专利名称：组织工程表皮替代物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及以壳聚糖-明胶膜构建的组织工程表皮替代物，及其制备方法和用途。
背景技术：
皮肤被覆于人体全身表面，与外界环境直接接触，是解剖学和生理学上的重要边界器官。皮肤约占成人体重的16％，面积约1.2-2.2m2。皮肤由表皮和真皮组成，借皮下组织与深部的深筋膜、腱膜或骨膜相连。皮肤起源于外胚层和中胚层，结构较复杂并高度特化，有重要的屏障作用和保护作用，可防止外界的刺激损伤体内的组织，能阻挡异物和微生物侵入，并可阻止体液外渗和对外界物质的吸收。
皮肤作为人体最大的组织，是与外界环境接触的屏障。当由于外界损伤或疾病等因素造成皮肤缺损时(如烧伤)，常常造成创面水分、电解质及蛋白质丢失，开放的创面还增加了感染的几率。早期、有效地封闭创面可以减少上述并发症的发生，临床上常用的是凡士林纱布和断层/全厚皮片，其中自体断层皮片移植是公认的标准疗法。但在大面积皮肤缺损患者，仍存在着供区不足及造成机体新的损伤等缺陷。
随着细胞生物学、材料学、生物化学、生物工程学、移植学的飞速发展，特别是近25年来，人们对表皮角质形成细胞的生物学特性、人工材料的加工与合成等有了更深入的认识，使在体外构建组织工程皮肤成为可能。组织工程化皮肤领域的研究一直是组织工程学的一个重点和热点。
创面的再上皮化是创伤愈合的重要指标。表皮可以减少体液丢失及降低感染的发生率，临床上，愈合时间超过3周的烧伤创面形成增生性瘢痕的机率很高，这主要是由于缺少表皮细胞对成纤维细胞的有效调控。
目前，常用的皮肤缺损修复途径有自体植皮、同种异体植皮、异种植皮，但存在供区不足、免疫排斥及传播疾病等缺点。
重建表皮的方法很多，从表皮细胞悬液移植到包含分化完善表皮层的全厚皮片移植。虽然硅胶膜很早就被用作临时性的表皮替代物，但永久的生物性修复仍有赖于具备活性的表皮角质形成细胞。1975年，Rheinwald和Green以3T3细胞作为滋养层连续培养人类表皮角质形成细胞获得成功，其基本方法是用胰蛋白酶消化分离表皮角质形成细胞，以加有小牛血清、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、表皮生长因子及霍乱毒素的培养基，经过培养得到平铺生长的表皮细胞，再经过传代扩增，得到大量表皮细胞。Green随即提出构想培养的表皮角质形成细胞融合成片后可用于修复自体皮肤缺损。1981年，O’Connor等首次应用此方法在体外培养出适于移植的人自体表皮细胞膜片(cultured epidermal autograft，CEA)。
1994年，Genzyme公司将培养的表皮细胞膜片商业化，注册商标为Epicel。Epicel一般用于烧伤面积占体表面积30％以上、累及真皮深层或全层的严重烧伤。这时缺损处丧失了再生表皮的能力，只能通过移植自体断层皮片来覆盖创面，而由于烧伤面积较大，存在着自体皮源不足的矛盾，移植CEA成为最佳选择之一。首先取患者少量健康皮肤在体外分离、培养、扩增自体表皮细胞，2-3周细胞融合成膜片后附着于凡士林纱布上，应用于烧伤创面。
尽管CEA技术是大面积烧伤治疗的一大进步，但经过长期的临床观察，单纯CEA移植技术存在一些缺点如耗时长，从取材到培养成完整的膜片需3-4周；细胞膜片菲薄易碎，难以操作；移植到创面后，接受率低，极易造成移植物脱失；即使在上皮化后，新生表皮不耐摩擦，容易发生水泡，造成残余创面。为了克服上述缺点，研究者一直在致力于寻找既能支持表皮细胞生长，又便于操作的基质，如胶原、硫酸软骨素、透明质酸膜、纤维蛋白胶以及脱细胞真皮基质等。
综上所述，目前临床上缺乏理想的皮肤替代物。因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、可操作性强的人工表皮代用品。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的安全性高、制法简便的人工表皮移植物。
本发明的另一目的就是提供所述表皮移植物的制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种表皮移植物，它包括(a)厚度为50-500微米的膜材料层，所述的膜材料层含有90-100％的壳聚糖和明胶，且壳聚糖和明胶的重量比为1∶9-9∶1；(b)位于膜材料层一个主表面之上的表皮层，表皮层含有密度为1-100×104细胞/平方厘米的表皮细胞。
在另一优选例中，所述的膜材料层含有95-100％的壳聚糖和明胶。
在另一优选例中，在膜材料层中，壳聚糖和明胶的重量比为3∶7-7∶3。
在另一优选例中，所述的明胶是衍生自猪、牛、羊、或狗的明胶。
在另一优选例中，所述的膜材料层的厚度为100-200微米。
在另一优选例中，所述的表皮细胞是自体或异体的表皮细胞，或衍生自表皮干细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的表皮细胞包括经过基因修饰、改造的表皮细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种制备表皮移植物的方法，包括步骤(a)提供厚度为50-500微米的膜材料层，所述的膜材料层含有90-100％的壳聚糖和明胶，且壳聚糖和明胶的重量比为1∶9-9∶1；(b)将选自下组的细胞按0.1×105-1×107个细胞/平方厘米接种于所述的膜材料层表皮细胞、表皮干细胞、或其组合；(c)在适合生长的条件下培养，从而形成膜材料层-表皮细胞复合物。
在另一优选例中，膜材料层中，壳聚糖和明胶的重量比为3∶7-7∶3。
在另一优选例中，在步骤(b)中，细胞的接种量为0.2×105-1×106个细胞/平方厘米。
图1是本发明组织工程表皮替代物的大体照片。
图2是本发明组织工程表皮替代物的相差显微镜照片。
图3是本发明临床治疗供皮区创面大体情况。其中，A为壳聚糖单纯材料治疗组，B为本发明组织工程表皮替代物治疗组，C为传统凡士林纱布治疗组。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，改进了表皮移植物的结构和制备方法，首次制得了基于壳聚糖-明胶膜的组织工程表皮替代物。本发明的组织工程表皮替代物，可以直接覆盖创面，用于供皮区、各种慢性溃疡及烧伤创面等皮肤缺损的修复。
表皮移植物的结构如本文所用，术语“表皮层”指位于表皮移植物表面，主要由角质形成细胞构成的细胞层。表皮层可由表皮细胞或表皮干细胞分化形成。
本发明的表皮移植物为二层结构。一层为壳聚糖和明胶构成的膜材料层，以及另一层为位于膜材料上的、由角质形成细胞构成的表皮层。
膜材料层厚度通常为50-500微米，更佳地为100-200微米。当然也可以更薄或更厚。
表皮层通常为单层或数层细胞，更佳的为单层细胞。表皮层含有密度为1-100×104细胞/平方厘米的表皮细胞，较佳地为5-50×104细胞/平方厘米的表皮细胞。
可用于本发明的表皮细胞的支持材料的主要成分是壳聚糖和明胶。壳聚糖和明胶两者的配比通常为1∶9-9∶1，较佳地为2∶8-8∶2，更佳地为3∶7-7∶3。壳聚糖和明胶都可以购得或用常规方法制备。
壳聚糖是从虾、蟹等海洋生物中提取的几丁质经脱乙酰化后得到的一种天然多糖。壳聚糖的结构及某些性质与细胞外基质中的主要成分氨基多糖极相似，而且高分子量和分子量分布单一的壳聚糖材料具有无毒性、无刺激性，良好的生物相容性、生物可降解性、以及生物活性等诸多优良性质，在医学上应用非常广泛。
明胶是胶原的变性产物，为单股线形结构，具有和胶原一样的氨基酸组成，无抗原性，细胞亲合性好。
可用于本发明的表皮移植物明胶材料可以是本领域常用的各种明胶。
用于本发明的明胶可以是同种或异种的、也可以是同种异体的、或同一个体的。较佳地，所述的明胶是异种或异体的。常用的明胶来自猪、牛、羊、狗等非人哺乳动物。特别优选的是来自猪和牛。
在本发明的表皮移植物中，壳聚糖提供优异的机械强度，而明胶提供优异的生物相容性，从而形成机械强度和生物相容性俱佳的膜材料。
可用于本发明的表皮细胞没有特别限制，可以是任何来源的自体或异体表皮细胞或表皮干细胞。表皮细胞的分离和培养方法都是本领域中熟知的。
制备方法本发明的人工皮肤可用以下方法制备(a)将表皮细胞接种于膜性材料表面。表皮细胞的接种量约为0.1×105-1×107个细胞/cm2，较佳地约为0.2×105-1×106个细胞/cm2。
(b)在适合生长的常规条件下培养一段时间(通常约为0-14天)，使表皮细胞增殖，从而形成表皮细胞-膜性材料组织工程表皮替代物。
用于本发明的培养液可以选用本领域常见的商品化的表皮角质细胞培养基。一种优化的培养基为DMEM与F12的混合培养基，按3∶1(v/v)比例混合，添加10％胎牛血清、4mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.4μg/ml氢化可的松、10-10M霍乱毒素、5μg/ml转铁蛋白、2×10-11M三碘甲腺原氨酸、1.8×10-4M腺嘌呤、5μg/ml胰岛素和10ng/ml表皮生长因子。DMEM与F12的基础培养基4℃保存，添加剂以浓缩液的形式-20℃保存，新鲜配用，一般不超过2周。
用本发明方法可形成有活性的、组织工程人工表皮替代物。它由载体膜片材料和接种于其上的表皮细胞共同构成。
本发明的组织工程人工表皮替代物皮肤可以直接覆盖创面，用于供皮区、各种慢性溃疡及烧伤创面等皮肤缺损的修复。
本发明制得的壳聚糖-明胶薄膜可以作为表皮细胞的转载系统，用于皮肤缺损修复。基于壳聚糖-明胶薄膜的人工表皮是一种崭新的组织工程化皮肤，为临床皮肤缺损的修复提供了理想的皮肤替代物。
本发明的主要优点在于(1)由于膜材具有良好的机械性能，构建的表皮替代物在移植时，容易操作；(2)不需要表皮细胞生长至复层再移植，培养时间缩短，成本降低；(3)以壳聚糖为主要成分构建的膜材是一种优良的创面敷料。
(4)当构建的表皮替代物反转移植于创面时，表皮细胞可以迁移至创面继续增殖分化，形成复层表皮修复创面。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1表皮细胞的分离与培养1)取材手术切除的小儿包皮，置入含抗生素的角化细胞培养液中，带入细胞培养室。
2)分离表皮用剪刀仔细剪去皮下脂肪组织及部分真皮，并修剪成宽约1-2mm的条状，用无钙镁PBS漂洗两次，表皮面朝上浸于0.24U/ml中性蛋白酶(Dispase II)中4℃过夜。
3)消化18小时后，用两把眼科镊子将表皮从真皮上撕下，剪成碎片，再用0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA在37℃消化15分钟，10ml胰酶抑制剂(10mg/ml)终止消化。经150目不锈钢滤网过滤，以1000r/min离心10分钟，弃去上清，加入角化细胞培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数，细胞活力＞85％。
4)原代培养计数后制成单细胞悬液，按3×106/75cm2密度接种培养，无血清角化细胞培养基(GIBCO，USA)，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，培养液3天换一次。
5)传代培养当细胞融合到60％-75％密度时，用10ml无钙镁PBS冲洗，经0.05％胰酶-0.53mM EDTA 37℃消化5-10分钟，加入10ml胰酶抑制剂终止消化，移入离心管中，1000r/min离心10分钟。弃去上清液，加入角化细胞培养液10ml，混匀，计数，按1∶3的比例传代培养。2-3日换一次培养液，直到细胞融合至60％-75％密度时，再传代培养。
实施例2壳聚糖-明胶膜材的制备
(a)将2％的壳聚糖的乙酸溶液(140ml)，4％的明胶溶液(30ml)(壳聚糖和明胶之比为7∶3)混合，室温下快速搅拌混合12小时；将一定量(12ml)的混合溶液加入培养皿中，干燥成膜；将膜浸泡于20ml含有50mM的MES的40％乙醇的培养皿中30min；弃去液体，用30mM EDC溶液反应2小时，用大量蒸馏水洗涤24小时，二次干燥成膜。获得壳聚糖-明胶复合膜材料，厚度为120微米。
(b)重复步骤(a)，不同点在于将壳聚糖和明胶的重量比由7∶3改为1∶9、2∶8、3∶7、5∶5、7∶3、8∶2和9∶1，同样制得膜材料。厚度为50-500微米不等。
实施例3制备组织工程表皮替代物按0.2×105、1×105、5×105、1×106个细胞/cm2的接种密度，将实施例1制备的表皮细胞分别接种于实施例2制备的各种壳聚糖-明胶膜表面上，培养在无血清角化细胞培养基(GIBCO，USA)中，培养液3天换一次。
从接种到获得表皮移植物平均耗时2-5天，即可获得表皮替代物(图1和图2)。显微镜观察表明，在本发明的表皮替代物中，表皮细胞在壳聚糖-明胶膜片上粘附生长良好。
实施例4临床应用于供皮区创面患者背部取中厚皮后创面，大小为24×10cm2，分别用三种处理方式传统凡士林纱布治疗、单纯壳聚糖膜片治疗及组织工程表皮替代物(表皮细胞-壳聚糖膜)治疗。7天后，打开外敷料，观察创面情况。
结果表明，组织工程表皮替代物覆盖处已完成上皮化，达到临床愈合标准，而另两组仍未愈合(图3)。这表明本发明的表皮移植物移植于皮肤缺损创面，表皮细胞可以迁移到创面，继续增殖、分化形成成熟的表皮覆盖创面。
此外，壳聚糖和明胶的重量比为1∶9、2∶8、3∶7、5∶5、7∶3、8∶2和9∶1时，所构成的表皮移植物的性能基本上没有区别，都具有良好的机械强度和生物相容性，而且伤口愈合速度和效果明显优于对照组。此外，壳聚糖和明胶的重量比3∶7、5∶5、7∶3时效果更好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种表皮移植物，其特征在于，它包括(a)厚度为50-500微米的膜材料层，所述的膜材料层含有90-100％的壳聚糖和明胶，且壳聚糖和明胶的重量比为1∶9-9∶1；(b)位于膜材料层一个主表面之上的表皮层，表皮层含有密度为1-100×104细胞/平方厘米的表皮细胞。
2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的膜材料层含有95-100％的壳聚糖和明胶。
3.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，膜材料层中，壳聚糖和明胶的重量比为3∶7-7∶3。
4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的明胶是衍生自猪、牛、羊、或狗的明胶。
5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的膜材料层的厚度为100-200微米。
6.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的表皮细胞是自体或异体的表皮细胞，或衍生自表皮干细胞，或其组合。
7.如权利要求6所述的移植物，其特征在于，所述的表皮细胞包括经过基因修饰、改造的表皮细胞。
8.一种制备表皮移植物的方法，其特征在于，包括步骤(a)提供厚度为50-500微米的膜材料层，所述的膜材料层含有90-100％的壳聚糖和明胶，且壳聚糖和明胶的重量比为1∶9-9∶1；(b)将选自下组的细胞按0.1×105-1×107个细胞/平方厘米接种于所述的膜材料层表皮细胞、表皮干细胞、或其组合；(c)在适合生长的条件下培养，从而形成膜材料层-表皮细胞复合物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，膜材料层中，壳聚糖和明胶的重量比为3∶7-7∶3。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，细胞的接种量为0.2×105-1×106个细胞/平方厘米。
全文摘要
本发明提供了表皮移植物，它含有(a)厚度为50－500微米的膜材料层，所述的膜材料层含有90－100％的壳聚糖和明胶，且壳聚糖和明胶的重量比为3∶7－9∶1；和(b)位于膜材料层一个主表面之上的表皮层，表皮层含有密度为1－100×10
文档编号A61L27/00GK1608684SQ20031010808
公开日2005年4月27日 申请日期2003年10月22日 优先权日2003年10月22日
发明者曹谊林, 崔磊, 刘伟, 杨光辉, 杨军 申请人:曹谊林