专利名称：：一种能够逆转白血病多药耐药的rna干扰药物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗白血病的药物，尤其是一种能够逆转白血病多药耐药的RNA干扰药物。
背景技术：
：多药耐药(multidrugresistance,MDR)是恶性肿瘤化疗失败的主要原因，也是常规化疗难以使白血病获得长期缓解的重要障碍。研究表明，由mdrl基因编码的p-糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)在肿瘤细胞表面过度表达是导致肿瘤细胞多药耐药主要机制。大约30%的急性粒细胞性白血病(AML)患者在初诊时就有P-gp的表达，而大于50%的AML复发患者有P-gp的表达。因此，以P-gp为靶点逆转肿瘤细胞耐药成为提高白血病化疗疗效的重要手段。目前临床应用的耐药逆转剂如维拉帕米和环胞菌素A等虽然有一定效力，但它们是P-gp的底物，是P-gp较弱的抑制剂，而且在有效药物浓度下毒性较大，产生严重不良反应，限制了其临床应用。RNA干扰(RNAinterferance，RNAi)是高度特异的mRNA水平上的基因沉默机制，能高效特异性地抑制靶基因表达。由于RNAi有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此无论是在功能基因组研究，还是肿瘤的基因治疗方面均具有广阔的应用前景。与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，RNAi技术具有明显的优点它比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失或降低突变；与DNA技术造成的功能永久性缺失相比，RNAi技术更为安全。目前，用于RNA干扰的核苷酸片段分为两种小干扰RNA(siRNA)和编码小发夹RNA(shRNA)，但siRNA片段可能在转染过程中降解或因细胞分裂而溶解消失使其不能稳定持久地发挥作用，而编码小发夹RNA(shRNA)质粒载体的运用可克服这种局限，从而使得利用RNAi长期封闭基因或抑制基因表达得以实现。
发明内容本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够逆转白血病多药耐药的RNA干扰药物，通过构建针对mdrl的RNA干扰载体，在mRNA水平和蛋白水平逆转白血病多药耐药。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是设计针对多药耐药基因mdrl的RNA干扰序列，构建表达shmdr1的载体(pGE-shmdr1)，RNA干扰序列为针对mdrlmRNA序列不同位点设计的小发夹状RNA片段，分别命名为shmdr1-1，shmdr1-2，shmdrl-3，shmdrl-4，将上述4个片段分别连接到pGE-1载体中，组成的RNA干扰载体为pGE-shmdrl-l，pGE-shmdrl_2，pGE-shmdrl_3，pGE-shmdrl_4，所述的RNA干扰载体药物为pGE-shmdr1-1。关于重组DNA技术，其方法详见《分子克隆实验指南》第三版黄培堂等译p68页。shmdrl-l，shmdrl-2，shmdrl-3，shmdrl-4四个片段的核苷酸序列为shmdrl-l:shmdrl-2:shmdrl-3:shmdrl-4:所述的shmdrl-l，shmdrl—2，shmdrl—3，shmdrl—4的耙位点为shmdrl-l:5-GAAACCAACTGTCAGTGTA_3508-526shmdrl-2:5-GACAGAAAGCTTAGTACCA-32453-2471shmdrl-3:5-GGCCTAATGCCGAACACAT_33491-3509shmdrl-4:5-GATCGCTACTGAAGCAATA-33103-3121将RNA干扰载体转染白血病多药耐药K562/A02细胞系建立稳定表达细胞株，筛选最有效的表达shmdrl的RNA干扰载体。本发明研制的RNA干扰载体药物能够有效抑制mdrl的表达，逆转白血病多药耐药，为白血病基因治疗提供实验证据和有效新药。图la是本发明所用的pGE-1载体示意图；图lb是阴性对照载体pGE-Negative载体示意图；图2是PCR扩增重组pGE-shmdr载体，1，2，3'4分别为pGE-shmdrl-l，pGE-shmdrl-2，pGE-shmdrl-3，pGE-shmdrl-4;图3是实时定量RT-PCR结果(*代表与p-N比较，p<0.001);图4是westernblot结果。具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式对本发明的抗白血病多药耐药的RNA干扰药物作进一步详细说明1:设计针对mdr1基因的RNA干扰序列根据GeneBank中mdrl基因序列设计shRNA，从mRNA的AUG起始密码开始寻找"AA"二连序列，以其下3—端的19个碱基序列作为潜在的RNAi靶点。进行BLAST分析并选取其中4个序列进行DNA合成，分别命名为shmdrl-l，shmdrl_2，shmdrl_3，shmdrl_4。shmdrl-l，shmdrl-2，shmdrl-3，shmdrl-4四个片段的核苷酸序列为shmdrl-l:shmdrl-2:shmdrl-3:shmdrl-4:2:构建表达针对mdrl的shRNA载体(pGE-shmdrl)(1)将合成的shmdrl的上游和下游序列经退火连接形成双链寡核苷酸片段，保存于-20。C。(2)BamHI和Xbal双酶切pGE_l载体(见图la，Stratagene公司)后，与sh-mdrl双链寡核苷酸片段孵育，16t:连接过夜。取5ul连接产物，转化以氯化钙方法制备的大肠杆菌(SCS-1)感受态，每种载体挑选3个阳性克隆，摇菌培养至对数生长期，取菌液lul进行PCR反应，上游引物5-CGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3，下游引物5-GAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATG-3。PCR反应程序为94。C变性3min;94。C30s，55。C30s，72。Clmin，共30个循环；最后72t:延伸5min。同时扩增pGE-l载体作为参照。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。pGE-l载体的产物长度为605bp，成功插入sh-mdrl片段的产物长度为647bp。图2所示1，2，3，4分别为pGE-shmdrl-l，pGE-shmdrl-2，pGE-shmdrl-3，pGE-shmdrl-4，其长度大于pGE-l载体的产物长度，证明连接产物的正确性。(3)对于成功插入sh-mdrl片段的重组载体进行测序鉴定(由上海生工公司完成)，以保证插入片段的准确性。将成功构建的重组载体分别命名为pGE-shmdrl-l，pGE_shmdrl_2，pGE_shmdrl_3，pGE_shmdrl_4。3:建立稳定表达shmdr-l的肿瘤细胞株及mdrl表达量的变化(1)将构建好的4个pGE-shmdrl载体(pGE-shmdrl-l，pGE-shmdrl-2，pGE-shmdrl-3，pGE-shmdrl-4)及阴性对照载体pGE-Negative(见图lb，Stratagene公司)采用脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen公司)方法分别转染白血病耐药细胞系K562/A02，用700ug/mlG418筛选，通过有限稀释法克隆化细胞，得到4个稳定表达pGE-shmdrl的肿瘤细胞株以及pGE-Negative肿瘤细胞株，将它们分别命名为pshl，psh2，psh3，psh4，P-N细胞。(2)实时定量RT-PCR方法检测各组细胞mdrl表达量的变化。分别收集pshl，psh2，psh3，psh4，p-N细胞，以lmlTrizol(Invitrogen公司)裂解细胞后，通过氯仿，异丙醇抽提得到RNA，经过紫外分光光度计检测RNA的纯度，取2ugRNA，用逆转录试剂盒(Promega公司)将其逆转录为cDNA，-2(TC保存。应用SYBRGreenI染料法(ABI公司)检测pshl，psh2，psh3，psh4，p-N，K562，K562/A02各组细胞mdrl的表达量，内参P-actin上游引物5-CCTGGCACCCAGCACAAT-3，下游引物5-GGGCCGGACTCGTCATAC-3;mdrl上游引物5-ATAATGCGACAGGAGATAGG-3，下游引物5-ATGTTGCCATTGACTGAAA-3;PCR反应条件为95°C15min，95。C15s，60。Clmin，40个循环；扩增曲线结束后，进行熔解曲线反应以验证PCR产物的特异性。以2—AAet法表示mdrl相对表达量。结果显示与P_N细胞组比较，pshl的mdrl相对表达量为0.05±0.07，psh2的mdrl相对表达量为0.617±0.146，psh3的mdrl相对表达量为0.437±0.06，psh4的mdrl相对表达量为0.298±0.06(p<0.OOl)，有显著的统计学意义。其中pshl组细胞降低最显著，见图3。(3)Westernblot方法检测各组细胞P-糖蛋白的表达量。分别收集pshl，psh2，psh3，psh4，p-N，K562，K562/A02细胞，以蛋白裂解液(10mMTris-HCl(pH7.4)，1%NP-40,0.1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，O.15MNaCl，lmMEDTA-2Na)冰上裂解30min，12000rpm，4度离心10min收集上清。BCA法测定蛋白浓度，取20ug变性后的样品，以5%浓縮胶和8%分离胶进行蛋白电泳，然后转膜，封闭，一抗为鼠抗人P-gP(SantaCruz公司1:1000)室温孵育2小时，TBST洗涤，二抗为兔抗鼠IgG-HRP(SantaCruz公司1:10000)室温孵育1小时，洗涤，ECL显影。同时以P-ACTIN为内参照。Westernblot结果显示与P_N细胞组比较，pshl，psh2，psh3，psh4各组细胞P-gP蛋白的表达量均下降，其中pshl细胞组降低最显著，见图4。4:RNAi用于逆转K562/A02细胞恶性表型及药物敏感性实验(1)罗丹名123蓄积实验用无血清，无抗生素1640培养基调整pshl，psh2，psh3，psh4，p-N各组细胞浓度至107ml，取各组细胞lml置于6孔板中培养，加入罗丹名123，终浓度为10umol/l，37度培养箱中孵育lh，同时以不加罗丹名123的p-N细胞作为阴性对照，孵育结束后以冰冷PBS洗涤两次，流式细胞仪进行检测。结果显示与P-N细胞组(154.8±42.88)比较，各组细胞罗丹名123的平均荧光强度均增加，证明P-gP蛋白功能减弱，其中pshl组细胞的平均荧光强度(660±89.74)增加最为显著(p<0.05)。(2)罗丹名123外排实验用无血清，无抗生素1640培养基调整pshl，psh2，psh3，psh4，p-N各组细胞浓度至107ml，取各组细胞lml置于6孔板中培养，加入罗丹名123，终浓度为10umol/l，37度培养箱中孵育30min，同时以不加罗丹名123的p-N细胞作为阴性对照，孵育结束后以冰冷PBS洗涤两次，再以无血清，无抗生素1640重悬各组细胞，继续孵育lh，孵育结束后以冰冷PBS洗涤两次，流式细胞仪进行检测。结果显示与P-N细胞组(8.7±1.64)%比较，各组细胞罗丹名123的荧光强度均增加，证明P-gP蛋白外排功能减弱，其中pshl组细胞罗丹名123的阳性率达到了(96.35±3.04)%，证明pshl组细胞的P-gP蛋白表达最低，外排能力最弱(P<0.01)。(3)CCK8法检测化疗药物的敏感性调整pshl，psh2，psh3，psh4，p-N，K562，K562/A02各组细胞浓度至107ml，每孔100ul，加入不同浓度的阿霉素(ADM)O.01-20ug/ml，药物浓度按5倍比增加，每孔终体积为200ul，每组细胞每个浓度设3个复孔，培养72h后加入20ulCCK8(上海同仁化学所)，37度孵育2h，在酶标仪上450nm波长测定各孔吸光值(A)。细胞存活率(％)=(实验孔A450-空白孔A450)/(对照孔A450-空白孔A450)。计算药物作用的50%抑制浓度(IC50)，增敏倍数，增敏倍数=对照组IC50/实验组IC50。同样的方法分别检测各组细胞对长春新碱(VCR)，足叶以甙(VP-16)的敏感性，并计算IC50，增敏倍数，实验重复3次。结果显示与P-N细胞组比较，pshl，psh2，psh3，psh4各组细胞对ADM的敏感性均增加，其中pshl组细胞对ADM的增敏倍数为39.2，敏感性增加最显著(p<0.01)。见表1-1。表1-1A面IC50(ug/ml)增敏倍数"^S5.88±0.05pshl0.15±0.007*39.2psh24.76±0.11*psh33.3±0.28*1.78psh41.7±0.25*3.46*代表与p-N比较，P<0.01表1-2显示各组细胞对长春新碱(VCR)的敏感性，与P-N细胞组比较，pshl细胞组IC50为0.71±0.06ug/ml，增敏倍数为11.17，敏感性增加最显著(p<0.01)。表1-2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*代表与p-N比较，P<0.01表1-3显示各组细胞对足叶以甙(VP-16)的敏感性，与P-N细胞组比较，pshl细胞组IC50为0.64±0.22ug/ml，增敏倍数为31.53，敏感性增加最显著(p<0.01)。证明pGE-shmdrl-l载体干扰效果最好。表1-3VP-16IC50(ug/ml)增敏倍数p-N20.18±0.24pshl0.64±0.22*31.53psh27.73±0.62*2.61psh35.67±0.29*3.56psh42.52±0.23*8.01*代表与p-N比较，P<0.01序列表(SEQUENCELISTING)〈110〉中国医学科学院血液学研究所〈120〉一种能够逆转白血病多药耐药的RNA干扰药物〈160>5〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>57〈212>RNA〈213〉人类(Homosapiens)〈220〉〈221>stem_loop〈222〉(1)(57)〈400〉1g肌cccga朋cc朋cugucagugimuc朋gagimcacugacag皿ggu皿c皿皿皿57〈210>2〈211>57〈212>RNA〈213〉人类(Homosapiens)〈220〉〈221>stem_loop〈222〉(1).(57)〈400>2ggc皿ugg皿gac3guc3caimg皿cuc肌gugacuguca3cca朋g朋3a朋g肌c57〈210>3〈211>57〈212>DNA〈213〉人类(Homosapiens)〈220〉〈221>stem_loop〈222〉(1).(57)〈400>3gatcccgaaaccaactgtcagtgtatcaagagtacactgacagttggtttctttttt57〈210>4〈211>57<212〉DNA〈213〉人类(Homosapiens)〈220〉<221〉stem_loop〈222〉(1)(57)〈400>4ggctttggttgacagtcacategttctcatgtgactgtcaaccaaagaaaaaagatc57〈210>5〈211>19〈212>DNA〈213〉人类(Homosapiens)〈220〉〈221>exon〈222>(1).(19)〈400>5gaaaccaactgtcagtgta19GluThrAsnCysGinCys1权利要求一种能够逆转白血病多药耐药的RNA干扰药物，针对多药耐药基因mdrl进行靶点治疗，其特征是针对mdrlmRNA序列设计的一段小发夹状RNA片段，其序列为5-GAUCCCGAAACCAACUGUCAGUGUAUCAAGAGUACACUGACAGUUGGUUUCUUUUUU-3(SEQINNO1)3-GGCUUUGGUUGACAGUCACAUAGUUCUCAUGUGACUGUCAACCAAAGAAAAAAGAUC-5(SEQINNO2)。2.根据权利要求1所述的能够逆转白血病多药耐药的RNA干扰药物，其特征是所述的小发夹状RNA片段相对应的DNA序列为3)4)称之为shmdrl-l，其靶位点为5-GAAACCAACTGTCAGTGTA-3mdrl基因的508-526位点(SEQINNO:5)。3.根据权利要求2所述的能够逆转白血病多药耐药的RNA干扰药物，其特征是由shmdrl-1与pGE-1载体重组形成的pGE-shmdrl-l载体。全文摘要本发明公开了一种能够逆转白血病多药耐药的RNA干扰药物，针对多药耐药基因mdr1进行靶点治疗，提供了一段针对多药耐药基因mdr1的干扰RNA的核苷酸序列，其序列为5-GAUCCCGAAACCAACUGUCAGUGUAUCAAGAGUACACUGACAGUUGGUUUCUUUUUU-3，3-GGCUUUGGUUGACAGUCACAUAGUUCUCAUGUGACUGUCAACCAAAGAAAAAAGAUC-5，具有逆转白血病多药耐药的功能，能够增强化疗药物对于白血病肿瘤细胞的杀伤作用。文档编号A61P35/02GK101732729SQ20081015324公开日2010年6月16日申请日期2008年11月21日优先权日2008年11月21日发明者刘斌,杜伟廷,杨仁池,顾东生申请人:中国医学科学院血液学研究所