一种体外构建组织工程角膜内皮的方法与流程

本发明属于组织工程领域，具体涉及一种体外构建组织工程角膜内皮的方法。

背景技术：

角膜内皮是附着于后弹力层(descemet'smembrane)的六角形单层细胞，通过其主动液泵功能维持角膜透明和正常的角膜厚度。人角膜内皮细胞增殖能力极为有限，受损后主要由损伤区周边细胞的扩展移行进行修复。各种原因如fuch角膜内皮营养不良、外伤、手术或炎症等均会引起角膜内皮细胞损伤，当角膜内皮细胞密度低于500-1500个/mm2时即发生角膜内皮功能失代偿，导致角膜水肿浑浊，呈现大疱型角膜病变，带后弹力层的角膜内皮移植或带板层角膜的内皮细胞移植是此类患者重建光明的希望，但角膜供体的来源匮乏严重制约了临床角膜内皮功能失代偿的治疗。近年来，干细胞的诱导分化和生物工程材料研究发展迅猛。将人多能干细胞，包括胚胎干细胞(embryonicstemcell,esc)、诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell,ipsc)或间充质干细胞(mesenchymalstemcells，msc)进行诱导分化后，接种于生物工程支架材料上，通过体外模拟生理构造和细胞外环境，从而获得用于再生医学治疗的目的组织器官已有多项报道。目前，猪的多种脱细胞组织材料已成功应用于组织工程器官再造领域的研究，脱细胞猪角膜基质材料已在动物水平和临床应用中取得了初步的治疗效果，但全层或厚板层猪角膜基质并不适合角膜内皮移植，会造成角膜不合格影响屈光，因此，体外构建组织工程化的角膜内皮是当前临床治疗难题。

技术实现要素：

申请人通过制备含有后弹力层的超薄脱细胞猪角膜后基质，联合人多能干细胞来源角膜内皮细胞体外构建组织工程化角膜内皮，不仅能够解决角膜供体的来源问题，而且可以克服组织工程化角膜过厚不适合临床治疗的难题。

即本发明的第一目的在于提供一种体外构建组织工程角膜内皮的方法，包括以下步骤：

1)制备超薄脱细胞猪角膜后基质：切取猪角膜后基质并保留后弹力层，去除猪角膜内皮细胞层，将脱内皮细胞层的猪角膜后基质，内皮细胞面向上干燥、灭菌备用；

2)培养、诱导人多能干细胞：将常规培养的人多能干细胞培养至适宜大小，使用诱导培养基诱导，至人多能干细胞克隆内细胞体积变大、细胞形态由圆形或卵圆形变为多边形，排列紧密，克隆周边细胞呈梭形纤维状，终止诱导；将终止诱导的人多能干细胞克隆消化后使用分化培养基重悬并计数备用；

3)构建组织工程角膜内皮：将步骤1)获得的猪角膜后基质，加入包被液进行包被，再将步骤2)获得的诱导分化后的人多能干细胞接种于步骤1)获得的猪角膜后基质，贴壁培养后，更换新鲜分化培养基培养，获得组织工程角膜内皮。

优选地，在本发明的体外构建组织工程角膜内皮的方法中，所述步骤1)中去除猪角膜内皮细胞层的方法为高静压处理破碎细胞后，加入添加了去垢剂和核酸酶的保护液震荡脱细胞处理，然后于保护液中漂洗。

优选地，在本发明的体外构建组织工程角膜内皮的方法中，所述步骤1)中所述高静压处理的压力条件为100-600mpa，频率为2-5次，每次1-2分钟，总时间不超过10分钟。

优选地，在本发明的体外构建组织工程角膜内皮的方法中，所述步骤1)中所述保护液为添加有5-12g/l透明质酸、5-20g/l硫酸软骨素、3-10g/l低分子量右旋糖酐、2.5-5mg/l妥布霉素、ph值为7.2-7.4、ph值为7.2-7.4的pbs缓冲液；

优选地，在本发明的体外构建组织工程角膜内皮的方法中，所述核酸酶为dnasei酶；更优选地，所述dnasei酶的浓度为100-2000u/ml；

更优选地，所述去垢剂为十二烷基硫酸钠，质量体积比为0.2％-0.5％；

更优选地，所述去垢剂与所述核酸酶联合作用时间为2-4小时，处理温度为20-30℃，摇床转速为100-150转/分钟；

更优选地，所述步骤1)中在所述保护液漂洗的时间为2-5小时；

更优选地，所述步骤1)中所述干燥为普通风干或使用干燥器进行脱水干燥；所述灭菌方法为辐照或加入抗生素药物灭菌。

优选地，在本发明的体外构建组织工程角膜内皮的方法中，所述步骤2)中所述适宜大小的人多能干细胞的大小为60-100个细胞/克隆。

优选地，在本发明的体外构建组织工程角膜内皮的方法中，在所述步骤2)中的诱导培养基为在dmem/f12基础培养基上添加以下物质制成：β-巯基乙醇、谷氨酰胺、碱性成纤维生长因子(bfgf)、非必须氨基酸(neaa)、血清替代物(knockoutserumreplacement，ksr)、全反式维甲酸(ra)；

更优选地，所述β-巯基乙醇浓度为0.1mm、谷氨酰胺浓度为0.1mm、bfgf浓度为4-8ng/ml、neaa为0.1mm、ksr浓度为总液体量的20％(体积分数)、ra浓度为0.5-2μm；

更优选地，所述分化培养基为含rock抑制剂的5％dksfm培养基。

更优选地，所述含rock抑制剂的5％dksfm培养基为在dksfm基础培养基中添加fbs和rock抑制剂制成的，其浓度分别为总液体量的5％(体积分数)和5-20μm。

优选地，在本发明的体外构建组织工程角膜内皮的方法中，所述步骤3)中所述包被液为层黏连蛋白液或复合包被液(fnccoatingmix)。；

更优选地，所述层黏连蛋白液的浓度为1-10μg/ml；最优选地，所述层黏连蛋白液为使用1×dpbs稀释后的浓度，每次使用前新鲜配制，包被时间为于37℃1小时或4℃过夜；

优选地，在本发明的体外构建组织工程角膜内皮的方法中，所述fnc为商品即用型，包被时间为接种细胞前，室温包被1分钟左右。

更优选地，本发明提供了一种体外构建组织工程角膜内皮的方法，包括以下步骤：

1)制备超薄脱细胞猪角膜后基质：使用飞秒激光切取新鲜猪角膜后基质保留后弹力层，标记内皮细胞一侧。切取的猪角膜后基质密封在盛有保护液的塑料袋中，采用高静压处理破碎细胞；取出猪角膜后基质，置于添加了去垢剂和核酸酶的保护液中进行震荡脱细胞处理，然后于保护液中漂洗2小时以上；漂洗完成后，将脱细胞猪角膜后基质内皮细胞面向上贴附于培养板，干燥后灭菌备用。

2)诱导人多能干细胞：常规培养的人多能干细胞培养至适宜大小即开始使用含有ra的诱导培养基连续诱导3-5天，镜下可见人多能干细胞克隆扩大并相接，克隆内细胞体积变大、细胞形态由圆形或卵圆形变为多边形，排列紧密，克隆周边细胞呈梭形纤维状。将终止诱导的人多能干细胞克隆消化后使用含rock抑制剂的5％dksfm分化培养基重悬并计数备用。

所述适宜大小的人多能干细胞克隆是指；倒置相差显微镜下约60-100个细胞/克隆，克隆大小均匀，密度适中。

所述含有ra的诱导培养基是在knockoutdmem/f12基础培养基上添加以下物质制成：β-巯基乙醇、谷氨酰胺、bfgf、neaa、ksr、ra。添加后，β-巯基乙醇浓度为0.1mm、谷氨酰胺浓度为0.1mm、bfgf浓度为4-8ng/ml、neaa为0.1mm、ksr浓度为总液体量的20％(体积分数)、ra浓度为0.5-2μm。

所述含rock抑制剂的5％dksfm分化培养基是在dksfm基础培养基中添加fbs和rock抑制剂制成的。其浓度分别为总液体量的5％(体积分数)、5-20μm。

3)体外构建组织工程化角膜内皮：制备好的脱细胞猪角膜后基质，内皮细胞面朝上置于培养板中，加入无血清培养基复水。接种细胞前去掉复水液体，加入1-10μg/ml层黏连蛋白(laminin,ln，购于biolamina公司，货号ln511,ln521)或fnccoatingmix(购于athenaes公司，货号0470)进行包被以促进细胞黏附，包被足够时间后去掉包被液体，风干备用。将消化好的诱导细胞按150-2000个细胞/mm²密度接种薄层脱细胞猪角膜后基质，置于37℃、5％co2培养箱贴壁过夜后，更换新鲜分化培养基培养一周左右，每日换液；

所述层黏连蛋白是指使用1×dpbs稀释后的浓度，每次使用前新鲜配制，包被时间为于37℃1小时或4℃过夜；所述fnccoatingmix为商品即用型，包被时间为接种细胞前，室温包被1分钟左右。

本发明的另一目的在于提供上述组织工程角膜内皮的构建方法获得的组织工程角膜内皮。

本发明的又一目的在于提供上述构建方法获得的组织工程角膜内皮在角膜(内皮)移植中的用途。

如本发明后续实施例所示，本发明的组织工程角膜内皮的构建方法及其组织工程角膜内皮，至少有以下优点：超薄猪角膜基质经过脱细胞处理后，水肿程度轻，利于种子细胞贴附和体外培养观察；同时，所构建的角膜内皮具有一定强度，易于进行角膜内皮移植操作。而全层角膜基质或厚板层角膜基质，水肿程度高、透明性差，细胞不易接种且观察困难；并且移植片过厚影响角膜内皮移植术式选择，增加其他并发症发生风险。

附图说明

图1为本发明一个实施例中所构建的组织工程角膜内皮茜素红染色图；

图2为本发明一个实施例中所构建的组织工程角膜内皮表达内皮细胞重要功能蛋白na⁺-k⁺-atpase图。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。

实施例

1.制备超薄脱细胞猪角膜后基质：飞秒激光切取直径为8mm、厚度为0.09mm的新鲜猪角膜后基质，保留后弹力层，标记内皮细胞一侧。切取的猪角膜后基质密封在盛有保护液的塑料袋中，全程使用保护液对其进行保护。于200mpa高静压条件下破碎细胞，处理2次，每次时间2分钟；取出猪角膜后基质，置于0.3％十二烷基硫酸钠及200u/mldna酶的保护液中，设定摇床速度100转/分钟，25℃消化3小时去除角膜中的dna成分，完成后将猪角膜后基质置于保护液中漂洗3小时。漂洗完成后，将脱细胞猪角膜后基质内皮细胞面向上贴附于培养板，干燥后辐照灭菌4℃保存备用。

其中，本实施例中所用保护液为pbs缓冲液中添加8g/l透明质酸、10g/l硫酸软骨素、5g/l右旋糖苷，调整ph值为7.2，渗透压为320mosm。

2.诱导人多能干细胞：传代后常规培养的人多能干细胞(h1人多能干细胞株，自atcc获得)培养至适宜大小即开始诱导，使用含有ra(购于sigma公司，货号r2625)的诱导培养基连续诱导5天，镜下可见人多能干细胞克隆扩大、相邻克隆发生融合，克隆内细胞体积变大、细胞形态由圆形或卵圆形变为多边形，排列紧密，克隆周边细胞呈梭形纤维状。终止诱导，去诱导培养基，加入2ml无ca2+、mg2+的pbs缓冲液洗涤2遍，加入0.25％胰酶-0.02％edta1.5ml，去除纤维状细胞及胰酶后，剩余细胞克隆放置培养箱继续消化，待大多细胞脱落时使用含rock抑制剂的5％dksfm分化培养基(购于invitrogen公司，货号10744019)终止、重悬，吹打至单细胞后计数备用。

所述适宜大小的人多能干细胞克隆是指；倒置相差显微镜下约60-100个细胞/克隆，克隆大小均匀，密度适中。

所述含有ra的诱导培养基是在knockoutdmem/f12基础培养基上添加以下物质制成：β-巯基乙醇、谷氨酰胺、bfgf、neaa、ksr、ra。添加后，β-巯基乙醇浓度为0.1mm、谷氨酰胺浓度为0.1mm、bfgf浓度为4ng/ml、neaa为0.1mm、ksr浓度为总液体量的20％(体积分数)、ra浓度为1μm。

所述含rock抑制剂的5％dksfm分化培养基是在dksfm基础培养基中添加fbs和rock抑制剂制成的。其浓度分别为总液体量的5％(体积分数)、10μm。

3.构建组织工程化角膜内皮：取出制备好的脱细胞猪角膜后基质，内皮细胞面朝上置于培养板中，加入无血清培养基复水。接种细胞前去掉复水液体，加入fnccoatingmix进行包被以促进细胞黏附，室温包被约1分钟后去掉包被液体，置于生物安全柜中风干备用。将消化好的诱导细胞按150-2000个细胞/mm²密度接种超薄脱细胞猪角膜基质，置于37℃、5％co2培养箱贴壁过夜，第二天更换新鲜分化培养基培养一周左右，镜下可见后弹力层上人多能干细胞来源的角膜内皮细胞排列紧密、形态规则、细胞边界清晰。

所述fnccoatingmix为商品即用型，包被时间为接种细胞前，室温包被1分钟左右。

如图1所示，为使用实施例中方法获得组织工程角膜内皮的茜素红染色照片。将构建的组织工程角膜内皮片使用茜素红染液染色5分钟，浸于生理盐水中小心漂洗，置于洁净玻片光镜下观察。可见所构建的组织工程角膜内皮细胞排列紧密、细胞边界茜素红着染清晰，细胞形态规则、活性良好。结果说明：本发明方法所获得的角膜内皮具有良好形态和细胞活性。

如图2所示，使用实施例体外构建的组织工程角膜内皮，镜下观察细胞长满后，使用4％多聚甲醛固定角膜内皮片，pbs缓冲液洗涤，加入na⁺-k⁺-atpase相应一抗、二抗孵育后，荧光显微镜下观察。可见：组织工程角膜内皮表达角膜内皮细胞液泵功能标志na⁺-k⁺-atpase。结果说明：本发明方法能够获得具有良好功能的组织工程角膜内皮。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。