的圆柱形避光装置中进行，适应期时将小鼠依次放入没有任何物体的实验装置中，使其自由探索以便适应进行实验的环境。间隔1h后进行熟悉期训练，熟悉期时在实验装置底板的相对位置放入两个完全相同的物体(A1和A2)，将小鼠以背对两个物体的方式放入实验装置中，一定时间后将动物取出放回动物饲养笼中。间隔1h后，进行测试期实验。测试期和熟悉期过程类似，只是将两个完全相同的物体中的一个换成另一个不同物体，相对于熟悉期的两个物体测试期时的物体分别被称为熟悉物体(A3)和新奇物体(B)。实验动物对新奇物体的偏爱可以用“辨别指数”这一指标进行量化，“辨别指数”一般用D2(d2)表示，是由测试期实验时动物对新奇物体的探索时间和对熟悉物体的探索次数计算得到的，具体的计算公式是:D2＝(N-F)/(N+F)，“N”表示测试期时动物对新奇物体的探索次数，“F”表示测试期时动物对熟悉物体的探索次数，“辨别指数”考虑到了动物之间不同的探索活动水平。

f)试验结果描述：结果发现，与空白对照组相比较，术前口服乙酰半胱胺酸可以剂量依赖的缓解由手术麻醉创伤所导致的小鼠恐惧记忆能力的下降(图4A)，以及新物体识别能力的下降(图4B)而单给乙酰半胱胺酸组与空白对照组相比则无显著改变。

因此，术前应用乙酰半胱胺酸可以缓解由手术麻醉创伤所导致的小鼠恐惧记忆能力的下降，以及新物体识别能力的下降。

实施例5：

对动物进行应用乙酰半胱胺酸以剂量依赖对手术创伤所致的MMP-9水平的影响的测定试验，试验结果表明，术前应用乙酰半胱胺酸可以剂量依赖的缓解由手术创伤所致的MMP-9水平的升高(图5)。

具体试验内容如下。

a)试验动物：

健康雄性C57BL/6J,12-14 3-3.5月龄小鼠，清洁级。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。

b)药品与试剂

乙酰半胱胺酸(sigma公司)生理盐水溶解。

c)手术及麻醉方法：2.1％异氟烷，氧浓度0.3吸入全麻。4h后在无菌条件下，给予左后腿胫骨平台开放髓内针固定术。手术全程无菌条件下进行，所有的器械设备高压灭菌。手术区域刮毛并用碘酒消毒。在小鼠的左后腿胫骨平台中央插入0.38mm的髓内针后切开皮肤，然后切开骨膜，再行骨切开术(截骨术)。结束后用8/0的手术缝线缝合皮肤，等待小鼠自然苏醒。在手术过程中，周围环境温度在36-37度之间。在切皮之前皮下注射镇痛药布诺啡(0.1mg/kg)。手术后所有小鼠腹腔注射生理盐水2ml。

小鼠随机分为六组：分别为口服生理盐水组，口服生理盐水+手术组，NAC100mg/kg+手术组，NAC200mg/kg+手术组，NAC400mg/kg+手术组，口服NAC400mg/kg组。第一组为对照组，连续口服生理盐水3天后取材；第2～6组小鼠分别灌胃给予100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg，每日3次，共给予3天的乙酰半胱胺酸。之后行异氟烷麻醉+胫骨平台骨折固定术，各组小鼠分别于手术后6h取材。

d)基质金属蛋白酶检测方法

明胶酶谱法是检测明胶酶活性的经典方法。工作原理：含有明胶酶的样品在电泳过程中，SDS先与之结合(可逆性结合)，破坏其氢键、疏水键而使明胶酶不能发挥其分解明胶的作用；当将胶置在有二价金属离子存在的缓冲系统(Trition)中洗脱后，由于SDS被Trition结合而去除，从而使明胶酶恢复了活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的底物明胶。最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9的活性成正比。

e)试验结果描述

如图5所示：与对照组比较，乙酰半胱胺酸可以剂量依赖的缓解手术创伤诱导的血浆MMP-9水平显著升高，尤其是400mg/kg组。以上结果表明：术前应用乙酰半胱胺酸可以显著缓解由麻醉手术创伤诱导的MMP-9水平的升高。

实施例6：

对动物进行应用乙酰半胱胺酸对手术创伤所致的血脑屏障损伤的保护，以及以剂量依赖对抑制海马炎症因子IL-1β水平的影响测定试验，试验结果表明，乙酰半胱胺酸还可以保护由手术创伤所致的血脑屏障损伤，还可以剂量依赖的抑制海马炎症因子IL-1β水平的升高(图6A，B)。

a)试验动物：

健康雄性C57BL/6J,12-14 3-3.5月龄小鼠，清洁级。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。

b)药品与试剂

乙酰半胱胺酸(sigma公司)。IL-1β抗体，购自R&D公司，β-actin抗体购自santa公司，HRP标记二抗羊抗兔-HRP二抗R&D公司，ECL发光液，Pierce公司伊文氏蓝：

c)手术及麻醉方法：2.1％异氟烷，氧浓度0.3吸入全麻。4h后在无菌条件下，给予左后腿胫骨平台开放髓内针固定术。手术全程无菌条件下进行，所有的器械设备高压灭菌。手术区域刮毛并用碘酒消毒。在小鼠的左后腿胫骨平台中央插入0.38mm的髓内针后切开皮肤，然后切开骨膜，再行骨切开术(截骨术)。结束后用8/0的手术缝线缝合皮肤，等待小鼠自然苏醒。在手术过程中，周围环境温度在36-37度之间。在切皮之前皮下注射镇痛药布诺啡(0.1mg/kg)。手术后所有小鼠腹腔注射生理盐水2ml。

小鼠随机分为六组：分别为口服生理盐水组，口服生理盐水+手术组，NAC100mg/kg+手术组，NAC200mg/kg+手术组，NAC400mg/kg+手术组，口服NAC400mg/kg组。第一组为对照组，连续口服生理盐水3天后取材；第2～6组小鼠分别灌胃给予100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg，每日3次，共给予3天的乙酰半胱胺酸。之后行异氟烷麻醉+胫骨平台骨折固定术，各组小鼠分别于手术后6h取材。

d)伊文氏蓝法测定血脑屏障通透性

e)蛋白电泳方法

组织蛋白免疫印迹：取海马称重后，按照1:20(质量:体积)比例加入裂解液，冰上超声处理10s后，沸水浴中5min变性，15,000转离心15min，吸取上清，20μl/管分装，-70℃保存。取10μl样品/泳道上样于10％SDS-PAGE进行凝胶电泳，4℃110V电转90min。5％BSA-TBS封闭1小时后，加入IL-1β抗体(1:1,000，R&D公司)、β-actin抗体(1：2000，santa)4℃过夜。TBST漂洗10min×3次后，加入HRP标记二抗羊抗兔-HRP二抗(1:1000，R&D)室温孵育3小时后加入ECL(Pierce)发光底物显色。用分子显影仪(Gel DocTM XR,170-8170)联合Quantity One-4.6.5(Bio-Rad Laboratories)软件分析数据。用目的蛋白灰度值与胞浆蛋白内参GAPDH灰度值之比进行半定量分析。

f)试验结果描述：

结果发现，与单纯手术创伤组相比较，手术前应用乙酰半胱胺酸，可以剂量依赖的抑制缓解小鼠的血脑屏障的渗漏现象(图6A)；显著减少由手术导致的海马炎症因子IL-1β水平的升高(图6B)。基质金属蛋白酶含有一个独特的结构即“半胱氨酸开关”，半胱氨酸开关包含2个关键部分；一个是在肽领域的半胱氨酸残基，另外是在催化结构域的锌结合位点。当半胱氨酸残基被S-亚硝基化、氧化、烷基化修饰时，和锌结合位点的半胱氨酸残基将发生解离，导致基质金属蛋白酶被激活。因此，半胱氨酸残基的修饰对于MMP-9/2活化至关重要。

N-乙酰半胱氨酸是一类粘液溶解剂，还可以作为对乙酰氨基酚的解毒剂，临床上也用于治疗肾病特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病等等。因此，尤其重要的是，乙酰半胱氨酸有极佳的安全历史。

另外，N-乙酰半胱氨酸具有丰富的半胱氨酸残基，这对于干预基质金属蛋白酶活化过程中“半胱氨酸开关”是极为关键的。发明人经研究发现，NAC可以阻断基质金属蛋白酶的重要底物IL-1的成熟，并显著抑制神经病理性痛过程中蛋白激酶C,NMDAR1,以及MAPK的活化，此外，NAC还可显著抑制神经病理性痛模型中小胶质细胞的活化。这些结果表明乙酰半胱胺酸可通过特异性的抑制基质金属蛋白酶的激活从而治疗其他疾病的潜力。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。