专利名称：：一种逆转肿瘤细胞多药耐药的中药制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种逆转肿瘤细胞多药耐药的中药制剂及其制备方法，属于医药生物领域。
背景技术：
：肿瘤细胞多药耐药是化疗失败的主要原因，也是肿瘤患者死亡的重要因素，肿瘤细胞可通过多种途径产生多药耐药出现化疗抗性，这些途径可以简要概括为以下几个方面在细胞膜水平，膜蛋白如P170、MRP、LRP、BCRP等表达升高，加速药物外排，使细胞中药物蓄积减少；在细胞浆水平，包括GST、PKC、P450还原酶、辅酶II等多种胞浆内酶活性增强，使细胞解毒功能加大，加速化疗药物的代谢和降解；在细胞核水平，TOPOII发生数量、活性、结构和分布的改变以及DNA修复能力增强，使DNA受损减少；多药耐药肿瘤细胞凋亡相关基因甚至还有癌基因的表达水平发生了变化，如Bcl-2、Bcl-xl表达升高等，使化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡减少，产生耐药性，对化疗药物产生抗性，引起化疗失败，降低临床化疗效果。
发明内容针对上述现有技术，本发明提供了一种用于逆转肿瘤患者多药耐药、提高化疗疗效的中药制剂。本发明是通过以下技术方案实现的—种逆转肿瘤细胞多药耐药的中药制剂，是由以下重量份的原料药制成的黄芩苷12份，栀子苷12份。—种逆转肿瘤细胞多药耐药的中药制剂的制备方法，步骤如下(1)取黄芩，加水煎煮2次，每次13小时，离心或其他方法滤过(离心或其它常规方法)，合并滤液，浓縮滤液，用盐酸调pH值至1.82.0，6(TC保温30分钟，冷却至室温，放置12小时，滤过，残渣用乙醇洗至pH值4.0，然后向残渣中加10倍量(按体积)水搅拌均匀，用氢氧化钠溶液调pH值至7.0，溶解后加等量乙醇(按体积)搅匀，放置12小时，滤过，滤液用盐酸调pH值至1.82.0，8(TC保温30分钟，冷却至室温，滤过，残渣用乙醇洗至pH值4.0，真空干燥，粉碎成细粉，即得96.09%以上纯度的黄芩苷；(2)取栀子，加5倍量(5倍量是指栀子重量)80%的乙醇回流提取两次，每次23小时，滤过，合并提取液；回收乙醇得浓縮液；浓縮液依次用石油醚和正丁醇萃取；正丁醇部位浓縮得浸膏；将正丁醇部位拌样、上硅胶柱，用氯仿_甲醇进行梯度洗脱，在氯仿-甲醇(100:7)时，出现大量粉末，氯仿-甲醇重结晶，即得白色针状结晶，即为栀子苷，纯度99%以上;(3)取上述制备的黄芩苷、栀子苷，混合，加水溶解，制成合剂；或取上述制备的黄芩苷、栀子苷，混合，加水溶解，然后加入淀粉或糊精，加热浓縮或喷雾干燥后加入淀粉制粒，制成颗粒剂或胶囊剂。所述步骤(1)中，浓縮滤液至生药量体积的1/10。所述步骤(1)中，盐酸的浓度为2mol/L;氢氧化钠溶液的浓度为20%(质量/体积)。服用时，每日两次，每次服用量为颗粒剂1.5g，胶囊剂12粒(每粒0.35克)。肿瘤细胞可通过多种途径产生多药耐药出现化疗抗性，这些途径可以简要概括为以下几个方面在细胞膜水平，膜蛋白如P170、MRP、LRP、BCRP等表达升高，加速药物外排，使细胞中药物蓄积减少；在细胞浆水平，包括GST、PKC、P450还原酶、辅酶II等多种胞浆内酶活性增强，使细胞解毒功能加大，加速化疗药物的代谢和降解；在细胞核水平，TOPOII发生数量、活性、结构和分布的改变以及DNA修复能力增强，使DNA受损减少；多药耐药肿瘤细胞凋亡相关基因甚至还有癌基因的表达水平发生了变化，如Bcl-2、Bcl-xl表达升高等，使化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡减少，产生耐药性。国内学者从90年代开始开展中药逆转肿瘤耐药的研究，体外实验已证实青蒿素、补骨脂素、姜黄素、贝母碱、苦参碱、川芎嗪、大黄酸、三氧化二砷(As203)、桂皮醛、大豆甙元、金雀黄素、薯蓣皂苷、粉防己碱等中药组分和中药复方对HL60/HT、K562/ADM、SGC7901/ADR、KBv200、K562/A02等人耐药肿瘤细胞的多药抗性具有逆转作用；体内实验证实粉防己碱、苦参碱明显降低化疗诱导的小鼠耐药肿瘤细胞P170的表达率；蟾酥素灵、雄黄等药物均可抑制HL-60/ADR细胞生长，逆转耐药性，促进细胞凋亡，其机制可能与下调P170和TopoII过度表达有关。本申请的发明人做了大量的实验研究，研究结果表明本发明的黄芩苷l-2份，栀子苷l-2份中药制剂具有明显降低化疗诱导的小鼠耐药S，肿瘤细胞P170的表达率，其机制可能与下调P170和TopoII过度表达有关；抑制K562/A匿耐药肿瘤细胞细胞生长，逆转耐药性，促进细胞凋亡。具体实施例方式下面结合实施例数据对本发明作进一步的说明实施例1:逆转肿瘤患者多药耐药、提高化疗疗效的中药制剂所需原料如下黄芩500g、栀子500g。制备工艺为1)分别将黄芩、栀子粉碎；2)取黄芩500g，加水煎煮2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液浓縮至适量(与生药量之比IO:1)，用2mol/L盐酸溶液调pH值至1.82.0，6(TC保温30分钟，冷却至室温，放置12小时，滤过，残渣用乙醇洗至pH值4.O，加IO倍量水搅拌均匀，用20%氢氧化钠溶液调pH值至7.O，溶解后加等量乙醇搅匀，放置12小时，滤过，滤液用2mol/L盐酸溶液调pH值至1.82.0，8(TC保温30分钟，冷却至室温，滤过，残渣用乙醇洗至pH值4.0，真空干燥，粉碎成细粉，即得96.09%以上纯度的黄芩苷(96.09-98.15);3)将栀子500g用5倍量80X的乙醇回流提取两次，每次2小时，滤过，合并提取液。回收乙醇得浓縮液。浓縮液依次用石油醚和正丁醇萃取。正丁醇部位浓縮得浸膏。将正丁醇部位拌样、上硅胶柱，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，在氯仿-甲醇(100:7)时，出现大量粉末，氯仿-甲醇重结晶，即得白色针状结晶的99%栀子苷(99.70-99.73)(所分离的白色结晶与京尼平苷对照品进行薄层检测和共熔点测定，薄层显示同一位置的斑点，熔点未发生变化，熔点为16716『C，确定该化合物结构为栀子苷)；4)黄芩苷1-2份，栀子苷1-2份加入适量淀粉或糊精制粒，制成颗粒剂或胶囊剂。试验数据小鼠S180细胞肿瘤耐药模型的建立及小鼠分组腹水型S18。小鼠经模拟化疗PFC方案，顺铂3mg/kgip，每周一次；环磷酰胺和5-FU各3mg/kg'ig，每日一次，连续四周，(两周时一对一传代一次)。获得耐药小鼠S湖模型，无菌抽取化疗诱导4周的耐药小鼠S18。腹水，无菌NS稀释至含细胞数1X107ml，每鼠0.2mlip接种。小鼠接种耐药S18。细胞后24h，随机分为对照组、本方颗粒100mg/kg、50mg/kg组，每组14只，对照组为水0.2ml/10gig，本方颗粒100mg/kg和50mg/kg组分别给予0.5%、0.25%的颗粒混悬液0.2ml/10g'ig，连续10天，于末次给药24h后，无菌抽出腹水，肝素抗凝，4PBS液洗涤，1500rpm离心5min，共3次，后70%乙醇固定，4。C保存，2.2MDR1表达产物P170、TOPOII、LRP表达的检测方法取70%乙醇固定的小鼠S18。细胞，由4PBS液稀释后，1500rpm离心5min，再次洗脱一次，并调整细胞浓度为1X106/ml，摇匀，取细胞悬液500iil，加入各自相对应的异硫氢酸荧光素标记的鼠抗人的单克隆抗体IgGl工作液20iU，另各取一支阴性对照抗IgGl-FITC，37t:避光反应20min后，由流式细胞仪荧光检测。仪器的检测变异系数<2%，测定1万个细胞的上述5种相关生物分子的表达，激发光波长均为488nm。1.试验结果3.1对化疗诱导的多药耐药腹水型小鼠S18。肉瘤细胞MDR1表达产物P17。(P_糖蛋白、P-gp)过度表达的逆转作用取70X乙醇固定的各鼠多药耐药S，肿瘤细胞，由ra7.4PBS液，以1500rpm离心5min再次洗涤，并配成细胞浓度为1X106/ml悬液，由荧光P17。单克隆抗体IgGl标记避光30min，由流式细胞仪测定各鼠S18。细胞荧光强度，统计分析各组小鼠S18。肿瘤细胞P17。表达率，如表1。表1对化疗诱导的多药耐药小鼠S180细胞P17。过度表达的逆转作用文士S<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注抑制率(％)=(对照组_给药组)+对照组X100%。试验结果提示诱导4周的和再传代10天后对照组小鼠S18。肿瘤细胞肿瘤多药耐药相关基因P17。表达无显著性差异，说明诱导后的耐药小鼠S18。细胞的基因表达较为稳定。黄连解毒汤总碱明显逆转对耐药小鼠S18。细胞耐药基因P17。过度表达。说明黄连解毒汤总碱逆转化疗诱导的多药耐药细胞耐药基因P17。表达是其逆转肿瘤多药耐药的重要途径之3.2逆转多药耐药小鼠S，细胞肺耐药蛋白LRP过度表达各组小鼠耐药S18。细胞测试前处理如3.1，细胞经避光反应30min，与荧光单克隆IgGl结合，流式细胞仪检测结果如表2。表2黄连解毒汤醇提物对小鼠耐药S18。细胞LRP过度表达的影响文士S组别剂量(mg/kg)nLRP表达率抑制率(％)对照组1167.65±25.42本方颗粒100106.86±3.39***89.86本方颗粒501010.76±6.28***84.09注与诱导后传代对照组比较"***P<0.001;"&"与化疗诱导四周后比较；抑瘤率(％)=(对照组_给药组)+对照组X100%。试验结果提示经化疗诱导4周后传代IO天的小鼠耐药S，肿瘤细胞LRP表达率与诱导4周比较无明显变化，而给予黄连解毒汤总碱明显逆转了耐药S18。肿瘤细胞LRP的过度表达，说明生物碱具有逆转耐药肿瘤细胞LRP过度表达的作用，这可能是生物碱逆转多药耐药的机制之一。3.3逆转小鼠S180耐药细胞DNA拓扑异构酶TOPOII表达各组小鼠S18。耐药细胞前处理如3.l，测试前室温避光反应30min，荧光单克隆抗体IgGl结合20min，测定结果如表3。表3对小鼠S180耐药细胞TOPOII表达的影响又士S组别剂量(mg/kg)NTOPOII表达率抑制率(％)对照组1124,45±14,35本方颗粒100106.18±3.78***74。72本方颗粒50108.58±4.10***64,91注与诱导传代后对照组比较"***"P<0.001;"&"与化疗诱导四周比较；抑瘤率(％)=(对照组_给药组)+对照组X100%。3.4对小鼠化疗诱导耐药S18。细胞凋亡的影响取70%乙醇固定的各鼠多药耐药S18。肿瘤细胞，由4PBS液，以1500rpm离心5min再次洗涤，并配成细胞浓度为1X106/ml悬液，取含细胞1X107ml的细胞悬液500iil，加于PI工作液500iU(浓度为10yg/ml)，避光室温放置30min后，由流式细胞仪荧光测定激发光为351nm，各组细胞凋亡率如表1。表l对化疗诱导小鼠耐药S，细胞凋亡的影响文士SD<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种逆转肿瘤细胞多药耐药的中药制剂，其特征在于，是由以下重量份的原料药制成的黄芩苷1～2份，栀子苷1～2份。2.权利要求1所述的一种逆转肿瘤细胞多药耐药的中药制剂的制备方法，其特征在于步骤如下(1)取黄芩，加水煎煮2次，每次13小时，滤过，合并滤液，浓縮滤液，用盐酸调pH值至1.82.0，6(TC保温30分钟，冷却至室温，放置12小时，滤过，残渣用乙醇洗至pH值4.O，然后向残渣中加10倍量水搅拌均匀，用氢氧化钠溶液调pH值至7.O，溶解后加等量乙醇搅匀，放置12小时，滤过，滤液用盐酸调pH值至1.82.0，8(TC保温30分钟，冷却至室温，滤过，残渣用乙醇洗至pH值4.0，真空干燥，粉碎成细粉，即得黄芩苷；(2)取栀子，加5倍量80%的乙醇回流提取两次，每次23小时，滤过，合并提取液；回收乙醇得浓縮液；浓縮液依次用石油醚和正丁醇萃取；正丁醇部位浓縮得浸膏；将正丁醇部位拌样、上硅胶柱，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，在氯仿-甲醇(100:7)时，出现大量粉末，氯仿_甲醇重结晶，即得白色针状结晶，即为栀子苷；(3)取上述制备的黄芩苷、栀子苷，混合，加水溶解，制成合剂；或取上述制备的黄芩苷、栀子苷，混合，加水溶解，然后加入淀粉或糊精，加热浓縮或喷雾干燥后加入淀粉制粒，制成颗粒剂或胶囊剂。3.根据权利要求1所述的一种逆转肿瘤细胞多药耐药的中药制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，浓縮滤液至生药量体积的1/10。4.根据权利要求1所述的一种逆转肿瘤细胞多药耐药的中药制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，盐酸的浓度为2mol/L;氢氧化钠溶液的浓度为20%。全文摘要本发明公开了一种逆转肿瘤细胞多药耐药的中药制剂，是由以下重量份的原料药制成的黄芩苷1～2份，栀子苷1～2份。制备方法为先制备黄芩苷和栀子苷吗，然后取黄芩苷、栀子苷，混合，加水溶解，制成合剂；或取黄芩苷、栀子苷，混合，加水溶解，然后加入淀粉或糊精，加热浓缩或喷雾干燥后加入淀粉制粒，制成颗粒剂或胶囊剂。本申请的发明人做了大量的实验研究，研究结果表明本发明的黄芩苷1-2份，栀子苷1-2份中药制剂具有明显降低化疗诱导的小鼠耐药S180肿瘤细胞P170的表达率，其机制可能与下调P170和TopoII过度表达有关；抑制K562/ADM耐药肿瘤细胞细胞生长，逆转耐药性，促进细胞凋亡。文档编号A61K31/7048GK101744832SQ201010011448公开日2010年6月23日申请日期2010年1月14日优先权日2010年1月14日发明者乔高娟,孙付军,李贵海,董学,陆永辉申请人:山东省中医药研究院