本发明涉及血液成分分离领域，具体而言，涉及一种血小板及含有血小板的制剂的制备方法。
背景技术：
血小板，是哺乳动物中的有形成分之一，是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。血小板的体积小，无细胞核，呈双面微凹的圆盘状，直径为2-3微米。血小板具有特定的形态结构和生化组成，其在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。
现有的血小板制备方法主要有：洗涤法、梯度密度离心法、凝胶过滤法、免疫磁珠分选技术、以及流式细胞术。这些方法都各有优劣，比如洗涤法和梯度密度离心法，适用于少量血液中血小板的分离纯化，但血小板的纯度和回收率都会相对偏低；凝胶过滤法也是适用于少量血液中血小板的分离纯化，虽然其能提高血小板的纯度，但其操作复杂、分离难度大；同时，免疫磁珠分选技术，虽然该方法得到的血小板的回收率和纯度均较高，但该方法所用的磁珠以及抗体的价格高昂，导致分离纯化的成本高；而采用流式细胞仪，一次上机全血至少是400mL，不适用少量全血中血小板的分离，且费用昂贵、整个分离流程所需时间较长。因此，目前急需一种成本低廉且能够大幅提高血小板的纯度及回收率的血小板的制备方法。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种血小板的制备方法，这种制备方法能够有效的去除血小板中混有的白细胞，且能够有效避免血小板的损失，从而提高所制得的血小板的纯度和回收率。
本发明的第二目的在于提供一种含有血小板的制剂的制备方法，由这种制备方法制得的制剂中，血小板的纯度高，且其中不含白细胞，使用安全性高。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种血小板的制备方法，其包括：
将抗凝全血样品进行第一次离心得到上层液；再对上层液进行过滤处理以去除上层液中的白细胞，得到滤液；随后对滤液进行第二次离心，保留沉淀。
一种含有血小板的制剂的制备方法，该血小板是通过上述方法制备得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的血小板的制备方法，适用于较少量的全血中(低至1ml)的血小板的分离，通过这种方法能够有效的去除血小板中混有的白细胞，且能够有效避免血小板的损失，从而提高所制得的血小板的纯度和回收率，在本发明中，通过这种方法所得到的血小板的纯度高达95％以上，且血小板的回收率高达80％以上。此外，这种方法的工艺步骤简单，所使用的试剂及设备均容易得到且价格低廉，因此其制备高纯度的血小板的成本低、周期短。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
目前，从全血中分离血小板的技术主要有：洗涤法、梯度密度离心法、凝胶过滤法、流式细胞仪、以及免疫磁珠分选技术。但是对于如何在较低成本下从较少量的全血中分离得到高纯度(至少大于90％)的血小板，上述技术均无法实现。这主要是因为：流式细胞仪对上机血量有要求(至少大于400mL)，因此不适用于少量全血的分离；免疫磁珠分选技术虽然能够得到高纯度及高回收率的血小板，然而磁珠及抗体的价格高昂，导致分离纯化的成本偏高，不实用；而洗涤法、梯度密度离心法、凝胶过滤，这3种方法是根据血小板的物理属性进行分离，不能有效去除白细胞，且血小板损失量较大，使得最后所得到的血小板的纯度及回收率均偏低。
鉴于此，本实施方式提供一种血小板的制备方法，其包括：
S1:将抗凝全血样品进行第一次离心后，得到上层液。
抗凝全血样品是通过将新鲜采集的全血样品与抗凝剂混合制得。例如，进一步的，抗凝全血样品可以是通过用含抗凝剂的采血管采集静脉血得到，比如用枸橼酸钠抗凝管采集静脉血。为了使血小板的分离纯化效果更佳，在本发明中，选用较少量的抗凝全血样品，比如选用体积为10～15mL的抗凝全血样品。通常在采血后，在室温下运输采集的全血样品，尽量避免剧烈震荡，并尽可能在较短的时间内进行血小板的分离，以得到较高的回收率。
抗凝全血样品在第一次离心后，血液分为三层，下层呈暗红色，主要为质量较大的红细胞，其占血液总量的50％～80％；中层呈白色，极薄，为白细胞；上层呈淡黄色，为富含血小板的血浆，分离上层后，即得到上层液。在本发明较佳的实施例中，第一次离心是将抗凝全血样品在100～200g的相对离心力下离心10～20min；优选为，将抗凝全血样品在150g的相对离心力下离心15min。这一条件能够满足在最大程度的沉降红细胞和白细胞的同时，又能避免血小板的沉降，从而避免血小板的损失。
S2:再对上层液进行过滤处理以去除上层液中的白细胞。
第一步离心后，通常会有部分白细胞悬浮在上层，为了进一步纯化血小板，在本发明中，采用过滤的方式将上层液中的白细胞去除，以得到高纯度的血小板。较为优选的，对上层液进行过滤处理时，所使用的过滤膜具有能够截留白细胞、且能够使血小板和血浆透过的微孔。这种过滤膜可商用购买。
进一步的，在本发明较佳的实施例中，采用去白细胞过滤器对上层液进行过滤处理。由于去白细胞在临床上具有非常重要的意义，因此去白细胞过滤器已作为常规产品广泛应用在去除白细胞输血技术。这种去白细胞过滤器对白细胞的截流率高达90％以上，因此能够有效的去除上层液中混有的白细胞，从而提高血小板的纯度。
更进一步优选的，为了避免血小板的损失，在对上层液进行过滤处理后，还包括用缓冲液洗涤去白细胞过滤器的步骤。该缓冲液为pH值例如可以为7.2～7.6的缓冲液。该缓冲液例如可以为台式缓冲液，其包括：134mM的NaCl、12mM的NaHCO3、2.9mM的KCl、0.34mM的Na2HPO4、1mM的MgCL2以及10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。当然也可以采用其他能够满足需求的缓冲液。
在对上层液进行过滤处理时，可以采用加压的方式进行过滤，也可以直接进行常压过滤，即在重力的作用下过滤。采用加压的方式进行过滤时，由于上层液的流速较快，去白细胞过滤器对白细胞的截留量略低。此外，还应避免压力过大，导致细胞破裂、溶解的情况发生。优选的，在重力作用下，对上层液进行过滤处理。在重力作用下过滤，既能防止细胞破裂引起的污染，又能减缓过滤时上层液的流速，使得尽可能多的白细胞被截留。
S3:随后对所得滤液进行第二次离心。
在对上述滤液进行第二次离心后，血小板与血浆(及洗涤的缓冲液)分离，呈白色固体状沉淀在底部，且肉眼可见，将上层的上清液分离后，得到血小板沉淀，即为纯化后的血小板。
在本发明较佳的实施例中，第二次离心是将滤液在1500～2500g的相对离心力下离心5～15min，更为优选的，将滤液在2000g的相对离心力下离心10min。这一条件是发明人在多年的理论研究和实践探索中得到的优选范围，采用这一条件进行第二次离心，能够在得到高纯度的血小板的同时，又能较大限度的避免血小板的损失。
本发明提供的血小板的制备方法，适用于较少量的全血中的血小板的分离，通过这种方法能够有效的去除血小板中混有的白细胞，且能够有效避免血小板的意外损失，从而提高所制得的血小板的纯度和回收率。此外，这种方法的工艺步骤简单，所使用的试剂及设备均容易得到且价格低廉，因此其制备高纯度的血小板的成本低、周期短。
本发明还提供一种由上述方法所制备的血小板，这种血小板的纯度高达95％以上，且血小板的回收率高达80％以上，这种血小板使用时能够避免白细胞等血液成分带来的不利影响，为临床提供安全的血小板制剂。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1
本实施例提供一种血小板的制备方法，其包括：
a.将抗凝全血样品在150g的相对离心力下离心15min，得到上下分层血样样品，分离得到上层液。
b.再采用去白细胞过滤器对上层液进行过滤处理，以去除上层液中的白细胞，得到富含有血小板的滤液。
c.随后将滤液在2000g的相对离心力下离心10min，去除上清液，得到白色固体沉淀，即为纯化后的血小板。
为了计算血小板的回收率和纯度，分别在a步骤和b步骤后，在全血和滤液中各取100μL的液体进行血小板和白细胞计数，并按下式计算血小板的回收率和纯度：
回收率＝(滤液中血小板的计数浓度×滤液的体积)/(全血中血小板的计数浓度×全血的体积)×100％；
纯度＝纯化后的血小板中血小板的数量/所有细胞的数量×100％。
实施例2
本实施例提供一种血小板的制备方法，其包括：
a.将抗凝全血样品在200g的相对离心力下离心10min，得到上下分层血样样品，分离得到上层液。
b.再采用去白细胞过滤器对上层液进行过滤处理，以去除上层液中的白细胞，得到富含有血小板的滤液。
c.随后将滤液在2500g的相对离心力下离心5min，去除上清液，得到白色固体沉淀，即为纯化后的血小板。
血小板的回收率和纯度的测定方法与实施例1一致。
实施例3
本实施例提供一种血小板的制备方法，其包括：
a.将抗凝全血样品在100g的相对离心力下离心20min，得到上下分层血样样品，分离得到上层液。
b.再采用去白细胞过滤器对上层液进行过滤处理，以去除上层液中的白细胞，得到富含有血小板的滤液。
c.随后将滤液在1500g的相对离心力下离心15min，去除上清液，得到白色固体沉淀，即为纯化后的血小板。
血小板的回收率和纯度的测定方法与实施例1一致。
实施例4
本实施例提供一种血小板的制备方法，其包括：
a.将抗凝全血样品在150g的相对离心力下离心15min，得到上下分层血样样品，分离得到上层液。
b.再采用去白细胞过滤器对上层液进行过滤处理，使上层液在重力作用下通过去白细胞过滤器，并用少量的pH值为7.4的缓冲液洗涤去白细胞过滤器，得到富含有血小板的滤液。
c.随后将滤液在2000g的相对离心力下离心10min，去除上清液，得到白色固体沉淀，即为纯化后的血小板。
血小板的回收率和纯度的测定方法与实施例1一致。
实施例5
本实施例提供一种血小板的制备方法，其包括：
a.用6mL的负压枸橼酸钠抗凝管采两管血，轻轻混合2～4次，室温运输，尽量避免剧烈震荡。将采集到的抗凝全血样品合并倒入15mL的离心管中，在150g的相对离心力下离心15min，得到分层血样样品，其中上层呈淡黄色，为富含血小板的血浆；中层呈白色，为白细胞；下层呈暗红色，主要为红细胞。分液得到上层液，用于后续分离。
b.再采用去白细胞过滤器对上层液进行过滤处理：将5mL的注射器与去白细胞过滤器连接，置于15mL的收集管(即为离心管)上方，将上层液加入到注射器中，通过重力过滤血浆；随后加入5mL的缓冲溶液进行洗涤，通过重力过滤缓冲液，得到富含有血小板的滤液。
c.将收集管放入离心机中，在2000g的相对离心力下离心10min，取出离心管，用吸管或移液枪移除上清液，得到白色固体沉淀，即为纯化后的血小板。
血小板的回收率和纯度的测定方法与实施例1一致。
对比例1
本对比例提供一种血小板的制备方法，其包括：
a.用6mL的负压枸橼酸钠抗凝管采两管血，轻轻混合2～4次，室温运输，尽量避免剧烈震荡。将采集到的抗凝全血样品合并倒入15mL的离心管中，在150g的相对离心力下离心15min，得到分层血样样品，其中上层呈淡黄色，为富含血小板的血浆；中层呈白色，为白细胞；下层呈暗红色，主要为红细胞。分液得到上层液，用于后续分离。
b.将收集管放入离心机中，在2000g的相对离心力下离心10min，取出离心管，用吸管或移液枪移除上清液，得到白色固体沉淀，即为纯化后的血小板(质量为m0)。
为了计算血小板的回收率和纯度，取少量b步骤得到的血小板(质量为m1)将其分散溶解得血小板分散液。在所得到的上层液和血小板分散液中各取100μL的液体进行血小板和白细胞计数，并按下式计算血小板的回收率和纯度：
回收率＝(滤液中血小板的计数浓度×滤液的体积)/(血小板分散液中血小板的计数浓度×血小板分散液的体积×m0/m1)×100％；
纯度＝纯化后的血小板中血小板的数量/所有细胞的数量×100％。
对比例2
本对比例提供一种血小板的制备方法，其采用洗涤法分离纯化得到，具体为：
a.用6mL的负压枸橼酸钠抗凝管采两管血，轻轻混合2～4次，室温运输，尽量避免剧烈震荡。将采集到的抗凝全血样品合并倒入15mL的离心管中，在150g的相对离心力下离心15min，得到上下分层血样样品，取上层液，即为富集血小板的血浆。
b.将上层液转入离心管中，在1200g的相对离心力下离心5min，取出离心管，血小板沉淀在管底，随后弃去上清液，用血小板洗涤液洗涤沉淀3次，得到血小板(质量为m0)。
血小板的回收率和纯度的测定方法与对比例1一致。
实施例1～5和对比例1～2中所提供的血小板的纯度和回收率如表1所示：
表1.血小板的纯度和回收率统计结果
由表1可知，本发明实施例1～5所提供的血小板的回收率在80％以上，纯度在96％以上。与对比例1(缺少白细胞去除步骤)和对比例2(为常规洗涤法)相比，所得到的血小板的回收率和纯度得到大幅提高。此外，在通过血常规仪器对实施例1～5提供的血小板样品进行分析，血小板中所含的白细胞在1×107个/L的这个数量级上检测不到，说明血小板中的白细胞已被有效的去除。
综上所述，本发明提供的血小板的制备方法，适用于较少量的全血中的血小板的分离，通过这种方法能够有效的去除血小板中混有的白细胞，且能够有效避免血小板的意外损失，从而提高所制得的血小板的纯度和回收率，在本发明中，通过这种方法所得到的血小板的纯度高达95％以上，且血小板的回收率高达80％以上。此外，这种方法的工艺步骤简单，所使用的试剂及设备均容易得到且价格低廉，因此其制备高纯度的血小板的成本低、周期短。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。