Znf367基因在制备治疗乳腺癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用
【专利摘要】本发明公开了ZNF367基因在制备治疗乳腺癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用。发明人的体内外实验结果证实ZNF367在乳腺癌组织中高表达，且生存分析表明ZNF367基因的表达水平与乳腺癌的分期、预后密切相关。因此，可以合成或制作此基因的抑制物，作为乳腺癌潜在的靶向治疗药物；由于该基因在乳腺癌中存在DNA扩增和表达升高，故可制作检测该基因DNA变异和表达变化的试剂盒以用于诊断乳腺癌；由于该基因表达的升高与差的预后相关，故检测其表达水平变化的试剂盒也可用于其预后的评估，以指导临床的治疗。
【专利说明】
ZNF367基因在制备治疗乳腺癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用
技术领域
[0001]本发明具体涉及ZNF367基因在制备治疗乳腺癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的疾病，我国每年癌症发病人数约307万人，而每年因癌症死亡的人数约220万人。世界卫生组织2012年《世界癌症报告》指出中国新诊断癌症病例为307万，占到全球总数的21.8%;而年死亡人数220万，占到全球癌症年死亡人数的26.9%。更为严重的是这些数据正以惊人的速度逐年增长。恶性肿瘤已超过心血管疾病成为致死的首要原因。因此，探索癌症发生的分子机制研究及寻找其有效治疗手段对人类健康具有重大意义。
[0003]乳腺癌是全球第二大常见恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中致死率居首位，全球每年有将近130万女性患上乳腺癌，并且有超过40万女性因为乳腺癌的转移复发而死亡。乳腺癌是一种异质性非常强的肿瘤，不同类型的乳腺癌可具有显著不同的生物学特性与临床表现。因此，对患者的乳腺癌进行分类已成为用于确定治疗方案的重要组成部分。目前，临床上主要应用免疫组织化学方法，根据雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和HER-2的检测结果，将乳腺癌分为4种分子亚型:luminal A型(ER阳性或PR阳性，HER-2阴性，Ki67低表达)、luminal B型(ER阳性或PR阳性，HER-2也阳性)、HER-2过表达型(ER、PR阴性，HER-2阳性，Ki67多为高表达)和basal-like型(ER、PR、HER-2均阴性)。
[0004]虽然针对不同亚型的乳腺癌有着各异的治疗策略，如针对ER受体阳性的乳腺癌可以使用他莫昔芬等ER受体抑制剂，针对HER2阳性的乳腺癌可以使用曲妥珠单抗等HER2受体封闭抗体，针对三阴乳腺癌可以使用联合化疗等方案，但是现有的治疗策略并没有针对肿瘤复发转移的靶点，无法克服肿瘤治疗中最大的临床问题一一复发与转移。
[0005]ZNF367基因，全名zinc finger protein 367，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库的登录号为Gene ID: 195828，位于9号染色体长臂9q22位点。ZNF367是一个转录因子，已知其在发育中具有重要作用。然而ZNF367在肿瘤中的作用，以及是否可作为肿瘤诊断治疗靶标目前仍未研究透彻。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于发现乳腺癌标志物ZNF367基因，以区分乳腺癌复发和转移的风险，并将其作为新的治疗靶点。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
抑制ZNF367基因表达或翻译的试剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
[0008]优选的，抑制ZNF367基因表达或翻译的试剂为ZNF367基因启动子抑制剂、ZNF367基因转录抑制剂或ZNF367蛋白合成抑制剂。
[0009]优选的，抑制ZNF367基因表达或翻译的试剂为ZNF367基因的dsRNA、ZNF367基因的siRNA、或 ZNF367基因的 shRNA。
[0010]优选的，所述ZNF367基因的dsRNA、ZNF367基因的siRNA、或ZNF367基因的shRNA部分碱基用锁核酸进行修饰。
[0011]在体内使ZNF367蛋白活性降低或失活的试剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
[0012]优选的，在体内使ZNF367蛋白活性降低或失活的试剂选自ZNF367蛋白抗体、ZNF367酶活性抑制剂。
[0013]定量ZNF367基因DNA扩增量或表达量的试剂作为乳腺癌诊断或预后评估试剂的应用。
[0014]定量ZNF367蛋白DNA扩增量或表达量的试剂作为乳腺癌诊断或预后评估试剂的应用。
[0015]—种乳腺癌诊断或预后评估试剂，该试剂含有定量ZNF367基因或蛋白表达量的试剂。
[0016]本发明的有益效果是:
本发明提供了一种用于乳腺癌诊断和治疗的靶基因ZNF367。利用生物信息学的方法分析乳腺癌基因表达高通量数据，体外实验(荧光定量PCR、免疫组化、克隆形成)结果表明ZNF367在乳腺癌组织中高表达，且生存分析表明ZNF367基因的表达水平与乳腺癌的分期、预后密切相关。此外体内实验还表明沉默ZNF367基因的表达水平能显著抑制乳腺癌的成瘤及转移能力。本发明提供的ZNF367基因的两段发夹RNA(shRNA)和针对ZNF367基因的锁核酸(LNA)序列可用于制备治疗乳腺癌疾病的药物。例如，采用基因治疗的方法，以质粒或者病毒为表达载体，使其在癌变部位沉默ZNF367的表达。
【附图说明】
[0017]图1、ZNF367基因mRNA高表达于乳腺癌组织并与差的预后相关:(A)临床组织样品的芯片数据中，肿瘤组织的ZNF367基因RNA水平高于正常乳腺组织；(B)高表达的ZNF367基因与乳腺癌患者差的总生存时间相关；(C) ZNF367基因的高表达预示着更短的无病生存时间；(D)定量PCR结果显示，肿瘤组织的ZNF367基因高表达于癌旁正常组织；(E)相对于非恶性的乳腺上皮细胞(MCF-10A)，ZNF367基因在多个乳腺癌细胞系中高表达；
图2、ZNF367基因蛋白高表达于乳腺癌组织并与差的预后相关:(A) ZNF367染色强度随乳腺癌患者的临床分期升高而加深；(B-C)高表达的ZNF367基因的乳腺癌患者，其总生存时间(B)和无病生存时间(C)均较短；(D) ZNF367的高表达水平，预示患者更高的复发风险，因此可作为判断患者预后的独立因素；
图3、利用小发夹RNA稳定沉默ZNF367能抑制乳腺癌的恶性表型:(A)免疫印迹实验，确认两段shRNA均能有效沉默乳腺癌细胞中ZNF367的表达；(B)沉默ZNF367能抑制乳腺癌细胞的克隆生长；(C)与多柔比星联用的条件下，沉默ZNF367能显著诱导乳腺癌细胞的凋亡；
(D)沉默ZNF367能抑制乳腺癌细胞的体内形成肿瘤的大小；(E)沉默ZNF367能抑制乳腺癌细胞的肺转移能力；
图4、利用靶向ZNF367的LNA能抑制乳腺癌的恶性表型:(A)免疫印迹实验，确认两段LNA均能有效沉默乳腺癌细胞中ZNF367的表达；(B)沉默ZNF367能抑制乳腺癌细胞的克隆生长；(C)与多柔比星联用的条件下，沉默ZNF367能显著诱导乳腺癌细胞的凋亡；(D)沉默ZNF367能抑制乳腺癌细胞的体内形成肿瘤的大小；(E)沉默ZNF367能抑制乳腺癌细胞的肺转移能力。
【具体实施方式】
[0018]反基因治疗(ant1-gene therapy)是由特定寡聚脱氧核苷酸与革El双链DNA同聚啼啶或同聚嘌呤区专一性结合形成局部三螺旋结构，阻止靶DNA与聚合酶、转录因子等蛋白结合，实现抑制靶基因的复制和表达的目的。
[0019]锁核酸(lock mucleic acid，LNA)是新发现的一种带环状结构的核苷酸衍生物，与其他寡核苷酸相比，具有更高的热稳定性、更好的分子杂交能力、更强的抗核酸酶降解能力、更好的脂溶性和更低的细胞毒性等优势。
[0020]发明人通过利用多个乳腺癌及正常乳腺组织的mRNA表达谱芯片进行整合分析，发现ZNF367基因高表达于乳腺癌组织，且ZNF367的高表达预示着较差的总生存时间及无病生存时间。进一步的实验发现ZNF367基因的mRNA在三阴乳腺癌细胞系BT-549、HCC1937、MDA-MB-231、MDA-MB-468中高表达，而其他乳腺癌细胞系相对表达较低。发明人进一步设计并合成能检测ZNF367基因RNA表达水平的荧光定量PCR引物及探针序列用于三阴乳腺癌的诊断；还设计并合成了针对ZNF367基因的两段发夹RNA(shRNA)序列，通过基因克隆的方法，将shRNA序列克隆至pSUPER-pure载体。利用逆转录病毒感染体系，构建了沉默ZNF367表达的shRNA 乳腺癌细胞系(SKBR3-shZNF367#l、SKBR3-shZNF367#2、BT549-shZNF367#l 和 BT549-shZNF367#2);发明人还设计针对ZNF367基因的锁核酸(LNA)序列，并针对LNA序列中脱氧核酸进行硫代磷酸修饰设计，通过化学合成得到针对ZNF367的两条LNA序列(LNA-ZNF367#1和LNA-ZNF367#2)。本发明提供的两段发夹RNA(shRNA)序列和针对ZNF367的两条LNA序列可用于乳腺癌的治疗。
[0021]现结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0022]实施例1:ZNF367在乳腺癌中表达上调 (I)芯片筛选
通过利用多个乳腺癌及正常乳腺组织的mRNA表达谱芯片进行整合分析。
[0023]结果:从整合的临床组织样品芯片数据中，可以明确肿瘤组织的ZNF367基因RNA水平高于正常乳腺组织(图1-A);将有临床预后数据的患者样品挑出，分析ZNF367的表达与患者预后的关系发现，高表达的ZNF367基因预示着乳腺癌患者差的总生存时间(图1-B)及更短的无病生存时间(图1-C)。
[0024](2)qRT_PCR检测乳腺癌组织以及配对癌旁组织中ZNF367基因的mRNA水平进一步对乳腺癌组织以及配对癌旁组织中的ZNF367进行qRT-PCR检测验证。
[0025]方法:
I)乳腺癌组织来源:从中山大学肿瘤防治中心收集乳腺癌患者的配对的癌与癌旁组织样本(η = 8，包括Ρ1-Ρ8)。
[0026]2)细胞系和细胞培养:12株乳腺癌细胞系:10^1(^、8了474、10^7、10^-冊-361、10^-ΜΒ-453、SK-BR-3、T-47D、ZR-75-1、BT_549、HCC1937、MDA_MB_231、MDA_MB_468。将细胞培养于含有 10%FBS的DMEM(Dulbecco，s Minimum Essential Medium,Invitrogen, Carlsbad,USA)培养基中，放置37°C的5% CO2培养箱。
[0027]3)实时荧光定量PCR:收集上述组织和12种细胞，分别利用Trizol提取RNA，使用MMLV反转录酶(Promega)进行反转录合成cDNA，使用2 X SYBR mix (Roche)对各组细胞中ZNF367的表达水平进行qRT-PCR检测。
[0028]以GAPDH做内参。所用q-PCR引物为:
ZNF367-QF:AATCGCGGACAGTATCTGCT(SEQ ID NO:1);
ZNF367-QR:GTGAGGACGAGGAGGAAGCCSEQ ID N0:2)；
GAPDH-QF:GCACCGTCAAGGCTGAGAACCSEQ ID N0:3)；
GAPDH-QR:TGGTGAAGACGCCAGTGGACSEQ ID NO:4);
将每个样本获得的ZNF367基因的Ct值减去其内参基因GATOH的Ct值得到ACt，结果用2—Aet表示，ACt值越高，表示该基因的表达水平越低。
[0029]结果:定量PCR结果显示，肿瘤组织的ZNF367基因高表达于癌旁正常组织(图1-D);相对于非恶性的乳腺上皮细胞(MCF-1OA)，ZNF367基因在乳腺癌细胞系，尤其是三阴乳腺癌细胞系中显著高表达(图1-E)。
[0030](3)免疫组化法检测ZNF367基因蛋白在乳腺癌组织切片中的表达水平
对选取的207例乳腺癌组织切片，使用ZNF367抗体进行免疫组化染色。免疫组化方法为:
1)烤片60°(:，11130min；
2)脱蜡及复水:二甲苯两缸，15min/次；100%乙醇两次，95%乙醇一次，75%乙醇一次，蒸馏水洗两次，每次各3min;
3)切片于湿盒内，加3%双氧水，室温25min，蒸馈水洗两次，每次各3min；
4)朽1檬酸盐修复液，高压修复，冒气后3min；
5)切片在修复液中自然冷却至室温；
6)lXPBST，3minX3次;
7)甩干，加A液(非特异性染色阻断剂)于室温，湿盒内15min;
8)弃封闭液，加一抗；
9)lXPBST，3minX3次，甩干;
10)加B液(生物素羊抗兔八氧IgG)15min，IX PBST，3min X 3次，甩干；
11)加C液(链霉卵白素)15min，IXPBST，3min X 3次；
12)DAB显色，自来水终止染色；
13)自来水流水漂洗；
14)苏木素复染3min，自来水刷洗至无紫色；
15 ) 95%盐酸酒精分化1?15 s，自来水漂洗返蓝45min ；
16)60%乙醇，80%乙醇，100%乙醇脱水2min ；
17 )放入二甲苯2min，透明化后，未干时滴加10uL树酯，封片。
[0031 ]由两位观察者对染色结果进行观察，肿瘤细胞比例由以下标准进行评价:
O(无阳性肿瘤细胞)，1(阳性肿瘤细胞数〈10%)，2(阳性肿瘤细胞数占10-50%)，3(阳性肿瘤细胞数〉50%)。
[0032]结果:ZNF367染色强度随乳腺癌患者的临床分期升高而加深(图2-A)，高表达ZNF367基因(ZNF-H)的乳腺癌患者，其总生存时间(图2-B)和无病生存时间(图2-C)相比低表达患者(ZNF-L)均较短，多因素分析证实(n=207)，ZNF367的高表达水平，预示患者更高的复发风险，因此可作为判断患者预后的独立因素(图2-D)。
[0033]实施例2:利用小发夹RNA(shRNA)稳定沉默ZNF367能抑制乳腺癌的恶性表型
(I)细胞培养及稳定株构建
方法:分别用阴性对照PSUPER-V及可以沉默ZNF367的81^熟(8112,367#1、8112肥367#
2)处理三阴乳腺癌细胞SKBR3和BT549，工作浓度为5nM。通过收相应蛋白进行WB验证。
[0034]shZNF367#l 的序列为:ccgggcagatactgtccgcgatttactcgagtaaatcgcggacagtatctgcttttt(SEQ ID N0:5)；
shZNF367#2 的序列为:ccgggagcagattcacccatgcaaactcgagtttgcatgggtgaatctgctctttttCSEQ ID N0:6)；
结果:如图3-A所示，分别获得对照组细胞SKBR3 pSUPER-V、BT549 pSUPER-V和沉默ZNF367的细胞SKBR3 shZNF367#l、SKBR3 shZNF367#2和BT549 shZNF367#l、BT549shZNF367#2微管蛋白做为对照。
[0035](2)克隆形成实验
方法:将5X 12个细胞分别接种于六孔板中，并培养10天后，经10%甲醛固定5分钟，再用1%的结晶紫染色30s。
[0036]结果:如图3-B所示，与对照组SKBR3pSUPER-V、BT549 pSUPER-V相比，沉默ZNF367的SKBR3 shZNF367#l、SKBR3 shZNF367#2和BT549 shZNF367#l、BT549 shZNF367#2乳腺癌细胞能显著抑制乳腺癌细胞的克隆生长。
[0037](3)药物诱导凋亡实验
方法:将5 X 15个细胞分别接种于六孔板中，12 h后加入I ymol/L的多柔比星(Doxorubicin ΙμΜ)处理细胞，用AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒处理细胞，并用流式细胞仪检测凋亡细胞比例。
[0038]结果:如图3-C所示，抑制ZNF367能显著增加多柔比星诱导的细胞凋亡比例。
[0039](4)体内实验
I)小鼠体内成瘤实验
方法构建小鼠体内癌症模型，将I X 16个乳腺癌细胞BT549 pSUPER-V和BT549shZNF367#l、BT549 shZNF367#2进行小鼠皮下注射，5周后用活体成像系统观察荧光强度，并解剖动物测量肿瘤重量。
[0040]结果:如图3-D所示，处理组与对照组相比，肿瘤体积和重量明显小于对照组，表明与多柔比星联用的条件下，沉默ZNF367能显著诱导乳腺癌细胞的凋亡及抑制乳腺癌细胞的体内形成肿瘤的大小。
[0041 ] 2)小鼠肺转移模型
方法:经小鼠尾静脉注射BT549 pSUPER-V、BT549 shZNF367#l、BT549 shZNF367#2乳腺癌细胞，5周后用活体成像系统观察荧光强度，并解剖动物观察肺内节结数目。
[0042]结果:如图3-E所示，统计小鼠肺转移灶的数目，得知用BT549 shZNF367#l、BT549shZNF367#2处理的小鼠的肺转移癌的生长能力下降，表明沉默ZNF367能抑制乳腺癌细胞的肺转移能力。
[0043]实施例3:利用靶向ZNF367的锁核酸(LNA)稳定沉默ZNF367能抑制乳腺癌的恶性表型
(I)细胞培养及稳定株构建
方法:分别用阴性对照LNA-NC及可以沉默ZNF367的LNA(LNA-ZNF367# 1、LNA-ZNF367#2 )处理乳腺癌细胞SKBR3和BT549，工作浓度为50 nM。通过收相应蛋白进行WB验证。
[0044]LNA-NC序列为:TGagaagaccgttcttccaactTgG(SEQ ID NO:7);
LNA_ZNF367#1 序列为:TGaaccagcttgcctttcaaagTgG(SEQ ID NO:8);
LNA_ZNF367#2序列为:TCtcatttcccaatacctcgccTgC(SEQ ID N0:9)；
注:小写字母为硫代磷酸修饰的RNA碱基，大写字母为LNA碱基。
[0045]结果:如图4-A所示，相对于LNA-NC处理组，在两乳腺癌细胞中用LNA_ZNF367#1和LNA-ZNF367#2处理细胞，能显著降低ZNF367的表达水平。
[0046](2)克隆形成实验
方法:将5X 12个细胞分别接种于六孔板中，并培养10天后，经10%甲醛固定5分钟，再用1%的结晶紫染色30s。
[0047]结果:如图4-B所示，相对于LNA-NC处理组，用LNA_ZNF367#1和LNA_ZNF367#2处理细胞，能显著抑制两乳腺癌的克隆形成能力。
[0048](3)药物诱导凋亡实验
方法:将5 X 15个细胞分别接种于六孔板中，12 h后加入I ymol/L的多柔比星和50nmol/L的LNA-NC、LNA-ZNF367#1 或LNA-ZNF367#2，用AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒处理细胞，并用流式细胞仪检测凋亡细胞比例。
[0049]结果:如图4-C所示，将多柔比星与针对ZNF367的LNA联用能显著诱导两乳腺癌细胞的凋亡。
[0050](4)体内实验
I)小鼠体内成瘤实验
方法:首先进行构建小鼠体内癌症模型，将I X 16个乳腺癌细胞BT549进行小鼠乳房脂肪垫注射，在接种细胞后3天开始，每周注射2次LNA-NC、LNA-ZNF367#1或LNA-ZNF367#2，体积为100 yl，浓度为I mmol/L，连续注射4周后，用活体成像系统观察荧光强度，并解剖动物测量肿瘤重量。
[0051 ] 结果:如图4-D所示，与LNA-NC处理组相比，用LNA_ZNF367#1或LNA_ZNF367#2处理荷瘤小鼠，能显著抑制肿瘤的体积。
[0052]2)小鼠肺转移模型
方法:经小鼠尾静脉注射BT549乳腺癌细胞后3天开始，每周注射2次LNA-NC、LNA-ZNF367#1或LNA-ZNF367#2，体积为100 μ?，浓度为I mmol/L，连续注射4周后，用活体成像系统观察荧光强度，并解剖动物观察肺内节结数目。
[0053]结果:如图4-E所示，统计小鼠肺转移灶的数目，与LNA-NC组相比，用LNA_ZNF367#1和LNA-ZNF367#2处理的小鼠，其肿瘤细胞肺转移癌的生长能力下降，表明靶向沉默ZNF367能抑制乳腺癌细胞的肺转移能力。
[0054]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.抑制ZNF367基因表达或翻译的试剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:抑制ZNF367基因表达或翻译的试剂为ZNF367基因启动子抑制剂、ZNF367基因转录抑制剂或ZNF367蛋白合成抑制剂。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:抑制ZNF367基因表达或翻译的试剂为ZNF367基因的 dsRNA、ZNF367基因的 siRNA、或 ZNF367基因的 shRNA。4.在体内使ZNF367蛋白活性降低或失活的试剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:在体内使ZNF367蛋白活性降低或失活的试剂选自ZNF367蛋白抗体、ZNF367酶活性抑制剂。6.定量ZNF367基因DNA扩增量或表达量的试剂作为乳腺癌诊断或预后评估试剂的应用。7.定量ZNF367蛋白DNA扩增量或表达量的试剂作为乳腺癌诊断或预后评估试剂的应用。8.—种乳腺癌诊断或预后评估试剂，该试剂含有定量ZNF367基因或蛋白表达量的试剂。
【文档编号】A61K39/395GK106039312SQ201610357423
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】宋立兵, 李隽 , 张鑫, 王曦, 林楚勇, 叶丽平
【申请人】中山大学肿瘤防治中心