本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种靶向cd20的抗体偶联药物及其制备方法和用途。
背景技术：
淋巴瘤是一组起源于淋巴结和结外其他淋网状组织的恶性肿瘤，其种类繁多且发病率高，每年我国有数万人因此失去生命。cd20是一种特异性表达于b淋巴细胞表面的非糖基化四重跨膜磷蛋白，对b淋巴细胞的分化和增殖具有重要的调节作用。cd20在b细胞表面的稳定和特异性表达，使得其成为治疗b细胞淋巴瘤理想的靶点。目前，经fda批准上市用于治疗b细胞淋巴瘤的抗cd20单抗有rituximab、zevalin、bexxar等。
单抗-毒素偶联药物(antibody-drugconjugate，adc)属于近年来发展起来的新型抗癌药物，是将抗体和细胞毒性药物通过偶联子连接起来，抗体的靶向作用将细胞毒性药物靶向到肿瘤部位，通过内吞作用，adc药物进入肿瘤细胞后释放毒素，杀死靶细胞，从而降低化疗中常见的药物非特异性的全身毒性。
因此，本领域技术人员致力于开发新的、更有效的靶向cd20的抗体偶联药物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种靶向cd20的抗体偶联药物。
本发明的另一目的是提供上述抗体偶联药物的制备方法和用途。
本发明的第一方面，提供了一种抗体偶联药物或其药学上可接受的盐，所述抗体偶联药物结构如式i所示：
mab-(l-d)ni
其中，
mab表示重组抗cd20单抗，且所述重组抗cd20单抗为利妥昔单抗或其生物类似药；
d表示小分子毒素，且d为一种或多种单甲基澳瑞他汀(monomethylauristatin)；
l为连接抗体和小分子毒素的接头；
n为偶联于所述抗体的所述小分子毒素的平均偶联数量，且n为4.2±1的整数或非整数；和
“-”为键。
在另一优选例中，n为4.2±0.5的整数或非整数。
在另一优选例中，n为4.2±0.3的整数或非整数。
在另一优选例中，所述小分子毒素通过接头与抗体的链间的二硫键还原后形成的巯基连接。
在另一优选例中，d为单甲基澳瑞他汀-e(mmae)、单甲基澳瑞他汀-d(mmad)、单甲基澳瑞他汀-f(mmaf)，或其组合。
在另一优选例中，所述l为马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸–对氨基苄氧羰基。
在另一优选例中，所述抗体偶联药物的结构如下式所示：
本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的抗体偶联药物，以及药学上可接受的载体。
本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体偶联药物或如本发明第二方面所述的药物组合物的用途，用于制备抗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述肿瘤为淋巴瘤或白血病。
在另一优选例中，所述肿瘤为b细胞非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。
本发明的第四方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的抗体偶联药物的方法，所述方法包括步骤：
(1)将重组抗cd20单抗和还原剂进行还原反应，从而含有经还原的重组抗cd20单抗的反应体系；且所述单抗和还原剂的摩尔比为1：2.9～1：3.1；和
(2)将步骤(1)的反应体系和小分子毒素在乙腈和水中的溶液进行偶联反应，从而形成权利要求1所述的抗体偶联药物；且步骤(1)中的单抗与小分子毒素的摩尔比为1：7.0～1：8.0。
在另一优选例中，步骤(1)中，在缓冲液中进行还原反应。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述经还原的重组抗cd20单抗为链间二硫键被还原为巯基的重组抗cd20单抗。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述缓冲液为pb反应缓冲液(ph7.6)。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述单抗和还原剂的摩尔比为1：2.95～1：3.05；较佳地，为1：2.99～1：3.01。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述还原反应在25±1℃下进行。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述还原反应进行90±10分钟。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述步骤(1)中的单抗与小分子毒素的摩尔比为1：7.2～1：7.7；较佳地，1：7.4～1：7.6。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述乙腈和水的体积比例为1：1。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述偶联反应在4±0.5℃下进行。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述偶联反应进行60±10分钟。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述混合是将小分子毒素在乙腈和水中的溶液滴加至步骤(1)的反应体系中。
本发明的第五方面，提供了一种非治疗性的抑制肿瘤细胞的方法，所述方法包括步骤：在含有肿瘤细胞的体系中加入本发明第一方面所述的抗体偶联药物或本发明第二方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞为cd20阳性肿瘤细胞，例如，raji、ramos、daudi细胞等。
本发明还提供了一种治疗或预防肿瘤的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的抗体偶联药物或本发明第二方面所述的药物组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为鉴定抗体偶联药物trs005载药量的疏水作用色谱。
图2为鉴定抗体偶联药物trs005载药量的疏水作用色谱。
图3为鉴定抗体偶联药物trs005载药量的疏水作用色谱。
图4为三批次trs005的c4-rplc色谱图比较。
图5为三批次trs005的疏水作用色谱图比较。
图6a显示了流式细胞术散点图。
图6b显示了单参数直方图。
图6c显示了本发明的抗体偶联药物trs005在ramos细胞中的内吞效果。
图6d显示了本发明的抗体偶联药物trs005在raji细胞中的内吞效果。
图7显示了本发明的抗体偶联药物trs005的细胞抑制效果。
图8显示了肿瘤体积-时间曲线图(21天6次注射治疗)。动物模型：balb/c裸鼠ramos移植瘤；单抗与细胞毒素载药量dar为4.2。
图9显示了肿瘤重量散点图(21天6次注射治疗)。动物模型：balb/c裸鼠ramos移植瘤；单抗与细胞毒素载药量dar为4.2。
图10显示了肿瘤体积-时间曲线图(21天6次注射治疗)。动物模型：balb/c裸鼠daudi移植瘤；单抗与细胞毒素载药量dar为4.2。
图11显示了肿瘤重量散点图(21天6次注射治疗)。动物模型：balb/c裸鼠daudi移植瘤；单抗与细胞毒素载药量dar为4.2。
图12显示了形成的单抗偶联药物可能的毒素结合位点和携药数量。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外发现一种高效的且毒素负载量经过优化的靶向cd20的抗体偶联药物。在此基础上完成了本发明。
抗体
适用于本发明的抗体为靶向cd20的抗体，为重组抗cd20的单抗。所述重组抗cd20单抗可为利妥昔单抗，也可为其生物类似药。
小分子毒素
适用于本发明的小分子毒素为具有高细胞毒性的化合物。具体地，所述小分子毒素为一种或多种单甲基澳瑞他汀(monomethylauristatin)；更佳地，所述小分子毒素为单甲基澳瑞他汀-e(mmae)、单甲基澳瑞他汀-d(mmad)、单甲基澳瑞他汀-f(mmaf)，或其组合。
其中，mmae分子结构如下图所示：
接头
适用于本发明的接头(l)用于连接本发明的抗体和小分子毒素。具体地，所述接头为马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸–对氨基苄氧羰基，例如如下式所示：
抗体偶联药物
本发明提供了一种抗体偶联药物，它包括通过接头(l)连接在一起的(a)重组抗cd20的单抗与(b)具有细胞毒性的小分子毒素。
如本文所用，术语“本发明的抗体偶联药物”或“本发明的adc”可互换使用，是指本发明抗体和小分子毒素的通过接头结合的偶联体。
具体地，所述抗体偶联药物结构如式i所示：
mab-(l-d)ni
其中，
mab表示本发明的抗体；
d表示本发明的小分子毒素；
l为连接抗体和小分子毒素的接头；
n为偶联于所述抗体的所述小分子毒素的平均偶联数量，且n为4.2±1的整数或非整数；和
“-”为键。
在另一优选例中，n为4.2±0.5的整数或非整数。
在另一优选例中，n为4.2±0.3的整数或非整数。
在另一优选例中，所述抗体偶联药物的结构如下式所示：
制备方法
本发明提供了一种抗体偶联药物的偶联方法，其将小分子毒素通过特定接头偶联到抗体上，在不改变抗体亲和性的基础上，大幅提高抗体对肿瘤细胞的杀伤力。
首先，通过常规的化学合成方法连接小分子毒素与接头，也可采用市售可得的连接有接头的小分子毒素；
然后，将重组表达的单抗分子通过四对链间二硫键还原后形成的自由巯基与已经连接小分子毒素的接头中马来酰亚胺基团连接。
形成的单抗偶联药物因为反应位点的不均一性在溶液中存在多种带药数量的混合物。形成的单抗偶联药物可能的毒素结合位点和携药数量如图12所示。
由图12可知，理论上形成的单抗偶联药物共有5种携带不同药物数量的形式，分别为带0个、2个、4个、6个、8个药物分子。为了评估其载药数量，可使用了国际通用的评估方式，即统计其平均毒素药物和抗体的摩尔比值(drugantibodyratio,dar)。
本发明的抗体偶联药物的dar值为4.2±1的整数或非整数；较佳地，为4.2±0.5的整数或非整数。
用途
本发明还提供了一种使用本发明抗体偶联药物治疗哺乳动物疾病的方法。优选地，所述的疾病为靶向cd20的疾病，例如肿瘤，如淋巴瘤(例如b细胞非霍奇金淋巴瘤)或白血病(慢性淋巴细胞白血病)。
本发明还提供了一种含有本发明抗体偶联药物的药物组合物(例如抗肿瘤药物)。
所述药物组合物包括有效量的根据本发明的抗体偶联药物(作为活性成分)，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。制备时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可采用固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是溶液剂、灭菌注射溶液等。
合适的赋形剂包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水等；制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)等。
所述药物组合物可制成单元或多元剂型，各剂型包含为了产生所期望的疗效而计算出预定量的本发明的抗体偶联药物，以及合适的药剂学赋形剂。
所述药物组合物可以通过常规途径进行给药，包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、局部给药等。
使用该药物组合物时，是将安全有效量的所述抗体偶联药物施用于人，其中该安全有效量的范围优选为0.001～3毫克/千克体重，更优选为0.01～2毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是在熟练医师技能范围之内的。
此外，本发明的抗体偶联药物还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)：环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、强的松、pd1抗体、ctla4抑制剂，或其组合。
与现有技术相比，本发明的主要有益效果包括：
本发明提供了一种载药量经过优化的抗体偶联药物，该偶联药物既具有较高的药物活性，而且稳定性好，毒性低，成药性佳。
本发明提供了一种基于巯基偶联的，可以较为精准地控制载药量的单抗偶联药物的制备方法。该方法制得的产品中裸抗比例低于3％，同时通过体内外药效试验证明了药物的有效性。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用原料、试剂、细胞株或仪器，若非特别说明，均市售可得或常规的。
缩写
tcep：三(2-羧乙基)膦；dtpa：二乙胺三胺五乙酸；acn：乙腈；tff：切向流过滤；rt：室温。
在本实施例中，除非特别说明，否则试剂、仪器和细胞株均为市售的或常规的。
实施例1抗体(trs001)的制备
基于利妥昔单抗的轻链和重链的氨基酸序列和核苷酸序列，全合成编码序列。以经悬浮驯化的cho-k1为宿主细胞(来自美国的atcc)，利用以pcdna3.0为基础的表达载体，构建单克隆抗体轻链(lc)和重链(hc)双表达质粒，pcdna3-rx-neo和pcdna3-rx-gs。两个表达质粒均带有抗体的轻链、重链(所述trs001轻、重链与市售的利妥昔单抗的轻、重链序列完全一致)基因并携带相应的筛选标记。两种表达质粒共转染宿主细胞经双筛选标记对稳转细胞进行筛选，之后利用半固体培养基克隆法逐级筛选出多个候选单克隆细胞株，再通过摇瓶和反应器培养筛选出用于生产抗体(trs001)单克隆细胞株。
对所述单克隆细胞株进行测序，测序结果表明，编码trs001轻链和重链的序列与市售的利妥昔单抗完全一致，且生产出的利妥昔单抗生物类似药(biosimilar)的分子量等理化指标与利妥昔单抗相同。
以上述步骤选出的单克隆细胞株作为最终生产用细胞株，参照利妥昔单抗原研药专利(cn93121424.6)提供的生产方法制备重组抗人cd20的单抗trs001，用于后续实施例。
实施例2抗体偶联药物(trs005：dar约为4.2)制备
1.溶液和材料的制备
缓冲液a：0.05mol/lpb反应缓冲液(ph7.6)
使用0.2mol/lnah2po4.h2o和0.2mol/lna2hpo4.7h2o的溶液(使用millipore纯化水)以制备0.2mol/lpb储存缓冲液(ph7.6)，0.22μm膜过滤(nalgenerapid-flow单位)并在4℃下保存，rt平衡并稀释至0.05mol/l作为还原缓冲液。
还原剂：100mmol/ltcep溶液
溶解1.43gtecp在50ml纯水中得到100mmol/l溶液，等分1ml/瓶并储存在-80℃。
缓冲液b：10mg/mll-半胱氨酸终止缓冲液
在100ml0.1mmdtpa溶液中溶解1gl-半胱氨酸，0.22μm膜过滤并储存于-80℃。
50％acn溶液
混合相同体积的acn和超纯水制备50％乙腈溶液，0.22μm膜过滤并在4℃下储存。
缓冲液c：ht制剂缓冲液
1lht制剂缓冲液含有l-组氨酸3.18g，海藻糖二水合物70g和吐温800.2ml，使用0.5mol/l盐酸调节ph至6.5，0.22μm膜过滤，4℃保存。
2.trs001还原(摩尔比：mab：tcep≈1:3)
在25℃条件下将实施例1制备的trs001原液(55mg/ml)解冻过夜(稳定室)。在反应器(反应器预填充0.1mol/lnaoh超过24小时并洗涤干净)中加入1616ml缓冲液a，然后加入2ml100mmol/ltcep溶液并混合(100rpm，5分钟)。添加182mltrs001原液，以100rpm搅拌，在25℃使还原反应保持90min。
3.结合(摩尔比：mab：vcmmae≈1:7.5)
将温度控制反应浴设置为4℃(用冰冷却添加)。保持搅拌速度在100-200rpm。将13.2mlvcmmae(50mg/ml)(购自levenabiopharma公司)加入186.8ml50％acn中，然后通过样品添加管小心加入并非常缓慢地混合(控制样品添加时间10min内)，轻轻向上述步骤的反应体系中滴入所有物料。在vcmmae溶液完全进料后反应时间保持1h。
4.停止反应
在10分钟内向反应器中加入10ml缓冲液b停止偶联反应，停止偶联反应后进行下一步缓冲液置换。
5.缓冲液置换
转移偶联溶液至tff系统(用0.1mol/lnaoh预先浸泡并洗涤干净)。将缓冲液a更改为缓冲液c和然后用0.22微升rapid-flow装置过滤。最终溶液中缓冲液a的残留率应小于0.25％。置换后的trs005原液可储存在2-8℃。
最终得到dar约为4.2的抗体偶联药物trs005，抗体偶联药物的载药量鉴定结果如图1所示。
实施例3抗体偶联药物(trs005：dar约为6.2)制备
1.溶液和材料的制备
缓冲液a：0.05mol/lpb反应缓冲液(ph7.6)
使用0.2mol/lnah2po4.h2o和0.2mol/lna2hpo4.7h2o的溶液(使用millipore纯化水)以制备0.2mol/lpb储存缓冲液(ph7.6)，0.22μm膜过滤(nalgenerapid-flow单位)并在4℃下保存，rt平衡并稀释至0.05mol/l作为还原缓冲液。
还原剂：100mmol/ltcep溶液
溶解1.43gtecp在50ml纯水中得到100mmol/l溶液，等分1ml/瓶并储存在-80℃
缓冲液b：10mg/mll-半胱氨酸终止缓冲液
在100ml0.1mmdtpa溶液中溶解1gl-半胱氨酸，0.22μm膜过滤并储存于-80℃。
50％acn溶液
混合相同体积的acn和超纯水制备50％乙腈溶液，0.22μm膜过滤并在4℃下储存。
缓冲液c：ht制剂缓冲液
1lht制剂缓冲液含有l-组氨酸3.18g，海藻糖二水合物70g和吐温800.2ml，使用0.5mol/l盐酸调节ph至6.5，0.22μm膜过滤，4℃保存。
2.trs001还原(摩尔比：mab：tcep≈1:3.6)
在25℃条件下将实施例1制备的trs001原液(55mg/ml)解冻过夜(稳定室)。在反应器(反应器预填充0.1mol/lnaoh超过24小时并洗涤干净)中加入1616ml缓冲液a，然后加入2.4ml100mmol/ltcep溶液并混合(100rpm，5分钟)。添加182mltrs001原液，以100rpm搅拌，在25℃使还原反应保持90min。
3.结合(摩尔比：mab：vcmmae≈1:9)
将温度控制反应浴设置为4℃(用冰冷却添加)。保持搅拌速度在100-200rpm。将15.8mlvcmmae(50mg/ml)(购自levenabiopharma公司)加入184.2ml50％acn中，然后通过样品添加管小心加入并非常缓慢地混合(控制样品添加时间10min内)，轻轻向上述步骤的反应体系中滴入所有物料。在vcmmae溶液完全进料后反应时间保持1h。
4.停止反应
在10分钟内向反应器中加入10ml缓冲液b停止偶联反应，停止偶联反应后进行下一步缓冲液置换。
5.缓冲液置换
转移偶联溶液至tff系统(用0.1mol/lnaoh预先浸泡并洗涤干净)。将缓冲液a更改为缓冲液c和然后用0.22微升rapid-flow装置过滤。最终溶液中缓冲液a的残留率应小于0.25％。置换后的trs005原液可储存在2-8℃。
最终得到dar约为6.2的抗体偶联药物trs005，抗体偶联药物的载药量鉴定结果如图2所示。
实施例4抗体偶联药物(trs005：dar约为3.2)制备
1.溶液和材料的制备
缓冲液a：0.05mol/lpb反应缓冲液(ph7.6)
使用0.2mol/lnah2po4.h2o和0.2mol/lna2hpo4.7h2o的溶液(使用millipore纯化水)以制备0.2mol/lpb储存缓冲液(ph7.6)，0.22μm膜过滤(nalgenerapid-flow单位)并在4℃下保存，rt平衡并稀释至0.05mol/l作为还原缓冲液。
还原剂：100mmol/ltcep溶液
溶解1.43gtecp在50ml纯水中得到100mmol/l溶液，等分1ml/瓶并储存在-80℃
缓冲液b：10mg/mll-半胱氨酸终止缓冲液
在100ml0.1mmdtpa溶液中溶解1gl-半胱氨酸，0.22μm膜过滤并储存于-80℃。
50％acn溶液
混合相同体积的acn和超纯水制备50％乙腈溶液，0.22μm膜过滤并在4℃下储存。
缓冲液c：ht制剂缓冲液
1lht制剂缓冲液含有l-组氨酸3.18g，海藻糖二水合物70g和吐温800.2ml，使用0.5mol/l盐酸调节ph至6.5，0.22μm膜过滤，4℃保存。
2.trs001还原(摩尔比：mab：tcep≈1:2.8)
在25℃条件下将实施例1制备的trs001原液(55mg/ml)解冻过夜(稳定室)。在反应器(反应器预填充0.1mol/lnaoh超过24小时并洗涤干净)中加入1616ml缓冲液a，然后加入1.8ml100mmol/ltcep溶液并混合(100rpm，5分钟)。添加182mltrs001原液，以100rpm搅拌，在25℃使还原反应保持90min。
3.结合(摩尔比：mab：vcmmae≈1:6)
将温度控制反应浴设置为4℃(用冰冷却添加)。保持搅拌速度在100-200rpm。将10.5mlvcmmae(50mg/ml)(购自levenabiopharma公司)加入189.5ml50％acn中，然后通过样品添加管小心加入并非常缓慢地混合(控制样品添加时间10min内)，轻轻向上述步骤的反应体系中滴入所有物料。在vcmmae溶液完全进料后反应时间保持1h。
4.停止反应
在10分钟内向反应器中加入10ml缓冲液b停止偶联反应，停止偶联反应后进行下一步缓冲液置换。
5.缓冲液置换
转移偶联溶液至tff系统(用0.1mol/lnaoh预先浸泡并洗涤干净)。将缓冲液a更改为缓冲液c和然后用0.22微升rapid-flow装置过滤。最终溶液中缓冲液a的残留率应小于0.25％。置换后的trs005原液可储存在2-8℃。
最终得到dar约为3.2的抗体偶联药物trs005，抗体偶联药物的载药量鉴定结果如图3所示。
实施例5抗体偶联药物(trs005)制备一致性实验
重复实施例2，得到三个批次的产品。分别为：
c_16205_20160106001
c_16205_20160106002
c_16205_20160106003
三个批次的dar精确控制在4.2±0.3。三个批次的c4-rplc色谱和疏水作用色谱分别如图4和图5所示。
结果表明：采用本发明的制备方法制得的不同批次的抗体偶联药物的一致性很好。
实施例4抗体偶联药物(trs005)内吞流式细胞术检测方法
1.试剂与细胞
鞘液：过滤去离子水；
dpbs(1x)：购自gibco，货号：14190-136；
抗人igg抗体(fitc)，购自abcam，货号：ab81051；
raji细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号：tchu44。
ramos细胞购自南京科佰生物科技有限公司。
2.设备
bdaccuric6流式细胞仪：购自bdbiosciences公司。
3.方法
仪器开机：放置一管新取的超纯水于流式细胞仪的进样针处，开机，使用fast模式对仪器用水进行冲洗5分钟，依照仪器说明书分别配制8-peaks和6-peaks的质控样品，对流式细胞仪的四个通道进行校验，备用。
细胞准备：取对数生长期的raji细胞或ramos细胞，1000rpm离心5分钟，使用dpbs重悬，调整活细胞密度为2x106细胞/ml，分至1.5ml离心管中，1ml/管。
样品稀释：将待检测样品(trs005rs，dar约为4.2的trs005)稀释至1000μg/ml，在每支1ml的细胞悬液中加入10μl，吹打混匀，使得样品的终浓度为10μg/ml。
抗体结合：将加入样品的细胞悬液放置于冰上，冰浴30分钟。
内吞：冰浴结束后，将细胞悬液离心，1500rpm离心5分钟，弃上清，使用1ml预冷的dpbs重悬，以200μl/管的体积分至4支1.5ml离心管中，1支作为阴性对照组放置于冰上冰浴，3支作为平行实验组放置于37℃水浴。孵育2h。
染色：将二抗抗人igg抗体(fitc标记)使用dpbs稀释100倍。孵育结束后，将细胞悬液离心，1500rpm离心5分钟，弃上清，使用250μl预冷的dpbs重悬，在悬液中各加入50μl的稀释后的二抗溶液，吹打混匀，放置于冰上冰浴30分钟。
仪器检测：冰浴结束后，将细胞悬液离心，1500rpm离心5分钟，弃上清，使用200μl预冷的dpbs重悬，上机检测。
使用冰浴处理的阴性对照组的细胞进行圈门，记录各管细胞在fl1的平均荧光强度。细胞的流式细胞术散点图和单参数直方图分别如图6a、图6b所示。
根据平均荧光强度按以下计算公式计算样品的内吞比例。
样品内吞比例％＝(阴性对照组的平均荧光强度-实验组的平均荧光强度的平均值)/阴性对照组的平均荧光强度×100％
ramos细胞和raji细胞的内吞结果分别如图6c、图6d所示。结果表明：本发明的抗体偶联药物trs005的内吞效果很好。
实施例5肿瘤细胞抑制实验
1.试剂
rpmi1640，购自gibco，货号11875-093；
fbs，购自cellmax，货号sa212.02；
链霉素/青霉素双抗，购于hyclone公司，批号：sv30010；
dpbs(dulbecco's磷酸盐缓冲溶液)购于gibco,货号14190-136；
cck-8试剂，购自biolite，货号35004。
2.细胞
raji细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号：tchu44。
3.方法
细胞培养与铺板：选取对数生长期的活率大于80％的30代之前的raji细胞进行实验。从培养瓶中取出raji细胞加入到50ml离心管吹打混匀。1000转每分钟(约188g)离心5-6分钟。弃上清，用适当体积的稀释液重悬细胞。计数，用预热的完全培养基(rpmi1640+10％fbs+1％双抗(链霉素与青霉素))调节细胞密度至约8×105细胞/ml用于细胞铺板，在每个目标孔内加入50μl细胞，在边缘孔加入100μl无菌水或者dpbs。放入二氧化碳培养箱，37℃5％co2孵育。
样品稀释：将trs005标准品(一个批次的经标定的dar约为4.2的trs005产品)，样品(一个批次的未经标定的、dar约为4.2的trs005产品)和qc80％(浓度稀释至80％的dar约为4.2的trs005)分别稀释到60，60和48μg/ml，然后用96孔板进行梯度稀释，使用完全培养基进行3倍的梯度稀释。
加样孵育：将稀释好的标准品、样品和qc从稀释板中取出每孔50μl加入细胞板中。将细胞板放入二氧化碳培养箱孵育72小时左右。
显色：孵育结束后，每孔加入10μlcck-8试剂进行显色，置于二氧化碳培养箱孵育3-4个小时。
读板：将板载入酶标仪，以450nm作为读板波长，650nm作为参比波长进行读板。
数据处理：以浓度值为横坐标，450nm吸光值扣除650nm吸光值的差值为纵坐标，使用四参数拟合模型y＝(a-d)/(1+(x/c)b)+d来对数据进行分析，其中，a表示曲线上渐近线估值；b表示曲线的斜率；d表示曲线下渐近线估值；c值即为其ec50值。
结果如图7所示。结果表明：本发明制备的抗体偶联药物的细胞毒性实验很稳定，且肿瘤细胞抑制效果很好。
实施例6体内抗肿瘤活性
1.试验动物和饲养环境
种属：balb/c裸鼠
动物性别：雄鼠
购入时周龄：4-5周
饲养环境：spf级
2.细胞
ramos细胞购自南京科佰生物科技有限公司。
daudi细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
prmi1640培养基购自康宁公司(corning)生产批号：04216004。
3.试验方法
在5％co2、37℃无菌条件下，分别用含10％胎牛血清的prmi1640培养基培养并扩增ramos细胞和daodi细胞至6.0×108个，离心收集细胞调整浓度与
待平均肿瘤体积长至100-150mm3时，随机分组：
阴性对照组：载体(vehicle)；
利妥昔单抗组：美罗华(3mg/kg)；
美罗华(6mg/kg)；
利妥昔单抗和毒素混合组：美罗华+mmae(3mg/kg)；
trs005dar4.2(0.75mg/kg)组：trs005(0.75mg/kg)；
trs005dar4.2(1.5mg/kg)组；trs005(1.5mg/kg)；
trs005dar4.2(3mg/kg)组；trs005(3mg/kg)。
每组10只裸鼠。然后采用尾静脉给药方式开始给药，给药过程中测量并记录balb/c裸鼠体重和肿瘤长、短径。
肿瘤体积计算公式：＝长径×短径×短径/2
4.统计分析
瘤体积和重均采用数±标准差(mean±sd)表示)。统计学检验用单因素方差分析(anova)，p<0.05为有显著性差异，p＜0.01为有非常显著性差异。
5.结果：
trs005对ramos和daudi移植瘤balb/c裸鼠模型显示出非常显著的治疗效果(见图8、图9、图10、图11),疗效是美罗华的6-8倍。
图8和图9说明trs005与利妥昔单抗组(rituximab,美罗华)相比疗效有显著性差异。其中：trs005(3mg/kg)组抑瘤率100％，trs005(0.75mg/kg)组比rituximab(6mg/kg)组抑瘤率接近，甚至还稍好。
图10和图11说明trs005与利妥昔单抗组(rituximab,美罗华)相比疗效有显著性差异。其中：trs005(3mg/kg)组抑瘤率100％，trs005(0.75mg/kg)组比rituximab(6mg/kg)组抑瘤率接近，甚至还稍好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。