胃泌素在制备诊断和治疗乳腺癌药物中的应用的制作方法

本发明属于生物制药领域，更具体地讲，涉及胃泌素在制备诊断和治疗乳腺癌药物中的应用。

背景技术：

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重影响女性的生活质量[1]。乳腺癌根据不同标准有不同的分型，如根据不同受体表达情况可分为her2+,her2-,三阴性等。当前对于乳腺癌的病因尚未完全明了，临床上治疗乳腺癌的方法有手术、化疗、内分泌等，但都有一定的局限性。因此阐明乳腺癌发病的分子机制，研发新的靶向治疗药物，探索新的治疗方案将成为今后乳腺癌治疗的主要方向。

胃泌素作为最早发现的胃肠激素之一，是一种多肽激素，由位于胃窦、十二指肠和上段空肠的g细胞分泌，此外，人胰岛中的d细胞也能分泌胃泌素[2]，主要调节胃酸分泌及营养胃黏膜。胃泌素包括g-17、g-34两种，其中g-17是胃泌素的主要形式，也是膳食后胃泌素存在于血液循环中的主要形式[3]。g-17活性最高，约为g-34的5倍[4,5]，而g-34则主要存在于血液，其分解成g-17才能发挥生理功能。本实验以g-17作为试剂，以期更接近并反映胃泌素的生物学作用规律。胃泌素受体，又称缩胆囊素b受体(cholecystokininbreceptor,cckbr)，它属于g蛋白偶联受体(g-proteincoupledreceptors，gpcrs)家族，是一个七次跨膜蛋白。cckbr主要分布在胃粘膜的壁细胞和ecl细胞中[6,7]。胃泌素主要通过与细胞膜上的cckbr特异性结合启动下游信号通路发挥作用[8]。研究表明，胃泌素不仅具有刺激胃酸分泌及营养胃肠粘膜的作用，而且还影响胃肠肿瘤的增殖[9]，但是对于胃泌素与恶性肿瘤之间的关系目前还存在着许多争议。部分研究认为胃泌素是重要的促癌激素，可以通过上调reg1蛋白等促进胃泌素受体阳性的癌细胞增长[10-12]。也有研究发现胃泌素可以通过抑制colo320细胞内nf-κb的活性来有效抑制结肠肿瘤的增殖[13-15]。本课题组的早期研究发现胃癌组织中胃泌素的表达水平低于癌旁组织[16]，胃癌患者的血清胃泌素水平与其肿瘤直径成负相关，并通过体外及体内实验证实胃泌素能有效抑制胃癌细胞的增殖。此外，近年来本课题组研究发现胃泌素，曲妥珠单抗在her2阳性及阴性的胃癌细胞中通过上调cckbr均有抗肿瘤作用[17]，这为我们的研究提供了思路。

欧阳可栋等人的“胃泌素释放肽dna疫苗抑制emt6乳腺癌生长的实验研究”[18]观察胃泌素释放肽(grp)dna疫苗对emt6小鼠乳腺癌生长的抑制作用，胃泌素释放肽和胃泌素是不同的两个物质，具有完全不相同的蛋白序列。

胃泌素释放肽，英文全称gastrin-releasingpeptide(grp)，在胰腺表达最丰富，其次在胃、肾上腺皮质和脑都有表达。胃泌素释放肽与grp受体(grpr)结合，调节中枢神经系统和胃肠等脏器的许多功能，包括胃肠道激素的释放(胃泌素gastrin属于其中一种)，平滑肌细胞收缩，上皮细胞增殖和肿瘤组织。也就是说胃泌素释放肽作用很广，其中一个作用是刺激胃窦部及十二指肠近端黏膜中g细胞分泌释放胃泌素。胃泌素释放肽在乳腺癌中的应用，主要是该肽的受体gastrin-releasingpeptidereceptor(grpr)在肿瘤组织的表达，通过胃泌素释放肽疫苗激活机体免疫反应，而我们的技术是研究直接运用胃泌素治疗乳腺癌，是两个不同概念。

[1].siegelrl,millerkd,jemala.

cacancerjclin.2016jan-feb；66(1):7-30.doi:10.3322/caac.21332.pmid:26742998

[2].wuc.y.,wum.s.,kuok.n.,etal.,effectivereductionofgastriccancerriskwithregularuseofnonsteroidalanti-inflammatorydrugsinhelicobacterpylori-infectedpatients.jclinoncol,2010.28(18):p.2952-7.

[3].grabowska,a.m.andwatson,s.a.roleofgastrinpeptidesincarcinogenesis.cancerlett2007,257:1-15.

[4].邹继红，李金瑞，张忠平。胃泌素研究的新进展(文献综述)。放射免疫学杂志，1995，04：251-253。

[5].grabowska,a.m.,watson,s.a..roleofgastrinpeptidesincarcinogenesis.cancerlett,2007,257(1):1-15.

[6].chena.p.,changm.h.,andromerom.f.,functionalanalysisofnonsynonymoussinglenucleotidepolymorphismsinhumanslc26a9.hummutat,2012.33(8):p.1275-84.

[7].sachsg.,zengn.,andprinzc.,physiologyofisolatedgastricendocrinecells.annurevphysiol,1997.59:p.243-56.

[8].schubert,m.l.,peura,d.a.controlofgastricacidsecretioninhealthanddisease.gastroenterology,2008,134(7):1842-60.

[9].ashcroftf.j.,varroa.,dimaliner.,etal.,controlofexpressionofthelectin-likeproteinreg-1bygastrin:roleoftherhofamilygtpaserhoaandac-richpromoterelement.biochemj,2004.381(pt2):p.397-403.

[10].watsons.a.andsmitha.m.,hypergastrinemiapromotesadenomaprogressionintheapc(min-/+)mousemodeloffamilialadenomatouspolyposis.cancerres,2001.61(2):p.625-31.

[11].schubertm.l.andpeurad.a.,controlofgastricacidsecretioninhealthanddisease.gastroenterology,2008.134(7):p.1842-60.

[12].sebensmuerkosters.,rauscha.v.,isbernera.,etal.,theapoptosis-inducingeffectofgastrinoncolorectalcancercellsrelatestoanincreasediex-1expressionmediatingnf-kappabinhibition.oncogene,2008.27(8):p.1122-34.

[13].muerkosters.,isbernera.,arlta.,etal.,gastrinsuppressesgrowthofcck2receptorexpressingcoloncancercellsbyinducingapoptosisinvitroandinvivo.gastroenterology,2005.129(3):p.952-68.

[14].obszynskaj.a.,atherfoldp.a.,nanjim.,etal.,long-termprotonpumpinducedhypergastrinaemiadoesinducelineage-specificrestitutionbutnotclonalexpansioninbenignbarrett'soesophagusinvivo.gut,2010.59(2):p.156-63.

[15].tomitah.,takaishis.,menheniottt.r.,etal.,inhibitionofgastriccarcinogenesisbythehormonegastrinismediatedbysuppressionoftff1epigeneticsilencing.gastroenterology,2011.140(3):p.879-91.

[16].przemecks.m.,varroa.,berryd.,etal.,hypergastrinemiaincreasesgastricepithelialsusceptibilitytoapoptosis.regulpept,2008.146(1-3):p.147-56.

[17].tianh.,zhangn.,suow.h.,etal.,gastrinsuppressestheinterdependentexpressionofp16andanionexchanger1favoringgrowthinhibitionofgastriccancercells.intjcancer,2010.127(6):p.1462-74.

[18].欧阳可栋，过为，吴国君，张舒亚，刘景晶。胃泌素释放肽dna疫苗抑制emt6乳腺癌生长的实验研究。中国临床药理学与治疗学，2007，05：512-515。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供胃泌素在制备诊断和治疗乳腺癌药物中的应用。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：胃泌素在制备诊断和治疗乳腺癌药物中的应用。

作为一个优选方案，所述胃泌素是指胃泌素全序列、活性形式17肽和活性形式34肽中的一种或几种。

作为一个优选方案，所述乳腺癌是指具有胃泌素受体cckbr的乳腺癌。

本发明的优点在于：我们发现胃泌素在乳腺癌细胞系mcf-7、t47d中均有抗肿瘤作用，体内实验亦进一步证实该作用，其分子机制考虑为胃泌素通过上调cckbr蛋白丰度，上调的cckbr受体与胃泌素相结合启动并放大对下游信号分子的影响是胃泌素抗肿瘤增殖的关键环节。本发明为阐明乳腺癌发病分子机制，研发新的靶向治疗药物，探索乳腺癌新的治疗方案提供方向。

附图说明

图1不同乳腺癌细胞株中cckbr蛋白的表达情况。

图2乳腺癌组织中cckbr蛋白的表达情况。

图3胃泌素对乳腺癌细胞的增殖抑制作用。

图4胃泌素在mcf-7、t47d中上调cckbr蛋白丰度。

图5胃泌素在mcf-7、t47d中上调erk，p65蛋白丰度。

图6胃泌素抑制裸鼠胃癌荷瘤增殖。

图7胃泌素促进荷瘤组织的cckbr表达。

图8胃泌素影响裸鼠荷瘤组织蛋白p-erk，p-p65表达。

图9乳腺癌患者血中胃泌素水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.

1材料与方法

1.1实验材料、试剂

(1)细胞株：mcf-7、t47d、mdamb231三种乳腺癌细胞株

(2)胎牛血清(gibcobrl,gaithersburg,md,usa)

(3)dmem培养基(hyclone,logan,ut,usa)

(4)penicillinstreptomycin(invitrogen,ca,usa)

(5)0.25％trypsin-edta(gibco,lifetechnologies,usa)

(6)桦木酸(betulinicacid,biovision,mountainview,ca,usa)

(7)parthenolide(santacruzbiotechnology,santacruz,ca,usa)

(8)兔抗p65、兔抗p-p65、兔抗erk及p-erk抗体(cellsignalingtechnology,

everly,ma,usa)

(9)鼠抗vinculin抗体(abcam,cambridge,uk)

(10)hrp-兔二抗、鼠二抗(sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)

(11)即用型免疫组织化学超敏ultrasensitivetmsp试剂盒、dab显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司，中国)

(12)蛋白酶抑制剂(sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)

(13)胃泌素(gastrin)(强耀生物，上海，中国)

(14)脂多糖(lps)(sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)

(15)pd98059(sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)

(16)快捷型羊抗兔/鼠通用二抗(迈新生物技术开发有限公司，福建，中国)

(17)ripa裂解液(碧云天生物技术研究所，江苏，中国)

(18)2×rnaloadingdye(fermentasins,burlington,canada)

1.2主要仪器设备

(1)co2细胞培养箱(thermofisherscientific,usa)

(2)细胞超净工作台(thermofisherscientific,usa)

(3)恒温摇床(forma,milford,ma)

(4)低温高速离心机(eppendorf,germany)

(5)全自动包埋机(leica,wetzlar,germany)

(6)石蜡切片机(leica,wetzlar,germany)

(7)普通光学显微镜(olympus,tokyo,japan)

(8)电泳槽、转膜槽(bio-rad,usa)

(9)隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂，中国)

(10)电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司，中国)

(11)milli-q超纯水纯化系统(merckmillipore,usa)

(12)ph计(cyberscan,usa)

(13)fluorcheme扫膜仪(cellbiosciences,usa)

(14)低温冰箱(sany,japan)

(15)酶标仪(thermo,usa)

1.3主要试剂配制

1.3.1常规细胞培养液：

dmem培养液：dmem+10％胎牛血清

1.3.2细胞冻存液：

90％胎牛血清+10％dmso

1.3.3蛋白转膜缓冲液：

称取trisbase3.04g，甘氨酸14.4g，加双蒸水600ml溶解，再加甲醇200ml，最后量筒定容至1l，4℃冷藏保存。

1.3.4sds-page电泳缓冲液：

称取trisbase3.03g，甘氨酸18.77g，sds1g，加双蒸水溶解，量筒定容至1l。

1.3.5tbst(tris-bufferedsalineandtween-20)：

秤取nacll8g，1mtris-hcl(ph7.6)20ml及tween-201ml，加双蒸水量筒定容至1l。

1.3.6westernblot封闭液：

用tbst和光明脱脂奶粉配成10％(w/v)westernblot封闭液(例：50mltbst+5.0g脱脂奶粉)。

1.3.7westernblot清洗液

用tbst和光明脱脂奶粉配2％(w/v)westernblot清洗液(例：100mltbst+2.0g脱脂奶粉)。

1.3.8抗原修复缓冲液的配制：

(1)柠檬酸盐储存液的配制：

0.1m柠檬酸缓冲液a：每升含柠檬酸21g；

0.1m柠檬酸钠缓冲液b：每升含柠檬酸钠29.4g。

(2)柠檬酸盐工作液的配制：

0.01m柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)：每升含a液19ml、b液81ml，加蒸馏水溶解，调ph值至6.0，量筒滴定至1l。

1.4细胞复苏

(1)将-80℃冰箱中冻存的细胞冻存管于42℃水浴中迅速圆周式摇晃，尽量于1分钟内融化冻存管中细胞液；

(2)冻存管口酒精灯火焰灭菌后，将细胞液移入无菌的15ml离心管中，800rpm，室温(roomtemperature，rt)，离心5min，可见细胞团块沉积在管底；

(3)弃去上清，加入4ml1×pbs缓冲液(ph7.4)，轻轻吹打混匀后，800rpm，rt，离心5min；

(4)弃去上清，用2mldmem培养基(含10％胎牛血清)吹打成单悬的悬浮细胞，将细胞液转移到细胞培养皿中，加入10ml培养基，于含5％co2和95％o2混合气体的37℃培养箱中培养。

1.5细胞培养

(1)细胞于dmem培养基(含10％胎牛血清)中常规培养，孵育在含5％co2和95％o2混合气体的37℃培养箱里；

(2)根据细胞倍增时间的不同给予不同的处理，平均每2-3天传代一次，以保持细胞一直处于对数生长期；

(3)培养的细胞在实验期间进行支原体检测，结果均为阴性；经台盼蓝染色分析细胞活力保持在90％以上。

1.6细胞传代

(1)取拟传代的细胞，弃去培养液，加入1×pbs缓冲液(ph7.4)轻轻摇晃漂洗细胞表面，共2次，以去除培养基中的血清成分对胰酶消化细胞能力的影响；

(2)弃去1×pbs缓冲液(ph7.4)，加入适量的胰酶(0.25％trypsin-edta)，在含5％co2和95％o2混合气体的37℃培养箱中孵育数分钟；

(3)倒置相差显微镜下观察细胞形态，待细胞失去原有形态，变小变圆，呈透亮状，处于半贴壁状态未脱落时，考虑消化良好，弃去胰酶，加入适量培养基终止消化反应；

(4)用1ml枪头轻柔吹打细胞至单悬，将细胞分入其他培养皿中(通常为1:2或1：3传代)，并加入足量培养基后置于培养箱内，完成细胞传代。

1.7细胞冻存

(1)需要冻存的细胞，应保持其处于细胞对数生长期，活力在90％以上；

(2)当细胞培养至汇合率90％-95％时，弃掉培养液，用预热的1×pbs缓冲液(ph7.4)清洗细胞2遍，加入适量胰酶消化细胞；

(3)将消化后的细胞移入无菌的15ml离心管中，800rpm，rt，离心5min，细胞沉积在管底；

(4)弃去上清，用预热的1×pbs缓冲液(ph7.4)清洗细胞，800rpm，rt，离心5min；

(5)弃去上清，加入1ml细胞冻存液，轻柔吹打细胞至单细胞悬液后移入冻存管中，详细标记冻存细胞的名称、来源、冻存日期等，于-20℃冰箱放置30分钟后转移至-80℃冰箱放置过夜，最后移入液氮罐中长期保存。

1.8细胞计数实验

将处于对数增长期的乳腺癌细胞mcf-7，t47d，231设置成对照组、胃泌素组分别种板3000个/孔于96孔板中，每组设置3个复孔，24小时细胞贴壁后根据需要予以不同浓度药物处理，日给药一次，连续7日每日进行细胞计数

1.9蛋白质印迹法

蛋白印迹实验(westernblot)沿用已有的实验方法，具体步骤如下：

(1)收蛋白：取对数生长期的细胞，经预冷的1×pbs缓冲液(ph7.4)清洗两次，根据细胞密度加入适量的含dtt的2×sds蛋白裂解液，用枪头充分混匀，彻底裂解蛋白，吸取细胞蛋白收集到1.5mlep管中，置于冰上30min，使蛋白充分裂解；

(2)蛋白变性：type17600dri-bath温度调节至95℃，将收有细胞蛋白的ep管置于金属浴锅内煮10min，冰上放置10min，重复两次，使蛋白彻底变性；

(3)提取蛋白上清：蛋白再经95℃煮10min后，12,000rpm，rt，离心5min，弃沉淀，将蛋白上清移入另一干净的ep管中；

(4)蛋白定量：蛋白经bca法测浓度进行定量，用sds配制成一样的体积、一样的总量后后分装保存在-80℃；

(5)配胶：根据目的蛋白分子量大小，配制相应的6％～12％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)，通过电泳进行蛋白分离；

(6)蛋白上样：将分装的蛋白从-80℃取出，于95℃金属浴锅内煮10min，将样品加入凝胶孔内，同时每孔加入1ul溴酚蓝示踪；

(7)电泳：完成上样后，首先用80v电压进行电泳至溴酚蓝示踪条带至分离胶时变换电压为120v，直至溴酚蓝示踪条带到达电泳槽底部时，终止电泳；

(8)转膜：取出电泳胶，去除积层胶后在预冷的转膜液中进行转膜，将含有蛋白质的分离胶平放在westernblot专用三明治式转膜夹中夹紧，安放顺序由负极至正极依次为黑板、海绵、滤纸、分离胶、硝酸纤维素膜(nitrocellulosemembrane,nc膜)、滤纸、海绵及白板；转膜采用湿转法，根据实验要求选择恒流300ma或恒压100v，转膜时间根据蛋白质分子量设定为60至100min，将蛋白转移至nc膜上；

(9)丽春红染色：转膜结束后取出nc膜，将与分离胶接触的一面朝上，剪右上角作为标记，用tbst将nc膜漂洗一次置于抗体孵育盒中，丽春红染色大致评估蛋白电泳、转膜及蛋白定量情况；

(10)漂洗：用tbst快速漂洗nc膜3次，将丽春红洗净，然后将抗体孵育盒置于360度摇床上，用tbst漂洗nc膜约10min，充分洗涤至丽春红染色褪尽；

(11)封闭：漂洗后的nc膜孵育在westernblot封闭液(tbst配制10％脱脂奶粉)中，水平摇床上室温孵育1小时，以封闭nc膜上的非特异性结合位点；

(12)孵育一抗：结束封闭后，将nc膜孵育在用westernblot洗涤液配制的与目的蛋白相应的一抗中，水平摇床，rt，孵育2h，或者4℃孵育过夜；

(13)洗涤：一抗孵育结束后，tbst快速漂洗nc膜3次，然后置于360度摇床上再用westernblot洗涤液(tbst配制的2％脱脂奶粉)洗涤3次，室温，每次10min；

(14)孵育二抗：充分洗涤残余的一抗后，将nc膜置相应的hrp标记的二抗中，rt，孵育1h；

(15)洗涤：二抗孵育结束后，westernblot洗涤液(tbst配制的2％脱脂奶粉)快速漂洗nc膜3次，然后置于360度摇床上再次洗涤3次，rt，每次10min；

(16)显像：将洗涤后的nc膜用immobilonwesternchemilminescenthrpsubstrate试剂进行显影，抗原抗体复合物与显影剂结合，可在凝胶成像仪上显像。

1.10免疫组织化学染色分析

全部标本经10％福尔马林常规固定，石蜡包埋处理，切成4μm组织切片，具体免疫组织化学染色实验参照已有的实验方法，具体步骤如下：

(1)烤片：组织切片置入60℃恒温烤箱中烘烤30过夜；

(2)脱蜡：切片在45℃二甲苯i中放置20min，二甲苯ii中放置30min；

(3)水化：将切片依次放入100％乙醇i、100％乙醇ii、95％乙醇i和95％乙醇ii中，各2min；

(4)取出切片，用自来水冲洗残留乙醇后于自来水中静置1min，换单蒸水静置1min；

(5)抗原修复：将切片置修复盒中，加入抗原修复液(柠檬酸盐缓冲液)，盖好盒盖，微波炉加热90℃3min至缓冲液沸腾，再以60℃维持12min；

(6)取出抗原修复盒，打开盒盖，于室温下静置抗原修复液，一直到温度下降至室温为止；

(7)弃去抗原修复液，将切片移入染色缸内，加入1×pbs缓冲液(ph7.4)，温和冲洗切片3次，每次5min；

(8)弃去pbs，加入新鲜配制的3％双氧水，室温下孵育10min，以去除内源性过氧化物酶的影响；

(9)弃去3％双氧水，用1×pbs缓冲液(ph7.4)温和冲洗切片3次，每次5min；

(10)将切片移入湿盒中，切片上滴加5％bsa(双蒸水配制)，室温孵育30min，封闭非特异性结合位点；

(11)弃去5％bsa，直接在切片组织上滴加由5％bsa稀释的一抗，37℃孵育1h，或4℃孵育过夜；

(12)一抗孵育完成后，用1×pbs缓冲液(ph7.4)温和冲洗切片3次，每次10min；

(13)弃去1×pbs缓冲液(ph7.4)，在切片组织上滴加hrp标记的二抗，室温孵育15min；

(14)二抗孵育完成后，用1×pbs缓冲液(ph7.4)温和冲洗切片3次，每次10min；

(15)用新鲜配置的二氨基联苯胺溶液(dab)室温孵育显色，显微镜下观察显色情况；

(16)双蒸水冲洗切片，去除残留的dab；

(17)将切片移入染色缸内，用苏木素染液进行细胞核的复染，室温下放置1min；

(18)回收苏木素染液，以自来水冲洗切片数次，去除残留的苏木素，在50℃到60℃的自来水中静置5-10min，进行反蓝；

(19)反蓝完成后，用自来水洗切片，再依次经过95％乙醇i、95％乙醇ii、100％乙醇i、100％乙醇ii进行切片脱水，各1min，室温下彻底晾干；

(20)晾干的切片在二甲苯i、二甲苯ii中各放置5min，进行切片透明，晾干；

(21)最后在切片样本上滴加中性树胶封片，后置光学显微镜下观察；

(22)结果判断：棕黑色染色颗粒为阳性表达。

1.11药物干预裸鼠荷瘤增殖实验

本研究实验用鼠均为雌性balb/c裸鼠(约4～6周)，体重16～18g，均购自中国科学院上海实验动物中心，动物饲养在本校实验动物中心spf级实验室内，实验设计及操作遵守上海交通大学实验动物中心和动物伦理委员会的相关规定与要求。

用一次性无菌注射器在裸鼠的左、右脂肪垫接种mcf-7细胞约5×10⁶个，并将裸鼠随机分成2组，分别为对照组、胃泌素组。每组各5只；在细胞种植15日后，肿瘤体积达到约100-200mm³，从即日起给药，对照组0.9％nacl100ul/次，日1次尾静脉注射；胃泌素组予以胃泌素2mg/kg，日1次尾静脉注射，以上均给药2周。给药当天设为d0；每周2次测量移植瘤的长径和短径，按照下面的公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝长(mm)×宽2(mm)/2；在d28给予裸鼠过量麻醉处死，取出荷瘤分别称重记录，并将肿瘤切成厚度为4mm的薄片，部分以福尔马林固定，部分以液氮冻存，用于后续实验。

2结果

2.1cckbr受体在乳腺癌细胞中的表达

本研究对3种乳腺癌细胞株提取蛋白进行了cckbr蛋白的westernblot检测.结果在mcf-7和t47d中均有cckbr的表达，而在231中cckbr表达极低，图1为不同乳腺癌细胞株中cckbr蛋白的表达情况。

2.2cckbr受体在乳腺癌组织中的表达

本研究对20例乳腺癌患者的组织进行免疫组化检测cckbr蛋白的表达情况。结果显示在这些患者的组织中cckbr蛋白普遍表达。图2为乳腺癌组织中cckbr蛋白的表达情况。

2.3胃泌素对乳腺癌细胞增殖的影响

将胃泌素分别应用于mcf-7，t47d及mdamb231细胞，日给药一次，连续7天，每天进行细胞计数。结果显示在mcf-7和t47d中胃泌素处理后肿瘤细胞数目较对照组明显减少(*p<0.05，与对照组相比较，n＝3)，但对231没有抑制作用。图3为胃泌素对乳腺癌细胞的增殖抑制作用。

2.4胃泌素对cckbr蛋白水平的影响

将胃泌素10^-7m分别作用于mcf-7、t47d细胞，日一次给药，共3日，然后分别于给药后1d、3d、5d收取细胞提取蛋白做western-blot检测cckbr蛋白，结果显示mcf-7在胃泌素给药后1d即可明显上调cckbr蛋白丰度，并随着给药次数的增多及时间的延长仍保持高丰度并呈明显持续上调趋势；而t47d细胞在胃泌素给药后1dcckbr蛋白丰度开始增加，并随着给药次数及时间的延长呈逐渐升高趋势。而且mcf-7细胞中cckbr上升的速度明显快于t47d细胞。图4为胃泌素在mcf-7、t47d中上调cckbr蛋白丰度。

2.5胃泌素上调erk，p65蛋白表达

将胃泌素10^-7m分别作用于mcf-7、t47d细胞，日一次给药，共3日，然后分别于给药后0d、1d、2d、3d收取细胞提取蛋白做western-blot检测erk，p65蛋白，结果显示mcf-7在胃泌素给药后1d即可明显上调cckbr蛋白丰度，并随着给药次数的增多及时间的延长仍保持高丰度并呈明显持续上调趋势；而t47d细胞在胃泌素给药后1dcckbr蛋白丰度开始增加，并随着给药次数及时间的延长呈逐渐升高趋势。而且mcf-7细胞中cckbr上升的速度明显快于t47d细胞。图5为胃泌素在mcf-7、t47d中上调erk，p65蛋白丰度。

2.6胃泌素在体内实验中的抗肿瘤作用

2.6.1胃泌素在裸鼠荷瘤模型中抑制肿瘤增殖

取平均6周龄的balb/c裸鼠于两侧脂肪垫分别注射5×10⁶个mcf-7细胞，建造裸鼠荷瘤模型。在裸鼠注射肿瘤细胞后随机将裸鼠分为2组，即对照组、胃泌素组，接种肿瘤细胞约15日后，裸鼠腋下肿瘤生长至100-200mm³后开始予以药物处理，对照组0.9％nacl100ul/次，日1次尾静脉注射，胃泌素2mg/kg，日1次尾静脉注射，共给药2周。通过测量荷瘤大小来计算肿瘤生长率，肿瘤体积＝长×宽²/2。结果显示在给药2周后开始各组荷瘤生长曲线出现分离，到给药2周时胃泌素组荷瘤平均大小明显低于对照组(p<0.05)，证实二者在体内确实亦有抗肿瘤作用。并取肿瘤拍照称重。图6为胃泌素抑制裸鼠胃癌荷瘤增殖。

2.6.2胃泌素促进裸鼠荷瘤组织的cckbr蛋白的表达

图7为胃泌素促进荷瘤组织的cckbr表达。

2.6.3胃泌素通过影响cckbr的下游信号通路抑制肿瘤增殖

取荷瘤组织提取蛋白进行了相关蛋白如erk，p65等的westernblot检测，结果显示在荷瘤组织中胃泌素可上调蛋白丰度，此与细胞实验结果相一致，进一步支持了我们的假说。图8为胃泌素影响裸鼠荷瘤组织蛋白p-erk,p-p65表达。

综合以上实验，我们发现胃泌素在mcf-7、t47d中均有抗肿瘤作用，体内实验亦进一步证实该作用。其分子机制考虑为胃泌素通过上调cckbr蛋白丰度，上调的cckbr受体与胃泌素相结合启动并放大对下游信号分子的影响是胃泌素抗肿瘤增殖的关键环节。

2.9临床患者胃泌素水平检测

体内体外实验证实胃泌素能够抑制mcf-7、t47d两种乳腺癌细胞系。分析其分子特征均为her2阴性，er和或pr阳性。我们收集了38例此类型乳腺癌患者的血清以及15例正常人的血清，通过elisa检测两组胃泌素水平。结果显示这类乳腺癌患者的血中胃泌素水平普遍低于正常人。图9为乳腺癌患者血中胃泌素水平。

我们用胃泌素处理乳腺癌细胞mcf-7和t47d，发现细胞株mcf-7和t47d的增殖得到了抑制，通过westernblot检测发现上调了cckbr，磷酸化的erk和磷酸化的p65。此结果在动物预实验上也得到了初步验证。其确切机制还需要接下来的进一步验证及探究。mcf-7和t47d均为her2阴性，er和或pr阳性，根据此分子特征，我们收集了38例临床乳腺癌患者的血清及15例正常人的血清，通过elisa检测其血清胃泌素水平，发现此类型患者血清胃泌素水平低于正常人水平。此外，我们还发现这些胃泌素水平低的患者中25例主诉有胃病史或者胃镜检查有胃病。据此，我们推测胃泌素水平低是乳腺癌发病的一个风险因素。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。