一种急性高尿酸血症动物模型的构建方法与流程

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种急性高尿酸血症动物模型的构建方法。

背景技术：

高尿酸血症是由各种因素引起的尿酸产生过多、或肾脏排出尿酸减少、或两者兼有，致使血液中尿酸盐超过正常水平(6毫克/100毫升)的病理状态。高尿酸血症是痛风最重要的生化基础，并且与心血管疾病、免疫系统紊乱等密切相关，严重危害人类健康。目前临床上用于治疗高尿酸血症的药物以抑制尿酸生成和促进尿酸排泄为主。随着分子生物技术的快速发展和人们对高尿酸血症发病机制和遗传学认识的日益加深，新的治疗靶点不断被发现，新型治疗药物也相继问世，寻找更加合理、科学的药效学评价动物模型迫在眉睫。

以美国Biocryst公司研发的新型降血尿酸药物Ulodesine为例，其降尿酸机制主要通过抑制嘌呤核甘磷酸酶(PNP)活性，进而减少次黄嘌呤及黄嘌呤在体内的积累，以达到降低血尿酸的目的。随着该药二期临床终点的到达，PNP靶点得到了广泛关注。现有的抑制尿酸生成的市售药物均以黄嘌呤氧化酶(XO)为治疗靶点，而从尿酸生成途径来看，肌苷经PNP酶与XO酶的顺序水解作用与氧化作用形成尿酸，即PNP酶位于XO酶的上游，因此通过补充嘌呤类药物(食物)建立的高血尿酸症动物模型并不适用于评价PNP酶抑制剂的降尿酸效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种急性高尿酸血症动物模型的构建方法，本发明构建的急性高尿酸血症动物模型不仅可用于评价PNP酶抑制剂的降尿酸作用，也适用于XO抑制剂降尿酸效果的评估。

本发明提供了一种急性高尿酸血症动物模型的构建方法，包括：

将肌苷给予恒河猴，获得急性高尿酸血症动物模型。

恒河猴属于灵长类动物，其尿酸排泄途径与人类相似。以恒河猴为造模动物，更适于评价药物的降尿酸效果。、

在本发明中，将肌苷腹腔给药给予恒河猴。

在本发明中，所述肌苷的给药剂量为100mg/kg。

在本发明中，所述肌苷的给药体积为2mL/kg。

本发明以肌苷作为升高血尿酸的诱导剂，将其给予恒河猴建立高尿酸血症的动物模型，用于降尿酸药效评估。实验结果表明，本发明提供的方法能够建立急性高尿酸血症动物模型，而且重现性较好；本发明构建的急性高尿酸血症动物模型不仅可用于评价PNP酶抑制剂的降尿酸作用，也适用于XO抑制剂降尿酸效果的评估。另外，本发明提供的构建方法较为简单，只需对恒河猴腹腔注射肌苷即可，无需联用其他药物。

附图说明

图1为肌苷不同造模剂量、不同采血点对恒河猴尿酸水平的影响；

图2为造模不同时间点血清尿酸值升高百分比对比；

图3为Ulodesine及Febuxostat对恒河猴尿酸水平的影响；

图4为药物组、模型组、空白对照组对恒河猴尿酸水平的影响对比；

图5为小鼠单用肌苷，肌苷与氧嗪酸钾联用造模结果。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的急性高尿酸血症动物模型的构建方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.实验试剂

尿酸(UA)测定试剂盒：50T/48样，批号：20160701，南京建成生物工程研究所；氯化钠注射液：250ml，2.25g，批号：A140829G2，昆明南疆制药有限公司。肌苷(Inosine)：14125-10G，Lot#019K1124V，CAS：58-63-9，Sigma。

2.实验动物

雄性恒河猴，体重6-8kg，生产许可证号：SCXK(滇)2011-0005，使用许可证号：SYXK(滇)K2014-007。

3.实验仪器

SYNERGY/HT多功能酶标仪，BioTek；MiniSpin离心机，eppendorf；NewClassic MF MS105分析天平，METTLER TOLEDO。

4.实验方法

4只恒河猴分为4组：造模组和生理盐水对照组。造模组腹腔给与不同剂量的肌苷溶液造模。高剂量组(100mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)、低剂量组(25mg/kg)、生理盐水对照组，给药体积为2ml/kg。生理盐水给以相同的给药体积。在不同时间点取血约2ml，对比不同时间点血清尿酸值，时间点设置为：0h(即造模前取空白对照血液)、造模后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h。血样室温静置30min后，4000r/min离心10min，取血清立即冻存于-80摄氏度冰箱，待所有时间点取血清完成后按试剂盒方法(磷钨酸法)测定尿酸值。

5.实验结果

计算每个时间点血清尿酸值升高百分比。尿酸升高率(％)＝(不同时间点UA(umol/L)-空白时间点UA(umol/L))/不同时间点UA(umol/L)*100％。实验结果见表1，图1，表1为不同肌苷造模剂量、采血点对恒河猴尿酸水平的影响，图1为肌苷不同造模剂量、不同采血点对恒河猴尿酸水平的影响。

表1不同肌苷造模剂量、采血点对恒河猴尿酸水平的影响

如表1，图1可见，生理盐水组血尿酸值趋于平稳，造模组血尿酸值与肌苷剂量有剂量依赖性，肌苷在100mg/kg剂量上，0.5h时动物血清尿酸显著高于造模前，血尿酸值提高了271.43％，提示在该浓度下模型造模成功。

实施例2

时间间隔两周之后，用实施例1实验组所用4只恒河猴，新增2只雄性恒河猴，6只造模型，采用自身血尿酸值对照。肌苷剂量为(100mg/kg)，腹腔注射，给药体积为2ml/kg。在不同时间点取血约2ml，对比不同时间点血尿酸值，时间点设置为：0h(即造模前取空白对照血液)、造模后0.5h、1h、2h、4h、8h。血样室温静置30min后，4000r/min离心10min，取血清立即冻存于-80摄氏度冰箱，待所有时间点取血清完成后按试剂盒方法(磷钨酸法)测定尿酸值。结果见表2、图2，表2为造模不同时间点血清尿酸值升高百分比对比，图2为造模不同时间点血清尿酸值升高百分比对比。

表2造模不同时间点血清尿酸值升高百分比对比

由表2、图2可见，模型后动物血清尿酸水平显著高于空白，提示造模成功。

由实施例1和实施例2可知，肌苷造模可以得到重现性良好的急性高尿酸血症模型。

实施例3

雄性恒河猴6只分为两个药物组。3只为Ulodesine组，3只为Febuxostat组。在造模前1h给予药物，Ulodesine剂量为2mg/kg(相当于临床人用剂量)，Febuxostat剂量为2mg/kg(相当于临床人用剂量)，腹腔注射，给药体积为2ml/kg。造模剂肌苷剂量为(100mg/kg)，腹腔注射，给药体积为2ml/kg。在不同时间点取血约2ml，对比不同时间点血尿酸值，时间点设置为：0h(即给药前取空白对照血液)、给药后0.5h、造模后0.5h、1h、2h、4h、8h、以及给药后24h。血样室温静置30min后，4000r/min离心10min，取血清立即冻存于-80摄氏度冰箱，待所有时间点取血清完成后按试剂盒方法(磷钨酸法)测定尿酸值。结果见表3，图3和图4，表3为给药以后不同时间点恒河猴血清尿酸值升高百分比，图3为Ulodesine及Febuxostat对恒河猴尿酸水平的影响，图4为药物组、模型组、空白对照组对恒河猴尿酸水平的影响对比。

表3给药以后不同时间点恒河猴血清尿酸值升高百分比(％)

由表3、图3和图4可知，本发明提供的急性高尿酸血症动物模型不仅可用于评价PNP酶抑制剂的降尿酸作用，也适用于XO抑制剂降尿酸效果的评估。

对比例1

1.实验试剂

尿酸(UA)测定试剂盒：50T/48样，批号：20151019，南京建成生物工程研究所；氧嗪酸钾：S17112-5g，CAS#2207-75-2，LOT：BJ0909DA14，源叶生物；肌苷(Inosine)：14125-10G，Lot#019K1124V，CAS：58-63-9，Sigma。

2.实验动物

雄性SPF级ICR小鼠，体重26～38g，生产许可证号：SCXK(滇)K2014-0001，使用许可证号：SYXK(滇)K2014-0001。

3.实验仪器

PowerWave XS2全波长酶标仪，BioTek；MiniSpin离心机，eppendorf；AdventurerTM天平，奥豪斯仪器上海有限公司。

4.实验方法

40只雄性小鼠分为5组：模型组(肌苷(100mg/kg、200mg/kg)，肌苷(100mg/kg、200mg/kg)联合氧嗪酸钾(200mg/kg)(每组8只))、空白组(8只)，单独肌苷组按10ml/kg体重腹腔注射肌苷，联合给药造模组各组均按10ml/kg体重腹腔注射肌苷联合皮下注射氧嗪酸钾造模，空白组给予等体积氯化钠注射液。所有组分别于造模后不同时间点摘眼球采血，室温静置30min后，4000r/min离心10min，取血清按试剂盒方法(磷钨酸法)测定尿酸值，为减小系统误差，试验采用平行操作。

5.实验结果

计算每个实验组血清尿酸值升高百分比。尿酸升高率(％)＝(不同组别UA(mg/L)-空白组UA(mg/L))/不同组别UA(mg/L)*100％。结果参见见表4和图5，表4为小鼠单用肌苷，肌苷与氧嗪酸钾联用造模结果，图5为小鼠单用肌苷，肌苷与氧嗪酸钾联用造模结果。

表4小鼠单用肌苷，肌苷与氧嗪酸钾联用造模

^##(P<0.01)具有非常显著性差异

由表4和图5可知，单用肌苷腹腔给药小鼠造模，小鼠尿酸值升高率低，证明单独给与肌苷不能造成小鼠急性高尿酸血症，肌苷联用氧嗪酸钾，小鼠血清尿酸值显著升高，造模成功。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。