本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性和核酸递送功能的阳离子化香菇多糖制备方法及其作为基因载体的同时发挥免疫学活性的应用。
背景技术：
肿瘤是威胁人类健康和生命的常见疾病之一，其发病率和死亡率呈上升趋势，国际癌症研究中心预测未来20年全球新增肿瘤病例会上升到每年2200万，肿瘤患者死亡病例将上升到每年1300万(IARC Science Public Lyon, 2014, 1: 1365)。肿瘤已成为全世界关注的极其重要的公共卫生疾病。目前，临床用于肿瘤治疗的大部分化疗药物，主要通过抑制细胞增殖和肿瘤生长发挥其作用，在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常细胞，其昂贵的医疗费用和较大的毒副作用严重影响了患者的生活质量，已经成为患者及学者所面临的共同难题，因而人们一直寻找最优化的肿瘤治疗方法。
中药在肿瘤治疗方面日益显现出很大的优势，已成为我国肿瘤治疗领域的一大特色。多糖是中药研究最深入、最广泛的抗肿瘤活性成分之一，更是中药抗肿瘤生理作用的主要物质之一，被称为“生物反应调节剂”。与直接杀伤肿瘤细胞的化疗药物不同，中药多糖除了具有直接抑制肿瘤细胞作用之外，更重要是通过其免疫调节作用刺激网状内皮系统，激活多种免疫细胞，提高宿主对肿瘤细胞的特异性抗原免疫反应能力，这也是防治肿瘤复发与转移的重要条件。赵国华等(药学学报, 2003, 38: 37)报道，山药多糖对Lewis 肺癌和B16黑色素瘤有最佳的抑制作用。李小定等(华中农业大学学报, 2002, 21: 261)实验证明，灰树花多糖既可直接杀伤癌细胞又可提高机体的免疫力。谢遵江等(解剖学报, 2002, 33: 538)发现人参多糖本身或诱导产生的细胞因子能增强IL-2对NK 细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的刺激作用，对肿瘤有极强的杀伤和抑制作用。中药抗肿瘤机制的研究为治疗肿瘤提供了理论基础，同时也开辟了新途径。
香菇多糖(Lentinan，LNT)是从传统药食同源的香菇中分离、提取得到的药用活性成分。1969年Chihara 等率先从香菇中提取出抗肿瘤活性的多糖，活性成分是它分支结构中的β-(1→3)-D-葡聚糖，它主链的葡萄糖基通过β-(1→3)糖苷键连接而成，侧链的葡萄糖基由分布的β-(1→6)糖苷键连接形成，分子结构中含有大量活性基团-OH。临床上，将香菇多糖与化疗药物联用可用于不能手术切除或转移复发性肿瘤的辅助治疗(Carbohydrate Polymers, 2012, 88: 966-972)。例如，其与紫杉醇联用可激活NLRP3炎性体和ASK1/p38MAPK信号通路诱导A549细胞凋亡(Critical Reviews In Food Science and nutrition, 2015, 10: 132)。香菇多糖/S-1联合治疗胃癌患者，结果原发灶明显缩小，且腹部CT未检测到淋巴结转移(Carbohydrate Polymers, 2016, 137: 52)。研究发现，香菇多糖本身对肿瘤细胞没有直接抑制作用，而是激活T细胞，促进淋巴细胞活化因子的产生，释放各种辅助性T细胞因子，增强宿主腹腔巨噬细胞吞噬率，最终达到杀伤肿瘤细胞的。
肿瘤的发生与发展都与基因直接或间接相关，从基因水平治疗肿瘤能够直接纠正和修复与肿瘤发病有关的基因，有效达到治疗肿瘤的目的。而基因治疗肿瘤的成功与否在很大程度上取决于安全、高效的基因传递载体。以多糖为骨架，经聚乙烯亚胺等改性得到的纳米载体不仅具有生物相容性好的优点，同时也能高效压缩核酸并转染至细胞(Advanced Drug Delivery Reviews, 2013, 65: 1123-1147)。因此，多糖类纳米载体已成为目前基因传递载体的研究热点之一(郑州大学学报, 2014, 4: 457-460)。香菇多糖分子结构中含有大量活性基团，通过对其进行阳离子化修饰可实现基因递送的功能，并且保留了香菇多糖的生物活性，但是至今未见到有关阳离子化香菇多糖作为基因传递载体的同时又发挥免疫调节作用的公开报道。
技术实现要素：
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种阳离子化香菇多糖的制备方法，可作为基因载体递送系统并发挥免疫调节作用，有效解决肿瘤治疗中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，通过pH敏感型化学键将香菇多糖与低分子量的聚乙烯亚胺连接，香菇多糖分子量为20-800kD，聚乙烯亚胺分子量为600-1200D，聚乙烯亚胺与香菇多糖的摩尔比为1:3-10。具体制备方法是：
1）将50-150mg香菇多糖溶解于8-10ml去离子水或二甲基亚砜中，在23-27℃，氮气保护下与100-450mg活化试剂A避光反应4-48h，将反应液透析2-3d，或者在50℃与100-450mg活化试剂B反应4-24h，得活化的香菇多糖；所述的活化试剂A为高碘酸钾、乙二胺、含有3-5%乙二胺的磷酸盐缓冲液、羰基二咪唑、三乙胺的一种或两种以上，活化试剂B为马来酸酐、琥珀酸酐、4-二甲胺基吡啶、1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺的一种或两种以上；
2）将100-300mg聚乙烯亚胺溶于2-6ml体积浓度为3.7% 的盐酸或二甲基亚砜中，然后在氮气保护下接枝到活化的香菇多糖上，或者直接将100-300mg聚乙烯亚胺接枝到活化的香菇多糖上，在23-27℃，氮气保护下，避光反应24-72h，于超纯水中透析2-3d，冷冻干燥，得聚乙烯亚胺修饰的香菇多糖，即阳离子化香菇多糖。
本发明的制备工艺简便，原料来源较为广泛，成本低廉，极具开发和应用前景，制备得到的阳离子化香菇多糖形态均一，粒径在200 nm左右，分布均匀，结构稳定，生物相容性良好，能够高效负载核酸并递送至肿瘤细胞，实现基因治疗与免疫治疗联合的抗肿瘤作用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
实施例1
本发明在具体实施中，该阳离子化香菇多糖可以是，1）将100 mg香菇多糖溶于10 mL去离子水中，边搅拌边加入150mg高碘酸钾，在25℃，氮气保护下避光反应48h，再滴入含有200μL乙二胺的5mL磷酸盐缓冲液，于1h内滴加完毕，氮气保护下避光搅拌36 h，将反应液于超纯水中透析3d，得活化的香菇多糖反应液；
2）再向活化的香菇多糖反应液中逐滴加入含有250mg聚乙烯亚胺的2mL体积浓度为3.7%的盐酸，在25℃，氮气保护下，避光搅拌72 h，于超纯水中透析2d，冷冻干燥，得聚乙烯亚胺修饰的香菇多糖，即阳离子化香菇多糖。
实施例2
本发明在具体实施中，该阳离子香菇多糖还可以是，1）将100mg香菇多糖溶于8mL二甲基亚砜中，然后加入30mg羰基二咪唑和100μL三乙胺，在26℃，氮气保护下避光搅拌4h，得活化的香菇多糖反应液；
2）再向活化的香菇多糖反应液中逐滴加入含有100mg聚乙烯亚胺的6mL二甲基亚砜（DMSO）溶液，在23℃，氮气保护下，避光搅拌24h，于超纯水中透析2d，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺修饰的香菇多糖，即阳离子化香菇多糖。
实施例3
本发明在具体实施中，该阳离子香菇多糖还可以是，1）将100 mg香菇多糖溶于10 mL二甲基亚砜中，依次加入10mg 4-二甲胺基吡啶和400mg马来酸酐，50℃下搅拌24h，再依次加入10mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和5mg N-羟基琥珀酰亚胺搅拌反应4h，得活化的香菇多糖反应液；
2）再向活化的香菇多糖反应液中加入300mg聚乙烯亚胺，氮气保护下，避光搅拌48h，于超纯水中透析2d，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺修饰的香菇多糖，即阳离子化香菇多糖。
实施例4
本发明在具体实施中，该阳离子化香菇多糖还可以是，1）将100 mg香菇多糖溶于10mL二甲亚砜中，依次加入10mg 4-二甲胺基吡啶和400mg琥珀酸酐，50℃下搅拌24h，再依次加入10mg l-乙基(3一二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和50mgN-羟基琥珀酸亚胺搅拌反应4h，得活化的香菇多糖反应液；
2）再向活化的香菇多糖反应液中加入300mg聚乙烯亚胺，氮气保护下，避光搅拌48h，将反应液于超纯水中透析3d，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺修饰的香菇多糖，即阳离子化香菇多糖。
本发明制备的阳离子化香菇多糖经多次反复实验，均能取得较好的结果，达到满意的技术效果，有关试验资料如下：
实验一：将不同质量的阳离子化香菇多糖溶于20μL去离子水中，加入2μg质粒eGFP，室温孵育30 min，进行0.7 % 琼脂糖凝胶电泳检测。实验结果显示，当加入阳离子化香菇多糖与质粒eGFP质量比为16:1时，质粒eGFP条带完全滞留在孔道中，这说明当阳离子香菇多糖可以完全负载核酸。将不同质量比的阳离子化香菇多糖与质粒eGFP复合物进行粒径和电位的检测，随着香菇多糖比例增加，复合粒径会逐渐变小，说明质粒eGFP已完全被多糖结合并形成致密的复合物。当质量比增加电位则继续增大，到一定值时电位在0左右，说明当阳离子香菇多糖通过正负电荷相互作用完全负载核酸，这与琼脂糖凝胶电泳结果相符。
实验二：肝癌细胞HepG2在含有10 %胎牛血清的培养基和37 ℃、5% CO2条件下常规培养。按照1.5×105个/孔接种于6孔板培养16 h，将FAM标记的小干扰RNA(siPD-L1)加入培养基中，转染4 h后，流式细胞仪测定摄取量，实验结果显示阳离子香菇多糖负载siPD-L1的摄取量为96.2%，实验结果表明阳离子香菇多糖能够将核酸递送至细胞内。
实验三：乳腺癌细胞MCF-7在含有10 %胎牛血清的培养基和37 ℃、5% CO2条件下常规培养，按照5×103个/孔接种于96孔板中培养16 h，将不同质量的阳离子香菇多糖加入到培养基中，培养24h后用四甲基偶氮哩盐比色法测定细胞增殖。实验结果显示，在0-640 μg/mL的范围内，随着阳离子香菇多糖含量的增加，细胞存活率略有增加，试验结果表明阳离子香菇多糖具有良好的生物相容性。
实验四：取雌性的昆明小鼠15只，每组5只随机分三组：空白对照组(NC)、香菇多糖组(LNT)、阳离子化香菇多糖组(LNT-PEI)，分别通过尾静脉注射生理盐水、香菇多糖溶液（给药量为12 mg/kg）、阳离子化香菇多糖溶液（给药量为12 mg/kg）。每2 d给药一次，共给药7次。实验过程中观察小鼠生活状态，检测小鼠体重变化。最后一次给药结束后的第二天处死小鼠，取各组小鼠脏器，以及腹腔巨噬细胞和脾细胞进行体外抗肿瘤活性考察。结果显示，与NC组相比，LNT组和LNT-PEI组小鼠的体重变化和脏器指数均没有明显差异。体外抗肿瘤活性考察结果显示，LNT组和LNT-PEI组脾细胞抑制率分别为20.74%、25.57%，巨噬细胞细胞抑制率分别为10.17%、18.12%。RT-PCR结果显示，与NC组相比LNT组和LNT-PEI组的脾脏、胸腺的IL-2、TNF-α、IFN-γ的mRNA表达量均有所增加。说明阳离子化香菇多糖保持了香菇多糖自身的免疫学活性，在体内仍可以发挥生物调节作用。
在上述实验中，所用到的细胞株，质粒，小干扰RNA为：
1、细胞株：肝癌细胞HepG2，乳腺癌细胞MCF-7，均购自中国科学院细胞库。
2、质粒：增强型绿色荧光蛋白表达质粒eGFP(GenBank登陆号X83959)，购自BD Biosciences Clontech公司。
3、小干扰RNA（siPD-L1）：
正义链，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
反义链，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
本发明阳离子化香菇多糖作为基因传递载体在肿瘤预防与治疗中的应用，还包括将阳离子化香菇多糖与抗肿瘤基因治疗药物混合后进行体外、体内抗肿瘤的生物学评价。
所述抗肿瘤基因治疗药物有：装载有治疗基因的质粒DNA、装载有治疗基因的病毒载体DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA中的一种或几种。
所述的肿瘤细胞为鼠源或人源的各种实体瘤细胞，包括乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、鼻咽癌细胞、舌癌细胞、食管癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、肾癌细胞、阴茎癌细胞、翠丸癌细胞、皮肤癌细胞、白血病细胞、恶性黑色素瘤细胞中的一种。
所述的肿瘤为人器官表面或内部出现的各种实体瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、舌癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、阴茎癌、翠丸癌、皮肤癌、白血病、恶性黑色素瘤中的一种。
由上述表明，本发明的阳离子化香菇多糖制备方法经反复多次试验均取得较为满意的技术效果。本发明通过将聚乙烯亚胺接枝到香菇多糖，作为核酸传递载体的同时保持了香菇多糖免疫活性，本发明中的阳离子香菇多糖合成原料来源广泛，制备条件容易满足，制备成本低，兼备较好的水溶性，稳定的物理以及化学性质，较强的核酸负载能力，阳离子化香菇多糖作为一种良好的基因传递载体的同时保持香菇多糖自身的免疫学活性，开辟了基因治疗与免疫治疗联合抗肿瘤新途径、新方法，具有巨大的医用价值和社会效益。