一种负载kartogenin的纳米纤维组织工程支架的制备方法与流程

本发明属于生物医学材料涉及软骨组织工程修复领域，特别涉及一种负载kartogenin的纳米纤维组织工程支架的制备方法。

背景技术：

先天性气管狭窄(cts)是指由构成僵硬气管后壁的完全性气管环和缺少正常结构的膜性气管导致的气管管腔狭窄。其发生可随气管黏膜下层腺体和结缔组织的增生形成管腔进一步导致阻塞，或因气管插管损伤、血管环压迫以及气管软化等其他原因造成阻塞。而先天性气管狭窄在先天性心脏病(先心病)患儿中的发病率较高，文献报道约为1.5％

应用小分子化合物等方法促进软骨再生及软骨修复的研究正在受到关注，为干细胞靶向修复局部软骨缺损及软骨再生带来了新的希望。2012年《science》报道了一种新的小分子化合物kartogenin(kgn)，是通过高通量筛选技术从22000种分子中筛选获得，并被证实可以选择性诱导干细胞分化为软骨细胞而促进软骨的产生，同时可抑制软骨细胞的肥大分化，当给骨关节炎小鼠模型局部注射kgn可触发其体内软骨的再生，且无细胞毒性，但具体作用机制尚未清楚，可能与作用于runx1信号通路有关。目前kgn应用于软骨修复方面的已经有很多研究陆续发表。至目前为止，未见有基于同轴静电纺丝技术制备一种负载kartogenin的纳米纤维组织工程支架的支架。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种负载kartogenin的纳米纤维组织工程支架的制备方法。

为了解决上述问题，本发明提供了一种负载kartogenin的纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)：将鱼胶原蛋白和聚乳酸-聚己内酯共混物溶于溶剂中，搅拌至完全溶解后得到皮层静电纺丝溶液；

步骤2)：用聚乳酸-聚己内酯溶液稀释溶于dmso中的kartogenin母液，搅拌均匀得到芯层静电纺丝溶液；

步骤3)：将皮层静电纺丝溶液、芯层静电纺丝溶液分别装入注射器中，进行同轴静电纺丝，然后进行熏蒸处理，真空干燥，即得负载kartogenin的纳米纤维组织工程支架。

优选地，所述步骤1)中聚乳酸-聚己内酯的数均分子量为30万；鱼胶原蛋白的数均分子量为30万。

优选地，所述步骤1)中溶剂为六氟异丙醇；搅拌时间为6-8小时。

优选地，所述步骤1)中鱼胶原蛋白与聚乳酸-聚己内酯的重量比为25∶75。

优选地，所述步骤1)中皮层静电纺丝溶液的质量浓度为12-15kg/l。

优选地，所述步骤2)中聚乳酸-聚己内酯溶液具体为：数均分子量为30万的聚乳酸-聚己内酯溶于六氟异丙醇和二氯甲烷以体积比2∶1混合的混合溶剂；聚乳酸-聚己内酯溶液的质量浓度为4kg/l。

优选地，所述步骤2)中kartogenin母液的浓度为20mg/ml。

优选地，所述步骤2)中芯层静电纺丝溶液的浓度为3mg/ml。

优选地，所述步骤3)中同轴静电纺丝工艺具体为：将皮层静电纺丝溶液装入注射器中，在注射泵的作用下进入同轴装置复合毛细喷头的内外毛细喷丝口之间的环状空隙处；将芯层静电纺丝溶液装入注射器，在注射泵的作用动下进入同轴装置复合毛细喷头的内毛细喷丝头；开启静电压发生器、注射泵，以及滚筒接收装置的电机，进行纺丝。所述喷丝口为同心轴的复合毛细管，所制备的纳米纤维具有“芯-壳”结构。

优选地，所述步骤3)中同轴静电纺丝工艺参数为：纺丝喷头采用内层直径0.84mm、外层直径0.51mm的同心轴喷丝头；注射泵的推进速度分别为芯层0.18ml/h、壳层1.3ml/h；在同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间的调节电压为11-12kv；同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间的距离为8-12cm；滚筒的转速为800r/min。

优选地，所述步骤3)中熏蒸处理具体为采用戊二醛熏蒸处理，戊二醛的体积浓度为25％，熏蒸时间为25min。

优选地，所述步骤3)中真空干燥时间为48-72h。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明巧妙地利用了同轴静电纺丝技术，得到长期缓释小分子化合物kartogenin，kartogenin能够诱导间充值干细胞向软骨细胞分化，在动物体内kartogenin能引发干细胞的归巢行为；kartogenin与生长因子有很好的协同效应；

(2)操作简单，可重复性好，经济效益高。

附图说明

图1为实施例1与对比例得到的纳米纤维的扫描电镜照片的对比图；

图2为实施例1与对比例得到的纳米纤维的直径纤维分布图的对比图；

图3为实施例1得到的负载kartogenin的纳米纤维不同比例的透射电镜照片；

图4为实施例1得到的负载kartogenin的纳米纤维的缓释曲线；

图5为kartogenin浓度的标准曲线；

图6为骨髓间充值干细胞(bmsc)分别在对比例、实施例1上培养4、7天的细胞电镜照片。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1

称取鱼胶原蛋白0.15g，聚乳酸-聚己内酯0.45g，溶于5ml六氟异丙醇，聚乳酸一聚己内酯共聚物的数均分子量为30万，以200r/min的速率磁力搅拌8小时混合均匀得到总浓度为12％(w/v)的皮层静电纺溶液。取100μl浓度为20mg/mlkartogenin溶于7ml的4％(w/v)聚乳酸-聚己内酯(hfip：dcm2∶1)，机械振荡均匀得到芯层的纺丝液；将壳层静电纺丝溶液装入注射器，微量注射泵的推进速度控制为1.2ml/min，将芯层静电纺丝溶液装入另一个注射器，微量注射泵的推进速度控制为0.18ml/min。同轴静电纺丝所用的同心轴芯层溶液通过的针头直径为0.51mm，壳层溶液通过的针头为直径为0.84mm，针头与11kv的高压相连。用铝箔平整包缠着直径为5cm的滚筒接收纳米纤维丝，电机控制滚筒转速800r/min，同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间的距离为10cm，3到4小时后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。上述支架取下后放入密闭容器，用体积浓度为25％的戊二醛进行蒸汽处理25min，处理完毕后真空干燥48h，去除残留溶剂。

实施例2

称取鱼胶原蛋白0.15g，聚乳酸-聚己内酯0.45g，溶于5ml六氟异丙醇，聚乳酸一聚己内酯共聚物的数均分子量为30万，以200r/min的速率磁力搅拌8小时混合均匀得到总浓度为12％(w/v)的皮层静电纺溶液。取50μl浓度为20mg/mlkartogenin溶于7ml的4％(w/v)聚乳酸-聚己内酯(hfip：dcm2∶1)，机械振荡均匀得到芯层的纺丝液；将壳层静电纺丝溶液装入注射器，微量注射泵的推进速度控制为1.2ml/min，将芯层静电纺丝溶液装入另一个注射器，微量注射泵的推进速度控制为0.2ml/min。同轴静电纺丝所用的同心轴芯层溶液通过的针头直径为0.51mm，壳层溶液通过的针头为直径为0.84mm，针头与11kv的高压相连。用铝箔平整包缠着直径为5cm的滚筒接收纳米纤维丝，电机控制滚筒转速800r/min，同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间的距离为12cm，3到4小时后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。上述支架取下后放入密闭容器，用体积浓度为25％的戊二醛进行蒸汽处理25min，处理完毕后真空干燥48h，去除残留溶剂。

对比例

称取鱼胶原蛋白0.15g，聚乳酸-聚己内酯0.45g，溶于5ml六氟异丙醇，聚乳酸一聚己内酯共聚物分子量为30万，以200r/min的速率磁力搅拌8小时混合均匀得到总浓度为12％(w/v)的静电纺溶液。将壳层静电纺丝溶液装入注射器，微量注射泵的推进速度控制为1.2ml/min；针头直径为0.84mm；针头与11kv的高压相连；喷丝头和滚筒接收装置之间的距离为10cm。4小时后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。上述支架取下后放入密闭容器，用体积浓度为25％的戊二醛进行蒸汽处理25min，处理完毕后真空干燥48h，去除残留溶剂。