本发明属于废弃资源再生利用的技术领域，特别涉及五味子药渣废弃资源再生利用，具体涉及利用五味子药渣回收获得高纯度五味子木脂素及其残渣酵母菌固态发酵联产高蛋白饲料的技术。
背景技术：
五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，习称“北五味子”，具有丰富的药用、食用价值，是临床配伍饮片和五味子相关制剂生产的重要原料之一。五味子药渣的产生主要源于五味子提取物、制剂、配方颗粒以及五味子其他资源性产品的制造过程。这些废弃物主要被丢弃和作为垃圾焚烧，不仅对环境造成了严重的污染，也浪费了珍贵的资源。而现代有关五味子制剂的提取工艺多以水提醇沉工艺为主，所以五味子固态废弃物中尚富含木脂素类、蛋白质类、糖类以及纤维类等可利用物质，具有很高的利用价值，值得进一步开发利用和资源化。因此，对五味子药渣进行资源再利用和系统回收利用具有重要的生态意义和经济意义。
目前，已有研究学者发现可以用中药渣培养食用菌、用中药渣发酵制肥料、用中药渣固态发酵生产蛋白饲料以及用中药渣造纸和制备絮凝剂等。通过各种生物技术将这些中药废弃物资源进行处理、变废为宝已逐渐成为一条可行的路径，其中使用中药渣固态发酵生产饲料，不但可以缓解环境污染，也能减少资源浪费，尤其是药渣中活性功效成分，使动物饲料具备防病、抗病和提高动物免疫力的作用，成为新一代动物保健品饲料。
发酵工艺过程往往涉及到微生物细胞的生长繁殖、产物的合成以及与之紧密关联的各种酶所催化的生化反应，微生物的形态和生理习性、种群行为都受发酵工艺条件的影响。对与发酵相关的生物学因素以及培养条件进行优化，可以找到一条最优的发酵工艺，同时也节省了发酵成本。
利用微生物将中药渣发酵成为动物营养饲料，以及鱼、虾等海洋生物的饲料添加剂，是目前流行的资源化利用途径。因五味子药渣中含有大量蛋白、多糖等可利用营养成分，而发酵之后药渣中蛋白、多糖含量大幅提高，因此可以使用五味子药渣固态发酵生产肉鸡、仔猪等动物的蛋白饲料，还可以把五味子药渣发酵培养物添加到鱼、海虾等海洋生物的营养饲料中，不但可以缓解环境污染，也能减少资源浪费，动物饲料、海洋生物饲料也具备防病、抗病和提高动物免疫力的作用，这对环境保护和五味子残渣的循环利用有着重大现实意义。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是针对目前五味子药渣这种可再生利用资源处理存在的浪费和环境污染问题，提供一种利用五味子药渣联产高纯度五味子木脂素和固态发酵五味子残渣获得高蛋白饲料的方法，该方法能有效的实现五味子药渣的循环利用和系统利用，节约资源，减少环境污染。所提取回收的高纯度五味子木脂素可以做为提高免疫力、保肝作用的保健食品或饲料添加剂的原料；醇提取后的五味子残渣通过酵母菌固态发酵法发酵制备的高蛋白含量的蛋白饲料，适口性好，并有利于动物防病、提高机体免疫力的作用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种利用五味子药渣联产木脂素和蛋白饲料的方法，先从五味子药渣中回收获得高纯度五味子木脂素，其残渣再通过酵母菌固态发酵联产高蛋白饲料。能有效的系统利用废弃五味子药渣，减少环境污染，实现资源化最大利用和循环利用。
作为优选方案，以上用五味子药渣联产木脂素和蛋白饲料的方法包括以下步骤：
(1)将采用水提取后的五味子药渣干燥、粉碎为颗粒；
(2)将五味子药渣颗粒放入提取罐中，加入药渣重量的8～16倍的60％～90％体积浓度的乙醇，回流提取1～3次，每次60～120min，获得乙醇提取液；
(3)将乙醇提取液进行浓缩，浓缩至重量体积比3：1～1：1，获得浓缩液；
(4)将浓缩液上大孔吸附树脂柱，采用的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩获得五味子总木脂素提取物；
(5)将经步骤(2)乙醇提取木脂素后的五味子残渣进行干燥，备用；
(6)培养基制备：制备的培养基包括平板培养基、豆汁培养基、固态发酵培养基；
(7)固态发酵：将热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)在平板培养基上培养12～36h，待酵母菌长出后，用接种环接种酵母菌于配好的土豆汁培养基中制成菌体悬液，然后置于摇床中8～12h后，取一定量的菌体混悬液于另一土豆汁培养基中，置于摇床中12～20h；然后按8％～12％的接种量将酵母菌接种于固态发酵培养基中，然后在恒温培养箱中培养3d～7d，发酵完成；
(8)将发酵完成的物料进行干燥，即得固态蛋白饲料。
作为优选方案，以上提供的利用五味子药渣制备中高纯度木脂素的优选方法为：将五味子药渣颗粒(40目)放入提取罐中，加入药渣重量的10倍的90％乙醇，回流提取2次，每次120min，获得乙醇提取液；
乙醇提取液进行减压浓缩，浓缩至重量体积比2：1，获得浓缩液；
将浓缩液上D101大孔吸附树脂柱，采用95％的乙醇进行洗脱3倍柱体积的洗脱液，获得纯度为40.8％的五味子总木脂素提取物，其中五味子甲素5.8％、五味子乙素11.9％、五味子丙素3.6％、五味子醇甲12.8％、五味子醇乙6.7％。
作为优选方案，本发明所述经醇提取后的五味子残渣再通过酵母菌固态发酵联产高蛋白饲料的方法，
培养基的制备：包括平板培养基、豆汁培养基、固态发酵培养基。
a.平板培养基：在1.0L的纯水中加入10g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母提取物以及20g的琼脂。在121℃高压灭菌锅中灭菌30min，用于热带假丝酵母菌的平板培养。
b.豆汁培养基：取200mg土豆，加入1.8mL左右的纯水，加热煮沸制成1.0L的土豆汁，放入20.0g葡萄糖，分装在250mL的敞口锥形瓶中，于120℃高压灭菌锅中灭菌30min，用于热带假丝酵母菌的液体培养。
c.固态发酵培养基：原料按重量份计包括：五味子残渣80～100份、硫酸铵3～10份、磷酸二氢钾0.5～1份、硫酸镁0.3～1.5份、氯化钠0.5～1.5份、氯化钙0.1～0.5份、麦麸10～50份，料液质量比为1:1～1:3。于120℃高压灭菌锅中灭菌30min，冷却后加入10～30倍残渣的纤维素酶(紫外灭菌)搅拌。
作为更加优选方案，本发明提供的固态发酵培养基制备方法为：五味子残渣100g，过40目筛，然后依次加入4g硫酸铵，0.5g磷酸二氢钾，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钠、0.1g氯化钙和20g麦麸，料液质量比为1:2。于120℃高压灭菌锅中灭菌30min，冷却后加入3000mg纤维素酶(紫外灭菌)搅拌。
作为优选方案，本发明提供的固态发酵工艺方法为：将热带假丝酵母菌在平板培养基上培养24h，待酵母菌长出后，用接种环接种2环酵母菌于配好的50mL土豆汁培养基中制成菌体悬液，置于摇床中10h后，取2mL的菌体混悬液于另一50mL土豆汁培养基中，置于摇床中16h。于固态发酵培养基中加入接种量为10％的酵母菌，然后在温度为30℃的恒温培养箱中培养5d。
有益效果：本发明具有以下优点：
本发明提供的一种利用五味子药渣联产木脂素和蛋白饲料的方法，先从五味子药渣中回收获得高纯度五味子木脂素，其残渣再通过酵母菌固态发酵联产高蛋白饲料。本发明能有效的系统利用废弃五味子药渣，减少环境污染，实现资源化最大利用和循环利用。所述的高纯度木脂素是一类重要的天然有效活性成分，具有显著降低血清中ALT、AST水平，减缓肝细胞变性坏死，明显减轻由缺血再灌注导致的心肌损伤，以及镇静、镇痛、保护脑神经等多种功效。可用于急慢性肝炎病人、缺血性心脏疾病病人的保健、防治作用。所述联产的一种五味子蛋白饲料具有蛋白质含量高，脂肪含量高，营养丰富，适口性好的优点，并有利于动物防病、提高机体免疫力的作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例1
一种利用五味子药渣联产木脂素和蛋白饲料的方法，所述的方法通过以下步骤实现：
(1)将五味子药渣用粉碎机粉碎并过筛至20目。
(2)将五味子药渣颗粒放入提取罐中，加入药渣重量的8倍的70％乙醇，回流提取3次，每次90min，获得乙醇提取液；乙醇提取液进行减压浓缩，浓缩至重量体积比1：1，获得浓缩液；将浓缩液上AB-8大孔吸附树脂柱，采用80％乙醇进行洗脱5倍柱体积的洗脱液，获得纯度为36.6％的五味子总木脂素提取物，其中五味子甲素5.6％、五味子乙素10.1％、五味子丙素3.4％、五味子醇甲11.3％、五味子醇乙6.2％。
(3)本发明所述经醇提取后的五味子残渣再通过酵母菌固态发酵联产高蛋白饲料的方法，包括以下步骤：
①培养基的制备：包括平板培养基、豆汁培养基、固态发酵培养基。
a.平板培养基：在1.0L的纯水中加入10g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母提取物以及20g的琼脂。在121℃高压灭菌锅中灭菌30min，用于热带假丝酵母菌的平板培养。
b.豆汁培养基：取200mg土豆，加入1.8mL左右的纯水，加热煮沸制成1.0L的土豆汁，放入20.0g葡萄糖，分装在250mL的敞口锥形瓶中，于120℃高压灭菌锅中灭菌30min，用于热带假丝酵母菌的液体培养。
c.固态发酵培养基：五味子残渣80g，过40目筛，然后依次加入4g硫酸铵，0.5g磷酸二氢钾，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钠、0.1g氯化钙和20g麦麸，料液质量比为1:3。于120℃高压灭菌锅中灭菌30min，冷却后加入2500mg纤维素酶(紫外灭菌)搅拌。
②固态发酵过程：将热带假丝酵母菌在平板培养基上培养20h，待酵母菌长出后，用接种环接种2环酵母菌于配好的50mL土豆汁培养基中制成菌体悬液，置于摇床中8h后，取2mL的菌体混悬液于另一50mL土豆汁培养基中，置于摇床中12h。于固态发酵培养基中加入接种量为8％的酵母菌，然后在温度为30℃的恒温培养箱中培养3d。
③将发酵完成的物料进行干燥，即得固态蛋白饲料。其中总蛋白含量20.4％、还原糖含量9.2％、淀粉含量8.2％。
实施例2
一种利用五味子药渣联产木脂素和蛋白饲料的方法，其特征是，所述的方法通过以下步骤实现：
(1)将五味子药渣用粉碎机粉碎并过筛至40目。
(2)将五味子药渣颗粒放入提取罐中，加入药渣重量的10倍的90％乙醇，回流提取2次，每次120min，获得乙醇提取液；乙醇提取液进行减压浓缩，浓缩至重量体积比2：1，获得浓缩液；将浓缩液上D101大孔吸附树脂柱，采用95％的乙醇进行洗脱3倍柱体积的洗脱液，获得纯度位40.8％的五味子总木脂素提取物，其中五味子甲素5.8％、五味子乙素11.9％、五味子丙素3.6％、五味子醇甲12.8％、五味子醇乙6.7％。
(3)本发明所述经醇提取后的五味子残渣再通过酵母菌固态发酵联产高蛋白饲料的方法，包括以下步骤：
①培养基的制备：包括平板培养基、豆汁培养基、固态发酵培养基。
a.平板培养基：在1.0L的纯水中加入10g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母提取物以及20g的琼脂。在121℃高压灭菌锅中灭菌30min，用于热带假丝酵母菌的平板培养。
b.豆汁培养基：取200mg土豆，加入1.8mL左右的纯水，加热煮沸制成1.0L的土豆汁，放入20.0g葡萄糖，分装在250mL的敞口锥形瓶中，于120℃高压灭菌锅中灭菌30min，用于热带假丝酵母菌的液体培养。
c.固态发酵培养基：五味子残渣100g，过40目筛，然后依次加入4g硫酸铵，0.5g磷酸二氢钾，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钠、0.1g氯化钙和20g麦麸，料液质量比为1:2。于120℃高压灭菌锅中灭菌30min，冷却后加入3000mg纤维素酶(紫外灭菌)搅拌。
②固态发酵过程：将热带假丝酵母菌在平板培养基上培养24h，待酵母菌长出后，用接种环接种2环酵母菌于配好的50mL土豆汁培养基中制成菌体悬液，置于摇床中10h后，取2mL的菌体混悬液于另一50mL土豆汁培养基中，置于摇床中16h。于固态发酵培养基中加入接种量为10％的酵母菌，然后在温度为30℃的恒温培养箱中培养5d。
③将发酵完成的物料进行干燥，即得固态蛋白饲料。其中总蛋白含量25.2％、还原糖含量11.3％、淀粉含量10.6％。
实施例3
一种利用五味子药渣联产木脂素和蛋白饲料的方法，其特征是，所述的方法通过以下步骤实现：
(1)将五味子药渣用粉碎机粉碎并过筛至40目。
(2)将五味子药渣颗粒放入提取罐中，加入药渣重量的12倍的80％乙醇，回流提取2次，每次100min，获得乙醇提取液；乙醇提取液进行减压浓缩，浓缩至重量体积比3：1，获得浓缩液；将浓缩液上D101大孔吸附树脂柱，采用70％乙醇进行洗脱3倍柱体积的洗脱液，获得纯度为39.7％的五味子总木脂素提取物，其中五味子甲素5.6％、五味子乙素11.1％、五味子丙素4.4％、五味子醇甲12.7％、五味子醇乙5.9％。
(3)本发明所述经醇提取后的五味子残渣再通过酵母菌固态发酵联产高蛋白饲料的方法，包括以下步骤：
①培养基的制备：包括平板培养基、豆汁培养基、固态发酵培养基。
a.平板培养基：在1.0L的纯水中加入10g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母提取物以及20g的琼脂。在121℃高压灭菌锅中灭菌30min，用于热带假丝酵母菌的平板培养。
b.豆汁培养基：取200mg土豆，加入1.8mL左右的纯水，加热煮沸制成1.0L的土豆汁，放入20.0g葡萄糖，分装在250mL的敞口锥形瓶中，于120℃高压灭菌锅中灭菌30min，用于热带假丝酵母菌的液体培养。
c.固态发酵培养基：五味子残渣80g，过40目筛，然后依次加入4g硫酸铵，0.5g磷酸二氢钾，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钠、0.1g氯化钙和20g麦麸，料液质量比为1:3。于120℃高压灭菌锅中灭菌30min，冷却后加入2500mg纤维素酶(紫外灭菌)搅拌。
②固态发酵过程：将热带假丝酵母菌在平板培养基上培养36h，待酵母菌长出后，用接种环接种2环酵母菌于配好的50mL土豆汁培养基中制成菌体悬液，置于摇床中12h后，取2mL的菌体混悬液于另一50mL土豆汁培养基中，置于摇床中10h。于固态发酵培养基中加入接种量为9％的酵母菌，然后在温度为30℃的恒温培养箱中培养5d。
③将发酵完成的物料进行干燥，即得固态蛋白饲料。其中总蛋白含量21.3％、还原糖含量12.1％、淀粉含量9.3％。
实施例4防肝损伤药理实验
一、实验材料与药物
1.药物和试剂
AST，ALT，MDA，SOD试剂盒及考马斯亮蓝蛋白试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；四氯化碳(CCl4，分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司)，使用时用花生油配制成0.1％的花生油溶液；联苯双酯片(江苏鹏鹞药业有限公司)，临用时碾成细粉加生理盐水制成混悬液。
2.实验动物
清洁级雄性ICR小鼠，体重18～22g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号SCXK(浙)2008-0033。
3.实验仪器
酶联免疫仪(美国Bio-Tek公司)；UV-2000型紫外分光光度计(北京莱柏泰科仪器有限公司)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；Anke GL-16GII型离心机(上海安亭科学仪器厂)。
4.受试药物及处理方法
分别取实施例1～3制备得到的五味子总木脂素，加水稀释制成所需浓度；阳性药为联苯双酯，给药前以蒸馏水溶解配制成所需浓度。
二、实验方法
1.对CCl4致小鼠急性肝损伤的影响
取60只小鼠，适应性喂养1周后，按体重随机分成6组，每组10只，分别为正常对照组，CCl4至肝损伤模型组，实施例1,2和3制备得到的五味子总木脂素组(0.25g/kg/d)，联苯双酯组(120mg/kg/d)。对照组及模型组给予同量的生理盐水，给药组连续灌胃10d，于末次给药后1h，除正常组ip 0.9％NaCl 10mL/kg外，其余各组均ip 0.1％CCl4花生油溶液10mL/kg。16h后，所有小鼠采用眼眶后静脉丛采血，分离血清，测定血清中ALT及AST的活性。取血后处死小鼠，随即取部分肝脏，用生理盐水制备成10％的肝匀浆，按照试剂盒说明测定MDA含量及SOD活力。
2.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS11.5统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间比较采用方差分析。
三、实验结果
1.五味子总木脂素对CCl4致小鼠急性肝损伤的影响
CCl4肝损伤模型组与正常组比较，小鼠血清ALT、AST和肝组织MDA水平明显升高(P<0.01)，SOD活性明显降低(P<0.01)；实施例1,2和3制备得到的五味子总木脂素组、联苯双酯组与模型组比较均不同程度地使肝损伤小鼠血清ALT、AST降低(P<0.01)；五味子总木脂素组和联苯双酯组与模型组比较均不同程度地使肝损伤小鼠肝组织MDA水平降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)。具体实验结果见表1。
表1各组对CCl4致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST及肝脏SOD、MDA的影响(mean±SD，n＝10)
注：与模型组比较，##P<0.01,#P<0.05。
实施例5心肌损伤药理实验
一、实验材料与药物
1.药物和试剂
MDA，SOD，NO试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
2.实验动物
健康雄性SD大鼠，体重222～240g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号SCXK(浙)2008-0033。
3.受试药物及处理方法
分别取实施例1～3制备得到的五味子总木脂素，稀释制成所需浓度；阳性药为联苯双酯，给药前溶解配制成所需浓度。
二、实验方法
1.心肌缺血再灌注损伤模型的建立及取材
各组动物术前禁食24小时,20％乌拉坦(1g.kg-1)腹腔麻醉，气管插管，连呼吸机，机械通气；描记肢导心电图；胸骨左缘2mm处开胸，剪开心包，暴露冠脉，在左前降支起点后0.5cm穿一丝线，垫一硅胶管，血压稳定时结扎，关闭胸腔。结扎45分钟后经尾静脉注入治疗药物及溶液，治疗药物组按10g.Kg-1(按人和动物体重比例计算,为临床剂量的5倍)，用生理盐水稀释到3.0ml，再灌注前静脉注入，其余两组以等量生理盐水注入。然后打开胸腔，剪去结扎线，假手术组置线后不予结扎，冠脉断流及再通与否依心电图ST段抬高及恢复为准。再灌注1小时后，取部分左室标本处理后做SOD、MDA、NO指标的检测。
2.对缺血再灌注损伤大鼠T波变化的幅度和心律失常发生率的影响
记录大鼠结扎前5分钟和结扎后1,10,20分钟以及再灌后1,5,30分钟,3小时的心电图(LII)，计算T波抬高和降低的mV数，以其绝对值按1mv＝20mm对T波变化的幅度进行比较。同时对心律失常总发生率包括心动过速、心室纤维性颤动和T波改变超过1mm的发生率进行统计。
3.对心肌缺血再灌注组织中MDA,SOD和NO生成的影响
大鼠心脏制备心肌匀浆上清液，然后按试剂盒操作说明，分别测定心肌中MDA,SOD和NO含量。
三、实验结果
1.对缺血再灌注损伤大鼠心电图T波变化的幅度和心律失常的发生率的影响,大鼠冠状动脉左前降支结扎45分钟后再灌1小时，可以引起大鼠的心肌缺血再灌注损伤，表现心电图的T波发生改变，心律失常发生率明显升高；五味子总木脂素可显著抑制再灌后大鼠心电图T波变化的幅度和心律失常的发生率。
2.对大鼠缺血再灌注心肌组织中MDA，SOD和NO生成的影响
模型组MDA及NO含量明显高于假手术组，SOD的活力显著降低，与假手术组比较有显著差异(P<0.01)。与模型组比较，实施例1～3制备得到的五味子总木脂素组能减少心肌中MDA的生成，有统计学意义(P<0.05)；能明显提高再灌注组织中SOD的活力，差异非常显著(P<0.01)。能抑制NO的生成(P<0.05)，见表2。
表2大鼠心肌组织MDA含量SOD活性及NO含量的变化
注：与模型组比较，##P<0.01,#P<0.05。
实施例6
按本发明实施例1,2和3方法制备得到的固态蛋白饲料，添加到饲料中分别喂养仔猪各50头，3组仔猪每月增重分别为14公斤、15公斤和15公斤，未出现病态。本发明制备得到的五味子蛋白饲料具有蛋白质含量高，脂肪含量高，营养丰富，适口性好的优点，并有利于动物防病、提高机体免疫力的作用。
本发明提供的一种利用五味子药渣联产木脂素和蛋白饲料的方法，所获得的得高纯度木脂素具有显著降低保肝、镇静、镇痛、保护脑神经等多种功效。可用于急慢性肝炎病人、缺血性心脏疾病病人的保健、防治作用。所获得的五味子蛋白饲料具有蛋白质含量高，营养丰富，适口性好，并有利于动物防病、提高机体免疫力的作用。同时五味子药渣的系统利用和循环利用有利于节约资源、降低成本、保护环境。