一种用于观察骨细胞的光学平台的制备方法与流程

本发明属于复合生物材料合成技术领域，特别是用于观察骨细胞与骨科药物相互作用的光学平台的制作技术。

背景技术：

羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）是人体骨骼的最主要组成部分。水热法合成的羟基磷灰石不但具有纳米级的晶型针状结构，同时又具有非常好的生物相容性，在医学支撑材料领域具有非常广阔的应用价值。人工合成的羟基磷灰石粉末样品具有特殊的表面性能、生物活性、生物降解性、骨传导性、非免疫原性等优点，植入人体后，在体液的作用下，钙和磷游离出材料表面，并与人体骨组织形成化学键合，参与新组织的形成，并且其在各种磷酸钙中是热力学最稳定的形态，故使其在生物医学领域有着广泛的应用前景，已成为国内外生物医用材料领域的主要课题之一。

如今科研领域用到的细胞培养的容器大多数在追求细胞后期生长观察的时候，忽略了细胞培养板对细胞生长的促进作用。很多人都在考虑通过在细胞生长表面涂抹一层羟基磷灰石来提高细胞的生长活性。羟基磷灰石的涂膜技术有很多种，如电镀喷涂技术，溶胶凝胶法涂膜和水热法涂膜等。其中以水热法为比较常用的涂膜手段，通过调节pH，反应浓度和水热温度来控制羟基磷灰石薄膜性能。特别是一些光学基底在涂膜过羟基磷灰石薄膜后，不仅能使细胞在基底表面快速生长，同时也有利于光学显微镜的观察。

现在医疗植入材料领域主要是以合金材料为主，但是这些材料的生物相容性很差，如果和羟基磷灰石结合在一起后，可获得生物相容性和机械性能都兼得的植入材料。专利文献 CN 100356991C 介绍了一种在医用材料上进行涂膜羟基磷灰石薄膜的方法，先配好的羟基磷灰石悬浊液，然后通过提拉法，溶胶凝胶法和喷涂法等方法将羟基磷灰石均匀的涂抹到基底上。但是这个材料在实验初期没法用光学显微镜观察细胞的长势和状态等，在材料应用前期的检验阶段，产生了很大的不便利。

技术实现要素：

本发明旨在介绍一种用于观察骨细胞的光学平台的制备方法，以方便观察细胞在羟基磷灰石表面生长分化的情况。

本发明包括步骤如下：

1）在磁力搅拌下，将磷源溶解在去离子水中，制得磷源溶液；

2）在磁力搅拌下，将钙盐溶解于去离子水中，制得钙源溶液；

3）磁力搅拌条件下，将磷源溶液和钙源溶液混合进行反应，获得羟基磷灰石悬浊液；

4） 将光学基底放于聚四氟乙烯内衬中，并向内衬中加入所述羟基磷灰石悬浊液；然后放入高压反应釜中，在180℃的温度环境下进行水热反应12～36h，水热反应完成后冷却至室温，取得用于观察骨细胞的光学平台。

本发明在光学基底上通过水热法涂膜羟基磷灰石薄膜的方法，这些涂膜后的基底材料可以用来方便地观察细胞在羟基磷灰石表面生长分化的情况，同时可以观察人类骨细胞与骨科药物的相互作用。

进一步地，本发明所述磷源为磷酸二氢铵，或磷酸氢铵钠。该磷源可溶于水，方便反应的进行。

所述钙盐为硝酸钙。用硝酸钙作为本发明工艺中的钙盐可溶于水，方便反应的进行。

所述磷源溶液和钙源溶液混合时，钙源和磷源的摩尔比为1.67∶1。该投料比可节约原料，尽量减少造成的污染和浪费。

步骤3）中混合反应时，以氨水调节体系的pH值为9～11，可使反应体系呈碱性，可以形成羟基磷灰石。

另外，采用氨水调节体系的pH值优点是：氨水易挥发，易溶解，方便后期样品洗涤的工作。

本发明还以超声水洗冷却至室温的水热反应样品，然后置于40～45℃条件下烘干。超声水洗可去除表面附着不稳的羟基磷灰石，40～45℃条件下烘干可以降低能耗，且不改变纳米粒子的晶型。

附图说明

图1为涂布和未涂布羟基磷灰石的光学平台的透明度水平比较图片。

图2为在玻璃基板上稀释4倍下合成的羟基磷灰石膜的低倍和高倍率显微照片。

图3为在原始浓度为0,1 / 2,1 / 4,1倍的平板玻璃上的羟基磷灰石超薄膜在300〜600nm波长处的透射率。

图4为羟基磷灰石结构的红外图谱。

图5为羟基磷灰石结构的XRD图谱。

图6为羟基磷灰石结构的拉曼图谱。

图7为在玻璃表面培养3天并在白光下观察的MG-63细胞的活性图。

图8为在玻璃系表面培养4天的MG-63细胞的ALP活性图。

图9为具有HA涂层的玻璃增强的成骨细胞矿化现象图。

图10为HA涂层玻璃化增强的骨细胞树突状网络形成现象图。

图11为HA涂层玻璃促进破骨细胞形成和引发破骨细胞吸收现象图。

具体实施方式

一、制备工艺：

实施案例1

称取0.5968g 四水硝酸钙用50mL去离子水完全溶解，得到硝酸钙溶液。

称取0.1996g 磷酸氢二铵同样用50mL去离子水完全溶解，得到磷酸二氢铵溶液。

磁力搅拌条件下，将磷酸二氢铵溶液缓慢加入到硝酸钙溶液中进行反应，在加入的过程中通过氨水调节反应体系的pH=10，得到的白色羟基磷灰石悬浊液。

将处理好的玻璃基底放于聚四氟乙烯反应内衬中后，向内衬中加入羟基磷灰石悬浊液。

将高压反应釜放于烘箱中在180℃温度条件下水热反应24h，待反应结束冷却到室温后，样品超声水洗5min洗去表面附着不稳的羟基磷灰石，最后水洗，并且在45℃条件下烘干即可。

实施案例2

称取0.2984g 四水硝酸钙用去50mL去离子水完全溶解，得到硝酸钙溶液。

称取0.0998g 磷酸氢二铵同样用50mL去离子水完全溶解，得到磷酸二氢铵溶液。

磁力搅拌条件下，将磷酸二氢铵溶液缓慢加入到硝酸钙溶液中进行反应，在加入的过程中通过氨水调节反应体系的pH=10，得到的白色羟基磷灰石悬浊液。

将处理好的玻璃基底放于聚四氟乙烯反应内衬中后，向内衬中加入羟基磷灰石悬浊液。

将高压反应釜放于烘箱中在180℃温度条件下水热反应24h，待反应结束冷却到室温后，样品超声水洗5min洗去表面附着不稳的羟基磷灰石，最后水洗，并且在45℃条件下烘干即可。

实施案例3

称取0.1492g四水硝酸钙用去50mL去离子水完全溶解，得到硝酸钙溶液。

称取0.0449g 磷酸氢二铵同样用50mL去离子水完全溶解，得到磷酸二氢铵溶液。

磁力搅拌条件下，将磷酸二氢铵溶液缓慢加入到硝酸钙溶液中进行反应，在加入的过程中通过氨水调节反应体系的pH=10，得到的白色羟基磷灰石悬浊液。

将处理好的玻璃基底放于聚四氟乙烯反应内衬中后，向内衬中加入羟基磷灰石悬浊液。

将高压反应釜放于烘箱中在180℃温度条件下水热反应24h，待反应结束冷却到室温后，样品超声水洗5min洗去表面附着不稳的羟基磷灰石，最后水洗，并且在45℃条件下烘干即可。

实施案例4

称取0.1492g四水硝酸钙用去50mL去离子水完全溶解，得到硝酸钙溶液。

称取0.0449g 磷酸氢铵钠同样用50mL去离子水完全溶解，得到磷酸氢铵钠溶液。

磁力搅拌条件下，将磷酸氢铵钠溶液缓慢加入到硝酸钙溶液中进行反应，在加入的过程中通过氨水调节反应体系的pH=10，得到的白色羟基磷灰石悬浊液。

将处理好的玻璃基底放于聚四氟乙烯反应内衬中后，向内衬中加入羟基磷灰石悬浊液。

将高压反应釜放于烘箱中在180℃温度条件下水热反应24h，待反应结束冷却到室温后，样品超声水洗5min洗去表面附着不稳的羟基磷灰石，最后水洗，并且在50℃条件下烘干即可。

注：以上各例中玻璃基底的预处理方法是通过柔和洗涤剂和纯水的反复冲洗，以得到洁净的玻璃基底。

二、本发明的方法获得的涂膜后的基底材料效果分析：

从图1的涂布和未涂布羟基磷灰石的光学平台的透明度水平比较图片可以看出：涂覆羟基磷灰石的玻璃基底透光性良好。

如图2所示，在180℃，4倍稀释浓度下水热反应24小时后，通过SEM图像清楚地显示在基材上形成的羟基磷灰石膜的表面形态。在图2中，在视图中用羟基磷灰石颗粒在玻璃表面上均匀地制备了羟基磷灰石涂层，并且发现合成的羟基磷灰石涂层由直径在80nm至100nm之间的羟基磷灰石颗粒组成。

合成后使用不同浓度的溶液形成羟基磷灰石涂层，通过紫外分光光度计研究样品的波长在300nm和600nm之间的透射率；结果如图3所示。在图3中，显示没有羟基磷灰石涂层的片状玻璃具有最高的透射率，而随着溶液浓度的增加，在300nm和600nm之间的波长的透射率逐渐降低，并且在初始浓度时透射率降低到70％。

通过红外表征分子结构，表征结果如图4所示。羟基磷灰石涂层的FTIR光谱如图4所示。在图4中，963cm^-1处的吸收峰是磷酸根的对称伸缩振动峰，1030cm^-1和1088cm^-1处的峰归属于磷酸根的不对称伸缩振动峰，而563cm^-1和603cm^-1为磷酸根的反对称伸缩振动峰。在图5中，在1500-1400cm^-1区域的峰归因于C-O（υ3）的反对称伸缩振动。总体上，这些峰基本上符合羟基磷灰石的标准红外光谱。关于羟基磷灰石薄膜的进一步研究通过拉曼（图5），磷酸根的特征峰出现在959.4cm^-1，以及出现在3568.3cm^-1的峰归属于OH-。

合成的超薄羟基磷灰石涂层的XRD图案示于图6中。通过水热合成的羟基磷灰石涂层的衍射峰包括（200），（111），（002），（102），（210），（211），（300），（202），（310） ，（213），（004）。并且羟基磷灰石涂层的所有这些衍射峰可以在纯HAp的标准图谱中找到，其表明涂层是羟基磷灰石，合成的HA也具有良好的晶体结构。

三、采用本发明的方法获得的涂膜后的基底材料用来观察骨细胞在羟基磷灰石表面生长分化的情况：

图7至8中通过倒置显微镜观察在片材上培养的MG-63是为了研究羟基磷灰石超薄涂层对由不同材料制成的片材的透明度的影响。使用倒置显微镜可以清楚地观察到细胞的形态，其中细胞生长良好并且在制备或不制备羟磷灰石超薄涂层的情况下在片材上保持良好的形态。这表明羟基磷灰石超薄涂层不降低玻璃板的透明度。

如图9所示，在显微镜下观察到更多的ALP阳性结节。统计分析显示HA涂层增强的成骨细胞矿化4%。成骨细胞相关基因表达的进一步qPCR证实HA包被的玻璃组中成骨细胞基因表达的倍数增加。

如图10所示，HA涂覆的玻璃上的骨细胞形成比未涂覆的玻璃上的骨细胞更多和更长的树突过程。

如图11所示，在HA涂覆的玻璃中观察到的TRAP阳性破骨细胞比未涂覆的玻璃多。 在未包衣组中有约100个TRAP阳性破骨细胞，但在HA包衣组中有150个TRAP阳性破骨细胞。 此外，破骨细胞特异性基因的表达也在HA包被组中增强。我们注意到很多针状HA颗粒被吸收到破骨细胞中。 另外的共聚焦图像也证实了这些HA颗粒被成熟破骨细胞吸收。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。