一种耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料及其制备方法与流程

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，具体为一种耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料及其制备方法。

背景技术：

作为成年人最常见的口腔疾病之一，牙本质敏感主要来源于釉质丧失和/或牙龈退缩所导致的牙本质小管暴露，从而引起短暂的、尖锐的疼痛。根据经典的流体动力学理论(Brannstrom M. J Am Dent Assoc, 1963;66:366–370.)，牙本质小管的有效封闭被认为是减少小管内液体流动进而缓解敏感症状的可靠手段。经过数十年的发展，通过草酸盐、氟化物、粘接剂、激光处理等封闭牙本质小管治疗牙本质敏感已取得满意的效果。然而在复杂的口腔环境中，被封闭的小管常常难以抵抗诸如日常饮食中的酸侵蚀和机械磨刷(Wang Z, et al. J Dent, 2010;38(5):400–410; Sehmi H, et al. J Dent, 2015;43(12):1442–41447.)等多变条件，会再次敞开导致敏感症状的复发。

由于牙本质中主要成分是磷酸钙，因此利用成分类似的矿物化合物如羟基磷灰石来进行小管封闭将更加合理。纳米羟基磷灰石有加速钙磷沉积促进再矿化的能力，已被用在封闭小管治疗牙本质敏感(Besinis A, et al. Dent Mater, 2014;30(3):249–262; Wang R, et al. J Biomater Appl, 2014;29(2):268–277.)，但酸性环境会导致其溶解(Lee HS, et al. J Colloid Interface Sci, 2012;385(1):235–243.)。由于结构稳定、比表面积大、热化学性能稳定，近年来介孔硅作为理想的载体在生物医学领域广泛应用(Li X, et al. Int J Nanomedicine, 2016;11:2471–2480.)，在封闭牙本质小管治疗敏感中同样发挥了重要作用(Chiang YC, et al. ACS Nano, 2014;8(12):12502–12513.)。鉴于此，设计一种纳米羟基磷灰石负载的介孔硅将具有巨大优势，一方面可以保护羟基磷灰石不被酸溶解从而获得更好的再矿化效果，另一方面通过介孔硅独特的抗酸抗磨性能将会作为对抗酸侵蚀和机械磨刷的有力武器。

因为小管的存在和有机成分较高，暴露的牙本质通常更易患龋且进展很快(Takahashi N, et al. Caries Res, 2016;50(4):422–431.)。尽管目前的脱敏材料可以切断致龋菌进入小管的通道，但致龋菌代谢所形成的局部酸性微环境会潜在影响脱敏材料的功能稳定性和长效性(Flemming HC, et al. Nat Rev Microbiol, 2010;8(9):623–633.)。因此兼顾抑制致龋菌生物膜形成的脱敏材料将更具潜力。

现阶段的牙本质脱敏防龋材料主要是将抗菌成分如三氯生、氯已定、氟化亚锡等掺杂在脱敏剂中用于抑制致龋菌生物膜的形成，但是，随之产生的耐药性、牙染色、状态不稳定和细胞毒性等问题在一定程度上限制了其应用(Raut SA, et al. Environ Toxicol Chem, 2010;29(6):1287–1291; Miller S, et al. Int Dent J, 1994;44(1 Suppl 1):83–98; Shen Y, et al. Sci Rep, 2016;6:27537.)。近年来研究发现，绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)具有较高的生物学活性和生物相容性，既能作为MMP抑制剂对抗胶原降解，又能有效抑制变形链球菌的生物膜形成(Du X, et al. J Dent, 2012;40(6):485–492.)，这些特点让其可以作为一个安全、稳定、高效的防龋药物用于抑制生物膜形成。

因此，根据纳米羟基磷灰石、介孔硅、EGCG的特性和优势，本发明设计和合成一种负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅多功能复合材料，即一种耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料，一方面可以通过封闭牙本质小管治疗牙本质敏感，另一方面可以通过抑制致龋菌生物膜形成预防龋病。但截至目前，有关此方面的研究未有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料及其制备方法，该材料具有制备工艺简便、结构稳定、粒径均匀、分散性好、药物负载率和释放率高等特点。

本发明提供的技术方案是：一种耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料，为负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料。

上述负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料，纳米羟基磷灰石粒径40-80 nm，介孔硅粒径400-600 nm，纳米羟基磷灰石均匀负载在介孔硅表面，EGCG的负载率和释放率高。

上述负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料的制备方法，包括以下步骤：

(1) 室温下，将四水硝酸钙和磷酸氢二铵分别溶解于双蒸水中，超声分散，置于磁力搅拌器上搅拌，分别得到溶液Ⅰ和溶液Ⅱ；

(2) 将干燥介孔硅粉末加于双蒸水中，超声分散，得分散液Ⅲ，随后置于磁力搅拌器上，将溶液Ⅰ滴加入分散液Ⅲ，调节并保持pH值在10–10.5之间，搅拌12小时，得混合液Ⅳ；

(3)将溶液Ⅱ滴加入混合液Ⅳ，调节并保持pH值在10–10.5之间，搅拌30小时，得混合液Ⅴ；

(4) 经过24小时陈化后，将混合液Ⅴ离心，双蒸水和无水乙醇清洗，过滤，干燥，煅烧，得到纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料；

(5) 避光下，将 EGCG粉末溶解于无水乙醇中，超声分散，置于磁力搅拌器上搅拌，然后加入干燥的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料，室温下搅拌，然后置于振荡摇床上振荡72小时；

(6) 离心，无水乙醇清洗，过滤，真空干燥，得到负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料。

结合实施例的具体参数的技术方案是：

(1) 室温下，将0.944–3.776 g四水硝酸钙和0.3168–1.2672 g磷酸氢二铵分别溶解于60 mL双蒸水中，在功率400 W下超声5分钟，在搅拌速度200–400 rpm下置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，分别得到溶液Ⅰ和溶液Ⅱ；

(2) 将0.24–0.96 g干燥介孔硅粉末加于20–40 mL双蒸水中，在功率400 W下超声分散5分钟，得分散液Ⅲ，随后置于磁力搅拌器上，在搅拌速度200–400 rpm下将溶液Ⅰ缓慢滴加入分散液Ⅲ，调节并保持pH值在10–10.5之间，搅拌12小时，得混合液Ⅳ；

(3) 在搅拌速度200–400 rpm下将溶液Ⅱ缓慢滴加入混合液Ⅳ，调节并保持pH值在10–10.5之间，搅拌30小时，得混合液Ⅴ；

(4) 经过24小时陈化后，将混合液Ⅴ在6000–8000 rpm下离心15分钟，双蒸水和无水乙醇各清洗3次，过滤，80℃过夜干燥，550℃煅烧6小时，得到纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料；

(5) 避光下，将20 mg EGCG粉末溶解于10 mL 无水乙醇中，在功率400 W下超声5分钟，在搅拌速度300 rpm下置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，然后加入100 mg干燥的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料，室温下搅拌下2小时，在振荡速度180 rpm下置于振荡摇床上振荡72小时；

(6) 在8000 rpm下离心15分钟，无水乙醇清洗3次，过滤，真空干燥，得到负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料。

本发明的突出特点和有益效果是：

① 本发明耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料制备工艺较简便，工艺参数较易控制。

② 本发明耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料结构稳定、分散性较好、粒径均匀。

③ 本发明耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料的EGCG负载率和释放率较高。

④ 本发明耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料可被应用于封闭牙本质小管且耐酸耐磨治疗牙本质敏感和抑制致龋菌生物膜形成预防龋病。

附图说明

图1为本发明实施例2得到的耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基

磷灰石/介孔硅复合材料)的透射电镜形貌图：其中手指表示纳米羟基磷灰石，球体表示介孔硅，标尺为100 nm。由图可知，纳米羟基磷灰石粒径40-80 nm，介孔硅粒径400-600 nm，二者分散性好，纳米羟基磷灰石均匀负载在介孔硅表面。

图2为本发明实施例2得到的耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)的热重分析曲线图。由图可知，EGCG的负载率为11.29%。

图3为本发明实施例2得到的耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)的EGCG释放曲线图。由图可知，96小时内EGCG的释放率为54.49%±3.79%。

图4为本发明实施例2得到的耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)的牙本质小管封闭效果扫描电镜图。其中，图4A表示未处理的牙本质片表面所有小管均呈开放状态，图4B表示使用负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料处理的牙本质片表面所有小管均被严密封闭；图4C表示经过强酸浸泡后未处理的牙本质片表面所有小管仍呈开放状态同时管口被扩大，图4D表示经过强酸浸泡后使用负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料处理的牙本质片表面大部分小管仍被封闭；图4E表示经过机械磨刷后未处理的牙本质片表面所有小管仍呈开放状态，图4F表示经过机械磨刷后使用负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料处理的牙本质片表面所有小管仍被严密封闭。

图5为本发明实施例2得到的耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)的抑制致龋菌变形链球菌生物膜形成的扫描电镜图。其中，图5A表示未处理的牙本质片表面形成了浓厚的大量的变形链球菌生物膜，图5B表示使用负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料处理的牙本质片表面形成的变形链球菌生物膜显著减少。

具体实施方式

下列实施例仅用于进一步说明本发明，本领域一般技术人员可以根据本说明书公开的内容，采用其它多种方式具体实施本发明。

实施例1

(1) 室温下，称取0.944 g四水硝酸钙和0.3168g磷酸氢二铵分别加入到盛有60 mL双蒸水的烧杯中溶解，在功率400 W下超声5分钟，在搅拌速度200 rpm下置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，分别得到Ⅰ液和Ⅱ液；

(2) 称取0.24 g干燥介孔硅粉末加入到盛有20 mL双蒸水的烧杯中，在功率400 W下超声分散5分钟，得到Ⅲ液，随后置于磁力搅拌器上，在搅拌速度200 rpm下将Ⅰ液缓慢滴加入Ⅲ液，调节并保持pH值在10-10.5之间，搅拌12小时，得到Ⅳ液；

(3) 在搅拌速度200 rpm下将Ⅱ液缓慢滴加入Ⅳ液，调节并保持pH值在10-10.5之间，搅拌30小时，得到Ⅴ液；

(4) 经过24小时陈化后，将Ⅴ液在6000 rpm下离心15分钟，双蒸水和无水乙醇各清洗3次，过滤，80 ℃过夜干燥，550 ℃煅烧6小时，得到纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料，呈无色粉末状。

(5) 避光下，称取20 mg EGCG粉末加入到盛有10 mL无水乙醇的烧杯中溶解，在功率400 W下超声5分钟，在搅拌速度300 rpm下置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，得到Ⅵ液；

(6) 称取100 mg干燥的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料加入到Ⅵ液中，室温下搅拌下2小时，在振荡速度180 rpm下置于振荡摇床上振荡72小时；

(7) 在8000 rpm下离心15分钟，无水乙醇清洗3次，过滤，真空干燥，得到负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料，即一种耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料，呈无色粉末状。

(8) 使用透射电子显微镜(JEM-2100, JEOL)观察复合材料的形貌，使用热重分析仪(STA449F3, NETZSCH)检测复合材料中EGCG的负载率，使用紫外-可见分光光度计(UV-2401 PC, Shimadzu Co.)计算复合材料中EGCG的释放率。

实施例2

(1) 室温下，称取1.888 g四水硝酸钙和0.6336 g磷酸氢二铵分别加入到盛有60 mL双蒸水的烧杯中溶解，在功率400 W下超声5分钟，在搅拌速度200-400 rpm下置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，分别得到Ⅰ液和Ⅱ液；

(2) 称取0.48 g干燥介孔硅粉末加入到盛有20 mL双蒸水的烧杯中，在功率400 W下超声分散5分钟，得到Ⅲ液，随后置于磁力搅拌器上，在搅拌速度300 rpm下将Ⅰ液缓慢滴加入Ⅲ液，调节并保持pH值在10-10.5之间，搅拌12小时，得到Ⅳ液；

(3) 在搅拌速度300 rpm下将Ⅱ液缓慢滴加入Ⅳ液，调节并保持pH值在10-10.5之间，搅拌30小时，得到Ⅴ液；

(4) 经过24小时陈化后，将Ⅴ液在8000 rpm下离心15分钟，双蒸水和无水乙醇各清洗3次，过滤，80 ℃过夜干燥，550 °C煅烧6小时，得到纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料，呈无色粉末状。

(5) 避光下，称取20 mg EGCG粉末加入到盛有10 mL无水乙醇的烧杯中溶解，在功率400 W下超声5分钟，在搅拌速度300 rpm下置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，得到Ⅵ液；

(6) 称取100 mg干燥的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料加入到Ⅵ液中，室温下搅拌下2小时，在振荡速度180 rpm下置于振荡摇床上振荡72小时；

(7) 在8000 rpm下离心15分钟，无水乙醇清洗3次，过滤，真空干燥，得到负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料，即一种耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料，呈无色粉末状。

(8) 使用透射电子显微镜(JEM-2100, JEOL)观察复合材料的形貌，使用热重分析仪(STA449F3, NETZSCH)检测复合材料中EGCG的负载率，使用紫外-可见分光光度计(UV-2401 PC, Shimadzu Co.)计算复合材料中EGCG的释放率。

实施例3

(1) 室温下，称取3.776 g四水硝酸钙和1.2672 g磷酸氢二铵分别加入到盛有60 mL双蒸水的烧杯中溶解，在功率400 W下超声5分钟，在搅拌速度400 rpm下置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，分别得到Ⅰ液和Ⅱ液；

(2) 称取0.96 g干燥介孔硅粉末加入到盛有40 mL双蒸水的烧杯中，在功率400 W下超声分散5分钟，得到Ⅲ液，随后置于磁力搅拌器上，在搅拌速度400 rpm下将Ⅰ液缓慢滴加入Ⅲ液，调节并保持pH值在10-10.5之间，搅拌12小时，得到Ⅳ液；

(3) 在搅拌速度400 rpm下将Ⅱ液缓慢滴加入Ⅳ液，调节并保持pH值在10-10.5之间，搅拌30小时，得到Ⅴ液；

(4) 经过24小时陈化后，将Ⅴ液在8000 rpm下离心15分钟，双蒸水和无水乙醇各清洗3次，过滤，80℃过夜干燥，550℃煅烧6小时，得到纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料，呈无色粉末状。

(5) 避光下，称取20 mg EGCG粉末加入到盛有10 mL无水乙醇的烧杯中溶解，在功率400 W下超声5分钟，在搅拌速度300 rpm下置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，得到Ⅵ液；

(6) 称取100 mg干燥的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料加入到Ⅵ液中，室温下搅拌下2小时，在振荡速度180 rpm下置于振荡摇床上振荡72小时；

(7) 在8000 rpm下离心15分钟，无水乙醇清洗3次，过滤，真空干燥，得到负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料，即一种耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料，呈无色粉末状。

(8) 使用透射电子显微镜(JEM-2100, JEOL)观察复合材料的形貌，使用热重分析仪(STA449F3, NETZSCH)检测复合材料中EGCG的负载率，使用紫外-可见分光光度计(UV-2401 PC, Shimadzu Co.)计算复合材料中EGCG的释放率。

性能测试

(1) 封闭牙本质小管和耐酸耐磨性能的测试

选取完整无龋的离体第三磨牙颗，在水冷却下垂直于牙体长轴去除牙冠部釉质，制备厚

度为1 mm的牙本质片。梯度打磨后置于1% (w/v)的柠檬酸溶液中20秒使牙本质小管开放以模拟牙本质敏感模型，用双蒸水彻底冲洗。使用抛光杯分别蘸取实施例1 2 3中所制备的耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)的浆液(按粉液比10 mg材料：100 μL双蒸水制备)处理牙本质表面即抛光30秒，共两次。随后，将牙本质片分别接受两种处理：一种是浸泡在6% (w/v)的柠檬酸溶液(pH 1.5)中1分钟用于耐酸性能的测试，另一种是使用软毛牙刷机械磨刷牙本质片表面3分钟(150次/分钟)用于耐磨性能的测试。每个处理后的牙本质片样本在双蒸水充分冲洗、干燥、喷金后，使用扫描电子显微镜(Sigma, Zeiss)观察牙本质小管封闭情况。

由图4的结果可知，未处理的牙本质片表面所有小管均呈开放状态(图4A)，使用耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)处理的牙本质片表面所有小管均被严密封闭(图4B)；经过强酸浸泡后，未处理的牙本质片表面所有小管仍呈开放状态同时管口被扩大(图4C)，使用耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)处理的牙本质片表面大部分小管仍被封闭(图4D)；经过机械磨刷后，未处理的牙本质片表面所有小管仍呈开放状态(图4E)，使用耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)处理的牙本质片表面所有小管仍被严密封闭(图4F)。以上结果直接证明了耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)可以有效封闭牙本质小管并且能够耐酸耐磨，可以应用于治疗牙本质敏感。此结果为实施例2所获效果，实施例1和实施例3同样能获此效果。

(2) 抑制致龋菌生物膜形成防龋性能的测试

按(1)中的方法制备牙本质片并建立敏感模型，正反面各用紫光光照杀菌1小时后使用抛光杯分别蘸取实施例1 2 3中所制备的耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)的浆液(按粉液比10 mg材料：100 μL双蒸水制备)处理牙本质表

面即抛光30秒，共两次。将牙本质片样本置于24孔板中，每孔加入1 mL变形链球菌接种培养基(变形链球菌在脑心浸出液肉汤中37 °C厌氧过夜培养，调整浓度为10⁷ CFU/mL，接种培养基用含1% (w/v)蔗糖的脑心浸出液肉汤稀释获得)，在37 °C厌氧条件下培养24小时用于变形链球菌生物膜形成。随后用PBS冲洗三次洗脱未粘附的细菌，每个牙本质片样本用2.5%戊二醛在4 °C固定4小时，乙醇梯度脱水(30%, 50%, 70%, 80 %, 90%和100%)，干燥，喷金后，使用扫描电子显微镜(Sigma, Zeiss)观察牙本质表面变形链球菌生物膜形态和粘附情况。

由图5的结果可知，未处理的牙本质片表面形成了浓厚的大量的变形链球菌生物膜(图5A)，使用耐酸耐磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)处理的牙本质片表面形成的变形链球菌生物膜显著减少(图5B)。以上结果直接证明了耐酸耐

磨防龋的牙本质脱敏材料(即负载EGCG的纳米羟基磷灰石/介孔硅复合材料)可以有效抑制致龋菌生物膜的形成，可以应用于牙本质龋的预防。此结果为实施例2所获效果，实施例1和实施例3同样能获此效果。