本发明属水产养殖病害免疫防治技术领域，涉及一种弧菌病免疫防治二联灭活疫苗及工厂化制备技术。
背景技术：
海水鱼养殖经常流行弧菌病，给养殖业带来损失较大。弧菌是海水养殖动物最重要的细菌性病原，包括哈氏弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌等，前两者是海水鱼养殖细菌性疾病的重要病原之一。我国水产病害的控制主要依靠使用各种抗生素和化学药物，对鱼类传染病的控制起到了一定的积极作用，但大量使用这些药物使养殖成本不断提高，同时亦制约水产养殖业的发展。因而研究安全高效控制水生经济动物主要病害的疫苗免疫防制措施应作为今后的主要研究方向之一。国外一些国家和地区很早开展了渔用疫苗的研制，批准上市的水产疫苗几十种。我国水产疫苗研究与开发起步较晚，在水产疫苗的开发应用上同先进发达国家有较大差距，至今还无产业化海水鱼弧菌疫苗产品在生产实际中使用，疫苗规模化制备方法缺少，基本为实验室制备技术，目前尚未有亚单位疫苗可规模化生产与应用于海水鱼的疾病免疫防治。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的诸多问题，本发明提供了一种哈氏和溶藻弧菌二联灭活疫苗及工厂化制备技术。
本发明通过如下的技术方案来实现：
一种哈氏、溶藻弧菌二联灭活疫苗，所述疫苗包括哈氏弧菌培养物灭活液和溶藻弧菌培养物灭活液。
优选的，所述哈氏、溶藻弧菌培养物灭活液占50％，其中细菌浓度不少于30×108cfu/ml；溶藻培养物灭活液占50％，其中细菌浓度不少于30×108cfu/ml。
本发明还提供了一种哈氏、溶藻弧菌二联灭活疫苗的工厂化制备技术，该技术包括如下步骤：
1)一级种子制备：哈氏弧菌、溶藻弧菌菌株分别接种tsa培养基，28℃，培养24小时，挑菌苔接种营养tsb培养基，28℃，摇瓶培养18-24小时，制备一级种子液；
2)二级种子制备：将两个一级种子液各自接种一个50l种子罐，培养基为30l改良tsb培养基，28℃，40l/min的通气量，搅拌通气培养12-14小时，制备二级种子液；
3)制苗菌液培养：将二级种子液各自接种一个500l发酵罐，培养基为300l改良tsb培养基，28℃，250l/min的通气量，搅拌通气培养12小时，得到制备疫苗的菌液，活菌数60×108cfu/ml以上为合格；
4)菌液灭活：培养物菌液分别移至500l灭活罐，两种菌液分别加入甲醛液，菌液甲醛终浓度0.3％，28℃，灭活24小时，进行无菌检验和甲醛残留检验合格，得到哈氏弧菌培养物灭活液和溶藻弧菌培养物灭活液。
5)配苗分装：分别将两种细菌培养物灭活液按1：1的比例输入配苗罐，罐内混合液搅拌均匀，无菌条件下进行分装、轧盖、得到哈氏和溶藻弧菌二联灭活疫苗成品。
本发明中疫苗工厂化制备方法是通过一、二级种子液逐级放大至500l发酵罐培养，转至500灭活罐灭活，再转至1000l配苗罐混匀、配苗、分装得到疫苗成品。是一种工厂化生产技术，技术成熟、可大批量生产，每批次可生产疫苗成品700l左右，可供350万以上尾鱼注射免疫使用，质量稳定可控，成本低，不同于小规模实验室制备技术，可产业化生产。本发明使用的菌株为哈氏弧菌和溶藻弧菌，发酵使用的培养基为改良tsb，活菌数得率高，得到的疫苗成品为灭活菌液混合物，生产简便。疫苗可通过注射、浸泡等方式施用，免疫石斑鱼等海水养殖鱼类效果良好，注射免疫保护率达到80％以上，浸泡免疫保护率超过50％，可有效预防海水鱼细菌性弧菌病，减少抗生素等化药的使用，提高水产品质量安全，减少水体污染，增加渔民收入。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
本实施例提供了一种哈氏、溶藻弧菌二联灭活疫苗的工厂化制备技术，具体包括如下步骤：
1、一级种子液制备
把保存哈氏弧菌、溶藻弧菌菌株取出，接种tsa平板(培养基配方见附录)，28℃，培养24小时，挑菌苔接tsa平板，28℃，培养24小时，接种tsb培养基(培养基配方见附录)300ml/瓶，10瓶，放摇床200r/min，28℃，培养18-24小时，得到3l一级种子液。
本实施例选择的菌种为：哈维氏弧菌spgy020601株，分离自患溃疡病的红鳍笛鲷；溶藻弧菌epgs021001株，分离患溃疡病的斜带石斑鱼；目前菌种均保存于中国水产科学研究院珠江水产研究所。
2、二级种子液制备
配制30l改良tsb培养基(培养基配方见附录)，加入到50l发酵罐，121℃,20分钟灭菌，培养基冷却后，将一级种子液接种发酵罐，28℃，通气量40l/min，250r/min，搅拌培养12-14小时，得到二级液体种子。
3、制备疫苗的菌液培养
配制300l改良tsb培养基，加入到500l发酵罐，121℃，20分钟灭菌，培养基冷却后，将纯粹及合格的二级种子液接入发酵罐，发酵罐内培养液温度为28℃，无菌空气流量250l/min，200r/min培养菌液12小时，培养结束后无菌采样，进行纯粹和活菌数检测(参照《中华人民共和国兽药典》二0一0年版)，活菌数需达到60×108cfu/ml以上为合格菌液。
4、灭活
将合格菌液通过管道输送到灭活罐，无菌操作加入甲醛液，甲醛最终浓度为0.3％，以28℃灭活，灭活24小时，期间每隔4小时搅拌一次，灭活好的菌液冷却至1～5℃之间，进行无菌检验和甲醛残留检验(参照《中华人民共和国兽药典》二0一0年版)。
5、配苗与分装
分别将两种细菌的合格灭活液按1：1的比例输入1000l配苗罐，罐内混合液搅拌均匀。无菌条件下进行分装、轧盖，得到海水鱼弧菌二联灭活疫苗成品。
经测定，培养菌液纯粹检验合格，哈氏弧菌培养液活菌数为175×108cfu/ml，溶藻弧菌培养液活菌数为181×108cfu/ml，均高于60×108cfu/ml；灭活菌液无菌检验合格，所得的海水鱼弧菌二联灭活疫苗中，哈氏弧菌培养物灭活液占50％，溶藻弧菌培养物灭活液，占50％，疫苗成品甲醛液残留(平均为0.121％)符合国家标准。
本发明制备的哈氏、溶藻弧菌二联灭活疫苗的免疫效果如下所述：
注射二联疫苗的50尾斜带石斑鱼，连续观察，全部健活，疫苗安全性合格；攻毒免疫保护效果实验结果表明，注射免疫组对菌株spgy020601、epgs021001的相对免疫保护率分别为84.6％、83.3％，浸泡组分别为56.4％、54.8％(见表1)。
表1哈氏、溶藻弧菌二联灭活疫苗免疫的效果
其中，免疫保护率＝(对照组死亡率-接种组死亡率)/对照组死亡率×100％。
tsa固体培养基：准确称取胰蛋白胨17克，大豆蛋白胨3克，磷酸二氢钾2.5克,葡萄糖2.5克，氯化钠5克，2％的琼脂粉，加入1000ml双蒸水，充分摇匀后加热至充分溶解，调ph值至7.3，121℃高温蒸汽灭菌15分钟，倒平皿备用。
tsb液体培养基：准确称取胰蛋白胨17克，大豆蛋白胨3克，磷酸二氢钾2.5克,葡萄糖2.5克，氯化钠5克，加入1000ml双蒸水，充分摇匀后加热至充分溶解，调ph值至7.3，121℃高温蒸汽灭菌15分钟。
改良tsb培养基：胰蛋白胨5.0g蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨3.0g酵母膏1.0g，葡萄糖4.0g磷酸氢二钾(k2hpo4)5.0g，氯化钠(nacl)15.0g，蒸馏水1000ml，混匀，加热溶解，调ph至7.5分装，121℃，高压灭菌15min。
灭活剂：40％甲醛。
本实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。