本发明涉及了一种黄酮类化合物及其制备方法，尤其是涉及了一种桑黄抗癌活性黄酮类化合物pbf-2及其制备方法与应用。
背景技术：
黄酮类化合物广泛存在于动植物体中，可分为黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮、查尔酮等多种类型，不同的动植物种类及部位存在不同的黄酮类化合物类型。天然黄酮类化合物具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、解热、保肝等广泛的药理作用，并且毒副作用小，深受国内外研究者高度关注，被广泛应用于医药、食品等领域中。
桑黄(phellinusbaumii)是一种珍贵的药用真菌子实体，因寄生于桑树而得名，有“森林黄金”的美誉。桑黄具有抗癌、抗炎症、抗氧化、降血糖、免疫调节、护肝等多种药理作用，尤其抗癌效果极其显著，但桑黄的抗癌机理还不清楚，这阻害了桑黄药用水平提高及药用范围扩大。分离纯化制备桑黄抗癌活性成分，对于推进桑黄药用开发具有积极的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种桑黄抗癌活性黄酮类化合物pbf-2及其制备方法与应用，是采用回流提取、乙酸乙酯萃取、ab-8大孔树脂柱分离纯化的方法，制备桑黄抗癌活性黄酮类化合物pbf-2。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一、一种桑黄抗癌活性黄酮类化合物pbf-2的制备方法：
1)将桑黄子实体处理获得桑黄子实体粉；
2)取桑黄子实体粉加入乙醇溶液并进行超声处理；
3)超声处理后的溶液依次进行水浴回流和抽滤处理，然后离心处理后收集上清液；
4)上清液浓缩后萃取，再浓缩回收得到粗黄酮类化合物液；
5)用乙醇溶液将粗黄酮类化合物液进行稀释，离心取上清液后，过滤膜再上ab-8大孔树脂柱吸附处理；
6)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥后得到均一的黄酮类化合物组分，取名pbf-2。
所述步骤2)、5)和6)中的乙醇溶液均为含有80％质量分数乙醇的水溶液。
本发明方法的工艺条件具体为：
1)桑黄子实体于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，过80～100目筛，得到桑黄子实体粉；
2)取桑黄子实体粉，按w：v为1:40加入质量分数为80％的乙醇溶液，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500w功率53khz频率的超声波磁场作用30min；
3)于100℃水浴中回流提取3次，每次1.5～2.0h，集中收集三次的提取液，三次提取液经过合并后用抽滤机进行抽滤处理，弃掉滤渣，将滤液用高速离心机于10000rpm下离心5min，弃掉沉淀，收集上清液；
4)上清液用旋转蒸发仪浓缩，用乙酸乙酯萃取3次，收集并合并三次萃取液，用旋转蒸发仪浓缩并回收溶剂，得到粗黄酮类化合物液；
5)用分光光度法测定粗黄酮类化合物液中黄酮类化合物含量，根据测定的含量用质量分数为80％的乙醇溶液进行稀释，使得黄酮类化合物质量浓度调整为1.2～1.4mg/ml溶液，再将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上ab-8大孔树脂柱吸附，用蒸馏水冲洗直到流出液为无色；
6)用质量分数为80％的乙醇溶液于1.5～2.0ml/min流速下洗脱，用自动收集器收集，根据分光光度法测定结果收集具有黄酮类化合物的洗脱峰的洗脱液，-50℃下真空干燥，得到均一的黄酮类化合物组分pbf-2。
所述步骤4)中的乙酸乙酯体积是浓缩后溶液体积的2倍。
二、由上述方法制备而成的桑黄抗癌活性黄酮类化合物在抗癌中的应用。
所述抗癌中的应用是针对人宫颈癌细胞hela和人胃癌细胞sgc-7901，具体是抑制癌细胞生长的作用。
本发明具有的有益效果是：
本发明分离纯化制备的桑黄抗癌活性黄酮类化合物pbf-2，纯度均一，对人宫颈癌细胞hela和人胃癌细胞sgc-7901的生长均表现出明显的抑制作用，对正常细胞人胚胎肾细胞hek293和小鼠巨噬细胞raw264.7生长均无不良影响，可用于抗癌产品的开发，这对于提升桑黄药用价值，具有积极的社会效益和经济效益。
附图说明
图1是实施例1的pbf-2对人宫颈癌细胞hela和人胃癌细胞sgc-7901生长的抑制图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施之前，先将桑黄子实体于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，过80～100目筛，得到桑黄子实体粉，用于以下各个实施例。
本发明实施例采用mtt法检测pbf-2对人宫颈癌细胞hela和人胃癌细胞sgc-7901的生长情况，来验证本发明制备产物是否具有其技术效果。
实施例1：
取过80目筛的桑黄子实体粉，按1：40料液比加入质量分数为80％的乙醇溶液，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500w功率53khz频率的超声波磁场作用30min。
于100℃水浴中回流提取3次，提取液用乙酸乙酯，每次1.5h，集中收集三次的提取液，三次提取液经过合并后用抽滤机进行抽滤处理，弃掉滤渣，将滤液用高速离心机于10000rpm下离心5min，弃掉沉淀，收集上清液。
上清液用旋转蒸发仪浓缩，用乙酸乙酯萃取3次，收集并合并三次萃取液，用旋转蒸发仪浓缩并回收溶剂，得到粗黄酮类化合物液。
用分光光度法测定粗黄酮类化合物液中黄酮类化合物含量为2.85mg/ml，粗黄酮类化合物用质量分数为80％的乙醇溶液调整质量浓度为1.3mg/ml，再将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上ab-8大孔树脂柱吸附，用蒸馏水冲洗直到流出液为无色。
再用质量分数为80％的乙醇溶液于1.8ml/min流速洗脱，自动收集器收集，减压浓缩，用分光光度法测定，收集具有黄酮类化合物的洗脱峰的洗脱液，-50℃下真空干燥，得到黄酮类化合物pbf-2，pbf-2纯度均一。
针对两种癌细胞，本实施例得到的黄酮类化合物pbf-2分别配成0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml和0.3mg/ml不同浓度下对sgc-7901和hela的生长进行实验，并增加常用抗癌药物氟尿嘧啶5-fu作为阳性对照。
实验后发现，本实施例得到的黄酮类化合物pbf-2在浓度0.3mg/ml时对hela和sgc-7901的抑制率分别为92.75％和97.12％(如图1所示，图中柱上字母不同表示两者间差异达显著水平)，对正常细胞人胚胎肾细胞hek293和小鼠巨噬细胞raw264.7生长无不良影响，相比常用抗癌药物氟尿嘧啶5-fu能够达到相等的抑制作用。
实施例2：
取过100目筛的桑黄子实体粉，按1：40料液比加入质量分数为80％的乙醇溶液，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500w功率53khz频率的超声波磁场作用30min。
于100℃水浴中回流提取3次，提取液用乙酸乙酯，每次1.8h，集中收集三次的提取液，三次提取液经过合并后用抽滤机进行抽滤处理，弃掉滤渣，将滤液用高速离心机于10000rpm下离心5min，弃掉沉淀，收集上清液。
上清液用旋转蒸发仪浓缩，用乙酸乙酯萃取3次，收集并合并三次萃取液，用旋转蒸发仪浓缩并回收溶剂，得到粗黄酮类化合物液。
用分光光度法测定粗黄酮类化合物液中黄酮类化合物含量为2.81mg/ml，粗黄酮类化合物用质量分数为80％的乙醇溶液调整质量浓度为1.2mg/ml，再将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上ab-8大孔树脂柱吸附，用蒸馏水冲洗直到流出液为无色。
再用质量分数为80％的乙醇溶液于1.5ml/min流速洗脱，自动收集器收集，减压浓缩，用分光光度法测定，收集具有黄酮类化合物的洗脱峰的洗脱液，-50℃下真空干燥，得到黄酮类化合物pbf-2。
本实施例的pbf-2纯度均一，在浓度0.3mg/ml时对hela和sgc-7901的抑制率分别为92.75％和97.12％(与实施例1中的图1相似)，对正常细胞人胚胎肾细胞hek293和小鼠巨噬细胞raw264.7生长均无不良影响，相比常用抗癌药物氟尿嘧啶5-fu能够达到相等的抑制作用。
实施例3：
取过90目筛的桑黄子实体粉，按1：40料液比加入质量分数为80％的乙醇溶液，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500w功率53khz频率的超声波磁场作用30min。
于100℃水浴中回流提取3次，提取液用乙酸乙酯，每次2.0h，集中收集三次的提取液，三次提取液经过合并后用抽滤机进行抽滤处理，弃掉滤渣，将滤液用高速离心机于10000rpm下离心5min，弃掉沉淀，收集上清液。
上清液用旋转蒸发仪浓缩，用乙酸乙酯萃取3次，收集并合并三次萃取液，用旋转蒸发仪浓缩并回收溶剂，得到粗黄酮类化合物液。
用分光光度法测定粗黄酮类化合物液中黄酮类化合物含量为2.83mg/ml，粗黄酮类化合物用质量分数为80％的乙醇溶液调整质量浓度为1.4mg/ml，再将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上ab-8大孔树脂柱吸附，用蒸馏水冲洗直到流出液为无色。
再用质量分数为80％的乙醇溶液于2.0ml/min流速洗脱，自动收集器收集，减压浓缩，用分光光度法测定，收集具有黄酮类化合物的洗脱峰的洗脱液，-50℃下真空干燥，得到黄酮类化合物pbf-2。
本实施例的pbf-2纯度均一，在浓度0.3mg/ml时对hela和sgc-7901的抑制率分别为92.75％和97.12％(与实施例1中的图1相似)，对正常细胞人胚胎肾细胞hek293和小鼠巨噬细胞raw264.7生长均无不良影响，相比常用抗癌药物氟尿嘧啶5-fu能够达到相等的抑制作用。