miR-150抑制剂在制备结直肠癌耐药逆转剂上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，涉及一种耐药逆转剂，更具体地说，涉及一种逆转结直肠癌治疗耐药性的耐药逆转剂。发明提供了miR-150抑制剂在制备结直肠癌耐药逆转剂上的应用，尤其是miR-150抑制剂在制备HCT-116系和/或HT-29系结直肠癌细胞耐药逆转剂上的应用。
【专利说明】m i R-1 5 O抑制剂在制备结直肠癌耐药逆转剂上的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种耐药逆转剂，更具体地说，涉及一种逆转结直肠癌治疗耐药性的耐药逆转剂。
【背景技术】
[0002]结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是世界第三常见的恶性肿瘤。在我国，随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯的改变以及人口老龄化，结直肠癌发病率快速增长。现有的结直肠癌治疗方案除了手术治疗，还需要化放疗作为辅助的治疗手段。但是由于肿瘤对药物的耐药性的存在，严重影响结直肠癌治疗的效果。
[0003]MicroRNA是一类长约18~25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，参与和调控几乎所有细胞生物学过程，包括时序发育，细胞凋亡，脂肪代谢，神经元发育，细胞分化，细胞增殖等在内的多种生理过程。它通过与靶基因的非编码区域结合抑制靶基因的表达。据预测，人类基因组中可能存在多达三分之一的蛋白编码基因受microRNA的调控。在人类多数的肿瘤细胞中都发现microRNA的异常表达，而且在不同的癌症发生过程中几乎都伴随着microRNA的表达改变。50%以上的人类microRNA基因位于肿瘤相关基因区域，如脆性位点，杂合子丢失区、扩增区或是通常的断裂区。microRNA基因高频地出现在这些与肿瘤密切相关的易变基因组中，提示着它跟肿瘤发生与发展密切相关。在结直肠癌中，microRNA的异常表达与肿瘤的发生和发展显著相关，同时某些特定的microRNA作为调节化疗敏感性的重要生物分子，参与了结直肠癌化疗耐受。最新研究表明microRNA-150 (miR-150)在众多的肿瘤中的异常表达并在一系列生化过程中扮演的重角色。研究者通过生物信息学方法发现上千个潜在靶基因，并通过进一步的实验证实c-Myb、MUC4、ZEBl、AKT2、DKCl、EGR2、P2X7和p53是miR-150的直接靶基因。通过分析它们的调控通路以及在细胞的作用，我们推测它们其中某些靶基因与化疗`药物的耐药性密切相关。如P53蛋白在p53诱导凋亡途径及抑制细胞的增殖中起关键性作用。EGR2在PTEN生长抑制通路中作为肿瘤抑制因子，它通过调控Fas ligand在T细胞的表达水平从而诱导细胞凋亡。另外EGR2在肿瘤细胞的活性也能够影响依赖P53蛋白诱导凋亡通路的活性。P2X7在caspase-9线粒体诱导凋亡途径中作用肿瘤抑制因子参与其中。致癌基因c-myb在细胞中被证实能够增强细胞的增殖及抑制细胞的凋亡。
[0004]目前，miR-150在结直肠癌的研究仍然较为欠缺。发明人前期的研究发现miR-150在结直肠癌临床病人组织的异常表达与肿瘤耐药密切相关。然而，由于癌症的发病机制复杂，不同癌症亚型的增值和凋亡机制及其调控通路也各异，因此，尽管miR-150的异常表达已被知晓与众多肿瘤调控通路相关，但是，由于不同肿瘤甚至相同肿瘤不同亚型的凋亡途径的复杂性，如果将miR-150作为多种不同亚型的癌症患者调控通路的通用指标，其特异性和准确率均较低，因此，目前对于miR-150在癌症的耐药检测以及耐药逆转方面的应用仍非常有限。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种准确率高的针对特定类型结直肠癌患者耐药性的检测试剂。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种有效逆转结直肠癌耐药性的逆转剂。
[0007]本发明的进一步目的在于提供一种针对特定类型结直肠癌耐药性的逆转剂。
[0008]发明通过以下技术方案实现上述目的:
[0009]首先，在结直肠癌患者耐药性的检测试剂方面，本发明所提供的是一种针对HCT-116和/或HT-29系结肠癌的耐药性检测试剂——miR-150检测试剂。
[0010]优选地，本发明提供了一种准确率、灵敏度远远高于现有技术的针对HT-29型结肠癌的耐药性检测试剂-miR-150检测试剂。
[0011]尽管此前的研究表明，miR-150在结直肠癌患者中耐药患者病人的表达水平高于敏感患者。然而，该结果并没有针对不同类型的癌症患者作出区分。本发明人将不同类型的癌症细胞进行区分之后，发现在有些类型(例如SW620)中，耐药细胞miR-150表达水平对比非耐药细胞，并没有非常显著的提高。而在HCT-116和HT-29中，尤其是在HT-29中，耐药细胞miR-150表达水平对比非耐药细胞显示出非常显著的提高。
[0012]因此，将miR-150检测试剂作为HCT-116和/或HT-29系结肠癌的耐药性检测试剂，尤其是作为HT-29型结肠癌的耐药性检测试剂，准确率和灵敏度将大大提高。
[0013]除此，发明提供了一种有效逆转结直肠癌耐药性的逆转剂——miR-150抑制剂。所述的结直肠癌为高表达miR-150的结直肠癌。
[0014]优选地，发明提供了 miR`-150抑制剂在制备HCT-116系和/或HT-29系结直肠癌细胞耐药逆转剂上的应用。尤为优选地，是HT-29系结直肠癌细胞。
[0015]发明人根据前期的研究结果推测miR-150可能通过负调控c-myb、EGR2、P2X7及p53的表达,从而影响化疗药物耐药性的产生与发展。
[0016]进一步地，发明人发现，在使用细胞周期药物进行化疗时，miR-150在HCT-116和/或HT-29细胞中起到抗凋亡作用。其可能的机理是由于miR-150负调控癌基因c-myb，抑制细胞增殖，而缓慢的细胞增长速度可以让更少的细胞进入药物起作用的DNA复制期，增加了对药物的耐药性，从而逃过了化疗。结直肠癌细胞系HCT-116及HT-29过表达miR-150能够抑制细胞的增殖，导致细胞耐药性的增加使细胞对药物的敏感性降低。当存在miR-150抑制剂的情况下，可以消除miR-150的抗凋亡作用，这对耐药患者的治疗来说是尤为重要的。
[0017]所述的miR-150抑制剂可以是常见的任一抑制剂，例如，能够与miR-150与其靶之间的结合发生相互作用的序列；包含有能够与miR-150结合的核苷酸序列；包含与成熟miR-150的序列的至少6个核苷酸基本上互补的核苷酸序列；包含与miR-150的种子序列基本上互补的核苷酸序列；包含能够在生理条件下与成熟miR-150结合的核苷酸序列；能够降低成熟miR-150在细胞内水平的值机等等。
[0018]优选地，所述的耐药是由所述药干扰P53依赖诱导凋亡途径所引起。优选地，所述的药指5-氟尿嘧啶(5-FU)类药物。
[0019]5-氟尿嘧啶作为结直肠癌患者主要化疗用药已经沿用了将近半个世纪，其主要的毒性作用可以从以下这两方面进行解释:[0020](I) 5-FU在体内能活化生成5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸后，与胸甘酸合成酶结合，抑制此酶的活性，使脱氧胸甘酶缺乏，DNA复制障碍。(2) 5-FU也可代谢为5-氟尿嘧啶核苷，作为伪代谢物形式掺入到RNA中，影响RNA功能和蛋白质合成。但是由于肿瘤对药物耐受性的存在，化疗耐药已经成为有效治疗结直肠癌病人的主要障碍。
[0021]发明人发现，在结直肠癌耐药细胞中，miR-150的存在使得5_FU的使用并不能提高细胞的凋亡率。并且，5-FU的使用还会明显提升miR-150的表达水平，提升的程度与5-FU的浓度相关，这进一步恶化了癌症细胞的耐药性。尤其是在HCT-116及HT-29细胞中，这种恶化程度更为突出。因此，在采用5-FU类药物进行化疗时，miR-150抑制剂的存在尤其重要，其将能抑制miR-150的过表达，破坏miR-150的抗凋亡作用，对逆转耐药患者的耐药性起到尤为重要的作用。
[0022]与现有技术相比，本发明的针对特定类型的结直肠癌患者耐药性的检测试剂，将对该特定类型的耐药诊断具有此前无法比拟的准确率和灵敏度。从而为后续的治疗方案的合理决策提供了坚实的基础。
[0023]本发明所针对的特定类型的结直肠癌耐药性的逆转剂，将能更有针对性地有效逆转患者的耐药性，尤其是在5-FU化疗中，该逆转剂从根本上遏制了 5-FU类药物所引起的细胞的耐药机制，逆转了细胞的耐药性。在HCT-116及HT-29中，采用miR-150抑制剂作为耐5-FU逆转剂的有效率分别达到了 30.8%和37.7%。【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1显示了 miR-150作为耐药指标在不同结直肠癌细胞中的表达差异，以及miR-150对HCT-116和HT-29细胞耐药性的影响；
[0025]其中，(a)miR-150 在 Caco-2，HCT-116, HT-29 和 SW620 细胞中的表达水平(*p<0.05); (b)转染了 RNA模拟物miR-150的HCT-116和HT-29细胞的miR-150的表达水平；(c，d)在一系列 5-FU 浓度下(O μ M，2 μ M，4 μ M，6 μ M，8 μ M，10 μ M，12 μ M)过表达 miR-150的HCT-116和SW620降低5-FU诱导的细胞毒性作用。
[0026]图2为miR-150过表达对HCT-116和HT-29细胞增殖和凋亡的影响；
[0027](a，b)过表达miR-150抑制HCT-116和HT-29细胞的增殖；(c)过表达miR-150能够在HCT-116和HT-29细胞中逆转5-FU诱导的凋亡；(d)过表达miR-150能够在HCT-116和HT-29中逆转5-FU诱导的凋亡的量化结果。
[0028]图3显示了 5-FU提高了 HCT-116和HT-29细胞中miR-150的表达水平；
[0029](a,b)HCT-116 和 HT-29 在不同浓度 5-FU 的处理下(O μ M, 2 μ M, 4 μ M, 6 μ M, 8 μ M,10 μ Μ) miR-150的表达水平；(c) 5-FU在10 μ M的浓度下提高了 miR-150在HCT-116和HT-29的表达水平，但是对SW480细胞的miR-150的表达没有影响(*P〈0.05)。
【具体实施方式】
[0030]以下【具体实施方式】是对本发明技术方案的进一步阐释，而非限制。
[0031]实施例1不同类型结直肠癌细胞系中miR-150表达与耐药性的关系
[0032]细胞的培养:
[0033]结直肠癌细胞系Caco-2，HCT-116, HT-29和SW620由中山大学胃肠病学研究所保存，Caco-2 用含 10% 胎牛血清(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)的 DMEM(Gibco, China)培养基，HCT-116, HT-29 和 SW620 用含 10% 胎牛血清(Invitrogen，Grand Island, NY, USA)的RPMI1640 (Gibco，China)培养基，置于含5%的二氧化碳、37°C恒温潮湿的培养箱中培养。
[0034]5-FU暴露试验:
[0035]将5-FU (Sigma, China)粉剂用DMSO配制成浓度为0.1M的储存液备用。细胞以
0.25 X IO6个/孔的密度接种于6孔板后培养24小时，加入5-FU使得终浓度分别为2 μ Μ，4 μ Μ，6 μ Μ，8 μ Μ，10 μ Μ，以溶剂DMSO为空白对照，分别培养24、48、72小时。
[0036]miR-150表达水平的检测:
[0037]按照TRIZOL试剂(Invitrogen，USA)的生产商说明书中的步骤提取细胞总RNA。步骤如下:(1)吸弃培养基，用Iml的PBS冲洗两次，每孔加入TRIZOL试剂1ml，室温放置5min ; (2)将细胞裂解液全部转移到1.5ml的EP管中，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温下静置5min, 12，000g,4°C离心15min ; (3)取上层水相转移到另外一个新的无RNase的离心管内，加入等体积的异丙醇，轻柔混匀，室温放置IOmin, 12, 000g,4°C离心15min ； (4)弃上清，加入75%乙醇洗涤RNA沉淀，7，500g, 4°C离心5min，弃上清，空气干燥RNA沉淀lOmin，用 DEPC 水溶解 RNA。用 All-1n-One miRNA qRT-PCR Detection Kit (Gene Copoeia, China)试剂盒进行RT-PCR扩增。所得定量数据由7500software v2.0.6 (Applied Biosystems)导出，每个样品的threshold cycle (Ct)值代表所测基因的表达水平，由Λ ACt方法计算出来的值代表miR-150与内参基因的差异，最后由方法处理数据，得出数据代表miR-150的表达水平。
[0038]结果如图1所示。`在HCT-116，HT-29结直肠癌细胞系中，过表达miR-150与肿瘤细胞耐药性密切相关。发明人的microRNAs基因芯片结果显示miR-150在结直肠癌患者中耐药患者病人的表达水平是敏感患者的2.28倍(Dou, R., et al., Mult1-microarrayidentifies lower AQP9expression in adjuvant chemotherapy nonresponders withstage III colorectal cancer.Cancer Lett, 2013.336 (I):p.106-13.)。前期研究显不不同结直肠癌细胞系对5-FU的化疗敏感度不同，由IC50 (半数抑制浓度)得到它们的耐药关系从小到大为Caco-2，HCT-116, HT-29和SW620。为了进一步探讨miR-150与化疗耐药的关系，参照发明人前期研究从各个结直肠癌细胞系所测得的IC50 (半数抑制浓度)，在这四种细胞系中检测miR-150的表达水平，该实验中，Caco-2的Λ CT值为参照值，U6为内参。数据显示(图1)，
[0039]结果显示出了前述研究所预期之外的结果。除了 SW620以外，HCT-116&HT_29随着细胞耐药性的增加，miR-150的表达水平随之增加，尤其是对于HT-29，miR-150的表达与耐药性关联度远远高于其他细胞(图1)。
[0040]紧接着发明人用microRNA的模拟物miR-150及miR-NC瞬时转染HCT-116及HT-29，miciORNA模拟物最终浓度为50nM。转染4_6小时后更换不含抗生素的新鲜完全培养基。为了检测miR-150的转染效率，转染细胞培养3天后提取细胞总RNA进行RT-PCR检测miR-150的表达水平，结果显示转染miR-150的细胞(处理组)的miR-150的表达水平明显高于对照组(图lb)。在确定转染效率后，我们进行5-FU的药物毒性实验，将瞬时转染了microRNA模拟物的HCT-116及HT-29，培养24小时更换浓度为8 μ M的5-FU，培养3天后用WST-1检测细胞吸光度。试验结果证实了过表达miR-150的HCT-116及HT-29相比转染了对照micoRNA模拟物的细胞(miR-NC)更能抵抗5-FU的诱导作用。(图lc，d)
[0041]可见，在结直肠癌细胞系HCT-116及HT-29中过表达miR-150能够导致细胞更耐5-FU (图1)。但这个情况并非对所有结直肠癌细胞系均适用。
[0042]在耐药性的判断方面，将不同的结直肠癌细胞系进行区分，将miR-150检测试剂特定地用作HCT-116或HT-29结直肠癌细胞系耐药性的检测试剂，将能获得大大提高的准确率，分别达78.5%和85.9%ο
[0043]实施例2miR_150在不同类型结直肠癌细胞系中的抗凋亡作用
[0044]miR-150 瞬时转染 HCT-116 和 HT-29:
[0045]当细胞接种于培养板24小时细胞密度达到50%后，按照生产商说明以脂质体Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA)为载体用 microRNA 的模拟物 miR-150 及 miR-NC 瞬时转染HCT-116及HT-29，microRNA模拟物最终浓度为50nM。转染4_6小时后更换不含抗生素的新鲜完全培养基。为了验证转染效果，另外设置实验细胞转染后三天提取总RNA通过实时定量PCR验证miR-150过表达效果。
[0046]细胞增殖试验:
[0047]使用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(Roche Applied Science,USA)进行细胞增殖实验。即接种于96孔板的细胞转染后分别培养24、48、72小时，培养基每两天更换一次，当培养细胞达到设定天数后，快速把10 μ I的WST-1加到孔中，培养30min后，使用酶标仪(BioRad，China)检测吸光度，直到90min为止，酶标仪检测设定波长为450nm，参考波长为630nm。
[0048]细胞凋亡试验:`
[0049]细胞转染后24小时，更换终浓度为8 μ M的5_FU的完全培养基(不含抗生素)，以DMSO为溶剂对照组，继续培养48小时后用胰酶消化细胞，用PBS (Phosphate BufferedSaline)重悬细胞3次以完全除去培养基，使用(Annexin V-FITC apoptosis Detectionkit, BD Biosciences, USA)试剂盒进行细胞凋亡实验。(I)按照I X 106/ml的浓度将冲洗后的细胞用IXBinding Buffer重悬；(2)取100 μ I的细胞悬液于流式检测管中，再加入5μ I的APC Annexin V和5 μ I的PI混合均匀，温室避光孵育20min ;(3)按照每50 μ I的细胞体积加入Intrapred试剂I混合均匀，室温避光孵育15min ； (4)加入400 μ I的IXBinding Buffer重悬，I小时内进行细胞凋亡检测。数据用流式细胞术分析软件BDFACSDiva Software v6.1.3 计算。
[0050]统计学分析:
[0051]数据绘图及分析分别使用Graphpad Prism(version5.0)和 SPSS(versionl8.0)software。所有试验最少重复两次,两样品独立T检验评价数据统计学意义,设定P〈0.05差异有统计学意义。
[0052]为了研究miR-150在结直肠癌中的作用，我们进行了细胞增殖实验。我们发现miR-150能够抑制HCT-116及HT-29细胞的增殖，结果如图2所示在第五天，HCT-116实验组的抑制率为63.7%±8.5%，对照组为27.4±14%(图2a)。HT-29实验组的抑制率为65.1%±10.9%，对照组为 29.2±9.1%(图 2b)。
[0053]凋亡逃逸在肿瘤对化疗药物耐受的形成与发展中有重要作用，为此，我们进行细胞凋亡实验。我们用miR-150与miR-NC转染HCT-116与HT-29，继续培养48小时后，用检测凋亡试剂盒检测细胞凋亡率，发现与对照组相比，转染miR-150的细胞的凋亡率均有所下降，下降幅度分别达到22.3% (HCT-116)和9.6% (HT-29)，miR-150在这里起了抗凋亡的作用(图2c)，图2e，2f展示的就是凋亡率的量化分析。为了进一步证实miR-150抗凋亡的作用，转染后我们用8μ M的5-FU与细胞共培养48小时再检测其凋亡率，溶剂作为对照。发现加了 5-FU的细胞的凋亡率未见增加或者比对照组的凋亡率更低(图2d，2f)，因此我们推测这种现象可能与miR-150负调控凋亡诱导因子p53(Zhang, N., X.Wei, and L.Xu, miR-150promotes the proliferation of lung cancercells by targeting P53.FEBS Lett, 2013.587 (15):p.2346-51.)> EGR2 (ffu, Q., etal., MiR-150promotes gastric cancer proliferation by negatively regulating thepro-apoptotic gene EGR2.Biochem Biophys Res Commun, 2010.392(3):p.340-5.)和P2X7(Zhou, L.,et al., MicroRNAs miR_186and miR-150down_regulate expression ofthe pro-apoptotic purinergic P2X7receptor by activation of instability sitesat the3' -untranslated region of the gene that decrease steady-state levels ofthe transcript.J Biol Chem, 2008.283(42):p.28274-86.)抑制凋亡有关。
[0054]综合上述两个实施例的结果，采用miR-150抑制剂作为HCT-116及HT-29的耐药逆转剂，消除miR-150的凋亡抑制作用，从而逆转细胞耐药性(耐5-FU)。发明人采用miR-150抑制剂的逆转HCT-116及HT-29耐药性方面的有效率分别达到了 30.8%和37.7%。
[0055]实施例3 5-FU对HCT-116及HT-29中miR-150表达水平的上调作用
[0056]已有研究报道5-FU能够调控某些microRNA的表达水平，如在结直肠癌中，引起DNA损伤的药物能够通过上调P53的表达从而上调miR-34a，miR-16-1, miR-143, miR-145和miR-206的表达水平。同时5-FU也能够下调MiR_200b，miR-210和miR-224的表达水平。为了探明5-FU对miR-150可能的调控作用，我们用一系列浓度的5-FU处理HCT-116及HT-29检测miR-150的表达水平。
[0057]实验结果如图3所示在HCT-116及HT-29中，5-FU能够明显提升miR-150的表达水平(图3a，3b)。进一步的实验证明5-FU上调miR-150的表达具有细胞特异性，它能够显著提高miR-150在HCT-116和HT-29中的表达水平，但不影响miR-150在SW480的表达水平。
[0058]由图2和图3的结果，miR-150可以抑制5_FU诱导的凋亡，而5_FU同时也会提升miR-150的表达，进一步恶化了细胞的耐药性而阻碍了治疗的顺利进行，可见，miR-150抑制剂在针对5-FU化疗过程中的细胞耐药逆转方面具有尤为突出的意义和作用，尤其适用于HCT-116和HT-29系的结直肠癌5-FU耐药逆转。
【权利要求】
1.miR-150抑制剂在制备结直肠癌耐药逆转剂上的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的结直肠癌为高表达miR-150的结直肠癌。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的结直肠癌为HCT-116系和/或HT-29系O
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的结直肠癌为HT-29系。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的耐药是由所述药干扰P53依赖诱导凋亡途径所引起。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药为细胞周期药物。
7.如权利要求1 所述的应用，其特征在于所述的药5-FU类药物。
8.miR-150检测试剂在制备结直肠癌患者耐药性检测试剂中的应用，所述的直肠癌为HCT-116 系和 / 或 HT-29 系。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的直肠癌为HT-29系。
【文档编号】C12Q1/68GK103721268SQ201410020449
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】杨湘玲, 杜晓阳, 黄兰兰, 王晓艳, 王瑞鑫, 董功航, 汪建平, 刘焕亮 申请人:中山大学附属第六医院