升麻提取物和两种升麻酮碱及制备方法与用途与流程

本发明属医药
技术领域：
，具体涉及一种以升麻属植物为原料制备的升麻提取物及两种新升麻酮碱的方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：升麻属(Cimicifuga)植物为多年生草本，常生于海拔2000米左右的山地林缘、林中或路旁草丛中，主要分布于北美洲、亚洲和欧洲北温带地区。其中升麻在我国是著名的常用中药，黑升麻(C.racemosa，blackcohosh)是被欧美社会高度认知的保健药品和膳食补充剂。《中国药典》2015版一部规定升麻CimicifugaRhizome为升麻C.foetida、兴安升麻C.dahurica、大三叶升麻C.heracleifolia的干燥根茎。关于升麻的最早的记载来自公元前25-220年左右的《神农本草经》，并被列为“上品”药材。升麻地下根茎入药，其功效为主解百毒，辟瘟疾瘴邪毒蛊和升阳举陷。临床上主要用于治疗风热表征、风热头痛，齿痛，口疮，咽喉肿痛，麻疹不透，阳毒发斑；脱肛，子宫脱垂等病症。前期研究发现，升麻属植物中含有cycloartane型三萜、3-异戊二烯基吲哚等物质，但目前尚未发现高度不饱和共轭体系的3-异戊二烯基吲哚二聚体类生物碱(升麻酮碱)，更未见升麻属植物中该类生物碱的抗肿瘤细胞毒活性报道。技术实现要素：本发明的目的是提供具有抗肿瘤活性的一种升麻提取物，通过以下步骤实现：将升麻属植物根茎切成薄片，干燥粉碎后按药材/溶剂(重量/体积比)加入8-12倍量有机溶剂，室温浸提或回流提取2-3次。合并提取液，减压浓缩得浸膏，用适量水将此浸膏混悬溶解，用中低极性有机溶剂等体积萃取，回收溶剂得到浸膏。浸膏上大孔树脂柱，收集70-95％洗脱部分，干燥得到升麻提取物。该提取物中主要含有双聚吲哚类生物碱单体，即两种升麻酮碱，分别为升麻酮碱甲CimicifoetoneA(化合物1)和升麻酮碱乙CimicifoetoneB(化合物2)，通过以下步骤获得：将升麻提取物再经过硅胶色谱、SephadexLH-20柱纯化得到两个部分，然后分别用有机溶剂结晶得到升麻酮碱甲和乙的纯品。提取、结晶所用的有机溶剂包括甲醇、乙醇、含水醇以及乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等常见中低极性有机溶剂系统。萃取所用的中低极性有机溶剂包括石油醚、己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷。大孔树脂柱包括D101、AB-8等常见型号树脂材料。所述的升麻属植物，包括升麻C.foetida、兴安升麻C.dahurica、大三叶升麻C.heracleifoli、北美黑升麻C.racemosa、单穗升麻C.simplex、云南升麻C.yunnanensis、短果升麻C.brachycarpa、南川升麻C.nanchuanensis、小升麻C.acerina等升麻属植物。两种升麻酮碱的结构实体为：化合物(1)：升麻酮碱甲CimicifoetoneA，结构如下：化合物(2)：升麻酮碱乙CimicifoetoneB，结构如下：通过多种波谱技术测试了升麻酮碱甲和乙的性质，包括UV、IR、MS及NMR(1D及2DNMR)以及X-射线单晶衍射，在对波谱信息进行详细的解析后确证结构为含有高度不饱和共轭体系的二聚3-异戊二烯基吲哚类生物碱，经文献检索发现为新化合物。本发明的另一个目的是提供所述的升麻提取物及升麻酮碱甲(化合物1)和升麻酮碱乙(化合物2)在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤涉及由人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系MKN7、GSU、人黑色素瘤细胞系A375、人肺腺癌细胞系NCI-H1975、人结肠癌细胞系Colo-205和人白血病细胞系HL-60引起的肿瘤。本研究选取了人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系MKN7、GSU、人黑色素瘤细胞系A375、人肺腺癌细胞系NCI-H1975、人结肠癌细胞系Colo-205和人白血病细胞系HL-60这七株肿瘤细胞系对升麻提取物、升麻酮碱甲和升麻酮碱乙的抗肿瘤活性进行了研究。结果显示，升麻提取物、升麻酮碱甲和升麻酮碱乙能有效抑制人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系MKN7、GSU、人黑色素瘤细胞系A375、人肺腺癌细胞系NCI-H1975、人结肠癌细胞系Colo-205和人白血病细胞系HL-60这七株肿瘤细胞系的增值生长，其半数致死量在1.36-21.09μM的浓度范围。尤其是升麻酮碱乙在1.36+0.09μM的浓度下就能使人白血病细胞HL-60达到半数致死。进一步研究发现，升麻酮碱乙可以通过促进细胞凋亡来抑制人白血病HL-60细胞的增殖。从其促凋亡机制的研究结果看，抑制细胞凋亡的Bcl-2,Bax,Bcl-xL蛋白表达下调；促细胞凋亡的细胞色素C的释放增多，活化的caspase-3,caspase-8,caspase-9蛋白的表达量增加，线粒体膜电位(MMP)下降，DNA修复酶(PARP)裂解增多。所以升麻酮碱乙的促凋亡作用机制与线粒体内源性和死亡受体通路有关。这些发现表明升麻酮碱具有治疗肿瘤的作用。本发明提供了具有抗肿瘤活性的一种升麻提取物以及两种双吲哚类生物碱新化合物升麻酮碱甲(1)和乙(2)的结构、制备方法及其用途。本发明以升麻属植物为原料，用有机溶剂提取后，经溶剂萃取或色谱分离，可得到含有升麻酮碱甲(1)和乙(2)的提取物及纯品。本提取分离方法的优势在于，避开了升麻酮碱显色不明显以及用传统酸碱萃取法难以富集得到含量较高提取物的劣势，直接采用树脂和凝胶等分离材料得到高含量的有效部位提取物以及升麻酮碱单体纯品化合物。该提取物及升麻酮碱甲和升麻酮碱乙能有效抑制人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系MKN7、GSU、人黑色素瘤细胞系A375、人肺腺癌细胞系NCI-H1975、人结肠癌细胞系Colo-205和人白血病细胞系HL-60等株肿瘤细胞系的增殖生长，其中升麻酮碱甲(1)和乙(2)的半数致死量在1.36-21.09μM的浓度范围。本发明开发了升麻属植物中双聚吲哚类生物碱(升麻酮碱)的抗肿瘤用涂，拓展了升麻属植物药物作用，为推广利用中药材提供依据，提供新的抗肿瘤药物。附图说明图1是升麻酮碱甲的1HNMR谱(600MHzind6-DMSO)。图2是升麻酮碱甲的13CNMR谱(150MHzind6-DMSO)。图3是升麻酮碱甲的HMBC谱(600MHzind6-DMSO)。图4是升麻酮碱甲的X-射线单晶衍射图。图5是升麻酮碱甲的IR谱。图6是升麻酮碱甲的质谱。图7是升麻酮碱乙的1HNMR谱(600MHzind6-acetone)。图8是升麻酮碱乙的13CNMR谱(150MHzind6-acetone)。图9是升麻酮碱乙的HMBC谱。图10是升麻酮碱乙的IR谱。图11是升麻酮碱乙的质谱。具体实施方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1干燥的云南升麻根茎10kg，打粉，用80L的95％乙醇溶液室温浸提两次，每次5天。合并提取液，蒸至无醇味得总浸膏1000g。总浸膏用2L的水分散，先后分别用石油醚、乙酸乙酯等体积萃取，得到石乙酸乙酯萃取部分CRE(530g)。乙酸乙酯萃取部位经大孔树脂(D101)色谱柱(30％～95％)乙醇梯度洗脱，收集85％-95％洗脱部分，干燥得到升麻提取物20g。实施例2干燥的升麻根茎5kg，打粉，用50L的乙酸乙酯溶液室温浸提两次，每次3天。合并提取液，蒸至无醇味得总浸膏200g。总浸膏用2L的水分散，先后分别用石油醚、乙酸乙酯等体积萃取，得到石乙酸乙酯萃取部分CRE(100g)。乙酸乙酯萃取部位经大孔树脂(D101)色谱柱(30％～95％)乙醇梯度洗脱，收集80％-95％洗脱部分，得到升麻提取物。进一步经SephadexLH-20柱色谱分离，以二氯甲烷/甲醇为流动相，分离得到两个部分，分别在甲醇中结晶得到化合物1(15mg)和化合物2(17mg)。实施例3干燥的北美黑升麻根茎5kg，粉碎后加入40L甲醇，回流提取二次，第一次2小时，提取液过滤后补加40L甲醇继续回流提取1小时。合并两次提取液后减压浓缩得浸膏，用3L水将此浸膏混悬溶解，先后用二氯甲烷等体积萃取，得到浸膏420g。经大孔树脂(AB-8)色谱柱(30％～95％)乙醇梯度洗脱，收集75％-95％洗脱部分。进一步经SephadexLH-20柱色谱分离，以二氯甲烷/甲醇为流动相，分离得到两个部分，分别在二氯甲烷中结晶得到化合物1(45mg)和化合物2(52mg)。实施例4化合物1的中试制备干燥的兴安升麻根茎100kg，粉碎后加入1000L95％乙醇，回流提取二次，第一次3小时，第二次2小时。合并两次提取液后减压浓缩得浸膏8kg，用20L水将此浸膏混悬溶解，先后分别用石油醚、乙酸乙酯等体积萃取，得到石乙酸乙酯萃取部分CRE(4kg)。乙酸乙酯萃取部位经大孔树脂(D101)色谱柱(30％～95％)乙醇梯度洗脱，收集85％-95％洗脱部分。进一步经SephadexLH-20柱色谱分离，以二氯甲烷/甲醇为流动相，分离得到两个部分，分别结晶得到化合物1(1.2g)和化合物2(1.4g)。实施例5升麻酮碱甲(化合物1)和升麻酮碱乙(化合物2)的理化及UV、IR、MS波谱数据如下：升麻酮碱甲：黑色结晶；10％硫酸乙醇显色呈黑褐色；UV(MeOH)λmax(logε):226(4.6),275(4.4),395(3.8)nm；IR(KBr)vmax:3396,3307,2965,2924,1636,1560,1417cm-1；1HNMR和13CNMR见表2.1。HRESI-MSm/z:395.1758[M+H]+,CalcdforC26H23N2O2395.1760；ESI-MS(positive)m/z：395.39[M+H]+,ESI-MS(negative)m/z：393.37[M-H]-。升麻酮碱乙：黑色无定形粉末；10％硫酸乙醇显色呈黑褐色；UV(MeOH)λmax(logε):225(4.6),273(4.7),417(3.8)nm；IR(KBr)vmax:3352,3275,2970,2921,1725,1676,1637,1559,1448cm-1；1HNMR和13CNMR见表2.1。HRESI-MSm/z：463.2388[M+H]+,CalcdforC31H31N2O2463.2386；ESI-MS(positive)m/z：463.49[M+H]+,ESI-MS(negative)m/z：461.33[M-H]-。升麻酮碱甲和升麻酮碱乙的1HNMR,13CNMR数据及归属见表1，每个氢、碳信号的归属通过测试二维核磁共振谱(HSQC、HMBC、NOESY)获得。其中HSQC确定了所有甲基、亚甲基、次甲基信号，HMBC实验则确定了每个氢-碳单元的连接顺序。附图给出了升麻酮碱甲的图谱(图1-6)、升麻酮碱乙的图谱(图7-11)。表1.升麻酮碱甲(1)(d6-DMSO)和升麻酮碱乙(2)(d6-acetone)的1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR数据及信号归属升麻酮碱甲(1)和升麻酮碱乙(2)的结构式如下：实施例6升麻提取物、升麻酮碱甲(1)和升麻酮碱乙(2)的药理活性研究(1)细胞株：人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系MKN7、GSU、人黑色素瘤细胞系A375、人肺腺癌细胞系NCI-H1975、人结肠癌细胞系Colo-205和人白血病细胞系HL-60；(2)细胞接种于RPMI培养基(含10％热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素G、100μg/ml链霉素)中，在37℃，5％CO2饱和湿度下培养，将对数生长期的细胞消化后，吹打成单细胞悬浮液，接种于96孔板，密度为4×103细胞/孔，每孔培养基100微升，在37℃，5％CO2饱和湿度下继续培养；(3)细胞培养24小时后，化合物用DMSO溶解成不同浓度，每孔加入10微升，每个浓度梯度平行做三份，设只加入DMSO的为对照组，加入紫杉醇(taxol)药物的为阳性对照组。继续培养72小时；(4)10％的三氯醋酸固定1小时后用蒸馏水洗涤；(5)每孔加入100微升SRB溶液(4mg/ml),室温染色20分钟；(6)移去上清液，每孔加入100微升10mMTris溶液使SRB溶解；(7)酶标仪检测各孔OD值(检测波长：490nm)；记录结果；按公式计算抑制率：抑制率(％)＝(OD对照-OD给药)/OD对照×100％，计算IC50。实验结果见下表2，结果显示：结果显示，升麻提取物及升麻酮碱甲和升麻酮碱乙能有效抑制人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系MKN7、GSU、人黑色素瘤细胞系A375、人肺腺癌细胞系NCI-H1975、人结肠癌细胞系Colo-205和人白血病细胞系HL-60这七株肿瘤细胞系的增值生长，其半数致死量在1.36-21.09μM的浓度范围。尤其是升麻酮碱乙在1.36+0.09μM的浓度下就能使人白血病细胞HL-60达到半数致死。表明这两个化合物可应用于抗肿瘤领域。表2提取物及化合物对HL-60,A549,NCI-H1975,Colo-205,A375,MKN7,GSU的增殖抑制作用(IC50μM)Celllines提取物12PositiveControlHL-605.26±0.443.98±0.311.36±0.090.434±0.230(Taxol,nM)A54919.45±0.6510.86±1.4912.43±1.720.400±0.020(Adriamycin)NCI-H197520.31±1.1111.63±0.0211.75±0.210.050±0.003(AZD9291)Colo-20520.88±1.2320.20±3.7621.09±5.870.047±0.004(GDC0994)A37521.01±1.5216.15±1.7110.56±0.040.160±0.020(GDC0994)MKN720.43±0.9919.45±0.4516.51±0.320.965±0.083(DM1)GSU19.78±0.8616.99±0.1817.10±1.390.008±0.001(DM1)实施例7升麻提取物片剂的制备升麻提取物100g与淀粉850g混匀，加10％淀粉浆20g制成软材，加入硬脂酸镁0.2g，干淀粉18g混匀后压制成2000片，即得。每片含升麻提取物50mg。实施例8升麻酮碱甲制剂的制备(1)制成片剂升麻酮碱甲10g与淀粉150g混匀，加10％淀粉浆20g制成软材，加入硬脂酸镁0.2g，干淀粉18g混匀后压制成1000片，即得。每片含升麻酮碱甲10mg。(2)制成注射剂升麻酮碱甲盐酸盐10g，加入25g甘露醇，加注射用水至1000ml加热溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤后每瓶1ml分装于5ml的西林瓶内，每瓶含升麻酮碱甲10mg，放入真空冷动干燥机内冻干，取出后轧盖包装即得。实施例9升麻酮碱乙制剂的制备(1)制成片剂取升麻酮碱乙3.0g与淀粉10g混匀，加10％淀粉浆3g制成软材，加入硬脂酸镁0.3g，干淀粉2g混匀后压制成100片，即得。每片含升麻酮碱乙30mg。(2)制成注射剂取升麻酮碱乙氢溴酸盐1.0g，加入10g甘露醇，加注射用水至1000ml加热溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤后每瓶2ml分装于5ml的西林瓶内，每瓶含升麻酮碱乙2.0mg，放入真空冷动干燥机内冻干，取出后轧盖包装即得。当前第1页1 2 3