一种双极性纳秒脉冲电场加载、电场灭菌装置及方法与流程

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种双极性纳秒脉冲电场加载、电场灭菌装置及方法，通过对电脉冲波形进行特殊设计提高脉冲电场与细菌中极性物质之间的耦合效率，用于解决灭菌效率和选择性灭菌问题。

背景技术：

在食品加工和医疗领域，灭菌处理是至关重要的一项工作。目前，工业应用的杀菌方法有加热杀菌、化学药剂杀菌、强光灭菌等，这些灭菌方法虽然能够杀灭细菌，但均存在一定的局限性。例如，加热杀菌常会使被处理物(例如食品)发生物理或化学性质的变化，造成其色、香、味、组织结构的改变及营养价值的下降，严重影响食品的质量。化学药剂杀菌会使得被处理物中存在化学药剂残留，使得其应用受到极大的限制。强光灭菌则由于光的穿透能力的限制使其限于表面处理。

电场灭菌是近年来新兴的灭菌技术，美国、德国、日本等国发表了大量关于电场灭菌的研究报告。细菌、芽孢、病毒和生物细胞由蛋白质、磷脂、脱氧核糖核酸等多种有机分子和钠离子、钾离子等多种离子以及水等多种无机物分子组成，其中对维持细菌、芽孢、病毒和生物细胞正常生命活动至关重要的蛋白质、磷脂、脱氧核糖核酸等多种物质均为极性物质。国内外研究结果表明细菌、芽孢、病毒和生物细胞中的极性物质在电场作用下会受到电场力的作用，发生运动甚至分解，使得其结构关系和生物活性发生改变，使细胞死亡或进入程序性凋亡状态。elzakhem报道了使用电场处理生长初期的啤酒酵母，证实电场处理能够达到良好的灭菌效果。malicki等人研究了高压脉冲电场对液态蛋白中大肠杆菌致死率的影响，结果表明脉冲电场处理后大肠杆菌下降了4个对数级，同时营养成分几乎没有损失。2001年美国俄亥俄州立大学(osu)建成了第一台用于电场灭菌的固态高压脉冲发生器。该大学与dti公司合作制造了世界上第一台具有商业化规模的脉冲电场处理系统，每小时可以处理1000l-5000l的液体食品。我国脉冲电场杀菌技术虽然起步较晚，但发展迅速。中国农业大学、吉林大学、清华大学、浙江大学、西安交通大学、江南大学、华南理工大学、福建农林大学、重庆大学等均开展了相关研究工作，并在电场灭菌机理等方面取得了一些认识。但是，目前为止，在灭菌效率和选择性灭菌方面仍存在问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的问题，提供一种双极性纳秒脉冲电场加载装置、双极性纳秒脉冲电场加载方法、双极性纳秒脉冲电场灭菌方法及双极性纳秒脉冲电场灭菌装置，通过对含菌液体施加双极性纳秒脉宽高压脉冲电场，使其先受到正极性脉冲电场的作用，随后受到负极性脉冲电场的作用，或反之。在一个加载周期内，对含菌液体施加一次正极性脉冲电场作用和一次负极性脉冲电场作用，且脉冲宽度均小于等于100纳秒,正极性脉冲和负极性脉冲之间的时间间隔尽量短，一般情况下要求该时间间隔小于等于100ns。通过以一定的重复频率对含菌液体进行多次高强度电场处理，进一步提高电场灭菌效率。解决脉冲电场灭菌效率问题及选择性灭活问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种双极性纳秒脉冲电场加载装置包括：

时序与脉冲参数设定及控制模块，用于控制正、负极性高电压纳秒脉冲发生器，按照设定时序和脉冲参数要求输出对应的正极性高电压纳秒脉冲、负极性高电压纳秒脉冲；

脉冲合成模块，用于将所述正极性高电压纳秒脉冲、负极性高电压纳秒脉冲进行合成处理后交替输出正、负极性高电压纳秒脉冲。

进一步的，所述脉冲合成模块包括第一高功率脉冲二极管d1、第二高功率脉冲二极管d2、磁开关(ms)、锐化电容(c1)和锐化开关(s)；正极性高电压纳秒脉冲发生器与第一高功率脉冲二极管d1正极端连接；第一高功率脉冲二极管d1负极端与第二高功率脉冲二极管d2负极端并接后作为脉冲合成模块的输出端，第二高功率脉冲二极管d2正极接地；负极性高电压纳秒脉冲发生器依次通过磁开关(ms)和锐化开关(s)后与第一高功率脉冲二极管d1负极端连接；在磁开关ms与锐化开关s的公共端连接锐化电容(c1)高压极，锐化电容(c1)另一端接地；正极性高电压纳秒脉冲发生器输出的单个正极性纳秒脉冲在磁开关ms和锐化开关s公共端处的电压v(t)对时间的积分值小于磁开关ms的伏秒数。

进一步的，所述正、负极性脉冲的脉宽均小于等于100纳秒，且正、负极性脉冲之间的时间间隔小于等于100ns。

一种双极性纳秒脉冲电场加载方法，其特征在于包括：

时序与脉冲参数设定及控制模块控制正、负极性高电压纳秒脉冲发生器，使其按照设定时序和脉冲参数要求输出对应的正极性高电压纳秒脉冲、负极性高电压纳秒脉冲；

脉冲合成模块将所述正极性高电压纳秒脉冲、负极性高电压纳秒脉冲进行合成处理后交替输出正、负双极性高电压纳秒脉冲。

一种双极性纳秒脉冲电场灭菌装置还包括：

处理器，用于接收脉冲合成电路输出的正、负极性高电压脉冲并对处理器的处理腔中含菌材料进行灭菌处理；

时序与脉冲参数设定及控制模块，用于控制正、负极性高电压纳秒脉冲发生器及处理器的运行，从而使处理器的处理腔中含菌液体中细菌及其芽孢、病毒、生物细胞中的蛋白质极性物质，在所述正、负极性脉冲电场交替作用下发生移位或破坏，使细菌的细胞膜或病毒外膜穿孔，或使蛋白质物质的生物活性受到破坏，从而使细菌及其芽孢、病毒、生物细胞失去活性或者凋亡。

进一步的，根据待处理目标细菌、病毒和生物细胞的特性确定，对含菌液体进行多次重复脉冲电场处理，对含菌液体交替加载正、负极性高电压纳秒脉冲的重复频率f和加载脉冲数x进行设定；重复频率范围是1hz-5mhz，推荐值为1hz-1khz；加载脉冲数范围是1-10000，推荐值为20-100。

进一步的，所述处理腔长度设计要求是设定流速的目标菌体全部通过处理腔的时间不小于加载脉冲数所需的时间；所述加载脉冲所需的时间指的是设定正、负极性高电压纳秒脉冲发生器馈送到处理腔的n个电脉冲数量所需时间；n个电脉冲包括n/2个正极性脉冲和n/2个负极性脉冲。

一种双极性纳秒脉冲电场加载方法的电场灭菌方法还包括：

处理器，用于接收脉冲合成电路输出的正、负极性高电压脉冲并对含菌材料进行灭菌处理；

时序与脉冲参数设定及控制模块控制正、负极性高电压纳秒脉冲发生器及处理器的运行，从而使处理器的处理腔中含菌液体中细菌及其芽孢、病毒、生物细胞中的蛋白质等极性物质，在所述正、负极性脉冲电场交替作用下发生移位或破坏，使细菌的细胞膜或病毒外膜穿孔，或使蛋白质物质的生物活性受到破坏，从而使细菌及其芽孢、病毒、生物细胞失去活性或者凋亡。

一种双极性纳秒脉冲电场加载方法的电场灭菌方法包括：

时序与脉冲参数设定及控制模块检测正极性高电压纳秒脉冲发生器、负极性高电压纳秒脉冲发生器的脉冲产生电路中的电容器组是否已充电达到预设电压、收集器和废液储存器中液位是否低于启动液位、供料器中液位是否高于启动液位，以确认系统状态是否满足开机条件；

当系统状态参数满足开机条件时，时序与脉冲参数设定及控制模块首先打开供料器与处理器之间的电控阀门，启动供料器向处理器输送含菌液体；

当处理器的处理腔中已充满含菌液体且无气泡时，时序与脉冲参数设定及控制模块启动正极性高电压纳秒脉冲发生器和负极性高电压纳秒脉冲发生器使其按照设定时序和脉冲参数要求输出正、负极性高电压纳秒脉冲通过脉冲合成模块馈送至处理器高压电极，正极性高电压纳秒脉冲发生器输出的正极性脉冲通过第一高功率脉冲二极管(d1)馈送至处理器高压电极，负极性高电压纳秒脉冲发生器输出的负极性高电压纳秒脉冲经磁开关ms、锐化开关s和锐化电容c1进行脉冲压缩后馈送至处理器的高压电极；

待正、负极性高电压纳秒脉冲发生器及供料器等工作稳定后，处理器输出液体已可确保已达到设定参数电场处理后，时序与脉冲参数设定及控制模块打开收集器进液阀门，将经过电场灭菌处理的液体输送至收集器存储，供后续处理使用；在系统未达到稳定运行之前，处理器输出液体全部送入废液储存器；废液储存器中的废液可以回收至供料器；当时序与脉冲参数设定及控制模块检测到供料器中含菌液体已基本用尽，不能保证输送至处理器的含菌液体能够充满处理腔且不含气泡时，时序与脉冲参数设定及控制模块输出控制指令关闭收集器进液阀门后关闭正、负极性高电压纳秒脉冲发生器。然后关闭供料器输送泵及阀门，系统停机。

进一步的，所述正、负极性脉冲电场交替作用下蛋白质等极性物质发生移位或破坏，使细菌的细胞膜或病毒外膜穿孔，或使蛋白质等生命物质的生物活性受到破坏，从而使细菌及其芽孢、病毒、生物细胞失去活性或者凋亡。

进一步的，根据待处理目标细菌、病毒和生物细胞的特性确定，对含菌液体进行多次重复脉冲电场处理，对含菌液体交替加载正、负极性脉冲的重复频率f和加载脉冲数x进行设定；重复频率范围是1hz-5mhz，推荐值为1hz-1khz；加载脉冲数范围是1-10000，推荐值为20-100。

进一步的，所述处理腔长度设计要求是设定流速的目标菌体全部通过处理腔的时间不小于加载脉冲数所需的时间；所述加载脉冲所需的时间指的是设定正、负极性高电压纳秒脉冲发生器馈送到处理腔的n个电脉冲数量所需时间；n个电脉冲包括n/2个正极性脉冲和n/2个负极性脉冲。

进一步的，所述正、负极性高电压纳秒脉冲发生器的输出时间顺序也可以是先输出负极性脉冲。

一种双极性纳秒脉冲电场加载方法的电场灭菌装置包括：

时序与脉冲参数设定及控制模块，用于检测正极性高电压纳秒脉冲发生器、负极性高电压纳秒脉冲发生器的脉冲产生电路中的电容器组是否已充电达到预设电压、收集器和废液储存器中液位是否低于启动液位、供料器中液位是否高于启动液位，以确认系统状态是否满足开机条件；

当系统状态参数满足开机条件时，时序与脉冲参数设定及控制模块首先打开供料器与处理器之间的电控阀门，启动供料器向处理器输送含菌液体；

当处理器的处理腔中已充满含菌液体且无气泡时，时序与脉冲参数设定及控制模块启动正极性高电压纳秒脉冲发生器和负极性高电压纳秒脉冲发生器使其按照设定时序和脉冲参数要求输出正、负极性高电压纳秒脉冲通过脉冲合成模块馈送至处理器高压电极，正极性高电压纳秒脉冲发生器输出的正极性脉冲通过第一高功率脉冲二极管(d1)馈送至处理器高压电极，负极性高电压纳秒脉冲发生器输出的负极性高电压纳秒脉冲经磁开关ms、锐化开关s和锐化电容c1进行脉冲压缩后馈送至处理器的高压电极；

处理器，用于待正、负极性高电压纳秒脉冲发生器及供料器等工作稳定后，处理器输出液体已可确保已达到设定参数电场处理后，时序与脉冲参数设定及控制模块打开收集器进液阀门，将经过电场灭菌处理的液体输送至收集器存储，供后续处理使用；在系统未达到稳定运行之前，处理器输出液体全部送入废液储存器；废液储存器中的废液可以回收至供料器；当时序与脉冲参数设定及控制模块检测到供料器中含菌液体已基本用尽，不能保证输送至处理器的含菌液体能够充满处理腔且不含气泡时，时序与脉冲参数设定及控制模块输出控制指令关闭收集器进液阀门后关闭正、负极性高电压纳秒脉冲发生器。然后关闭供料器输送泵及阀门，系统停机。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、通过本发明的正、负双极性高电压纳秒脉冲电场处理，使含菌液体中的细菌、芽孢、病毒和生物细胞受到快速变化的正、负双极性电场作用，使得细菌、芽孢、病毒和生物细胞的极性物质的相对位置、结构发生变化，甚至使得蛋白质、核酸等对细菌、芽孢、病毒和生物细胞生命活动至关重要的长链结构极性物质分解，从而抑制细菌、芽孢、病毒和生物细胞的生物活性甚至使其凋亡或死亡。

2、本发明采用重频和多脉冲加载方式使含菌液体中的细菌、芽孢、病毒和生物细胞受到多次间隔时间较短的电场作用，可以降低抑制细菌、芽孢、病毒和生物细胞的生物活性或使其凋亡、死亡所需的电场强度阈值。

3、本发明提出的正、负双极性脉冲合成方法。通过在正极性脉冲输出电路中接入用于抑制反向正极性电压脉冲的第一高压二极管d1和用于抑制反向负极性电压脉冲的第二高压二极管d2，在负极性脉冲输出电路中接入抑制正极性电压脉冲反窜的磁开关ms、非对称结构的锐化开关s以及与磁开关ms、锐化开关s配合用于锐化负极性脉冲前沿、压缩负极性脉冲脉宽的锐化电容c1，实现正极性高电压纳秒脉冲和负极性高电压纳秒脉冲的汇聚并抑制其相互间的串扰，实现对含菌液体的高效率电场加载。

对充满含菌液体的处理器的高压电极馈送正、负双极性纳秒级高压电脉冲，使在处理器的处理腔中的含菌液体受到正极性高电压纳秒脉冲电场和负极性高电压纳秒脉冲电场的交替作用，从而使含菌液体中细菌及其芽孢、病毒、生物细胞中的蛋白质等极性物质在正、负双极性纳秒级高压脉冲电场的交替作用下发生移位或破坏，使细菌的细胞膜或病毒外膜穿孔，或使蛋白质等物质的生物活性受到破坏，从而使细菌及其芽孢、病毒、生物细胞失去活性或者凋亡。

在一个加载周期内对含菌液体进行一次正极性高电压纳秒脉冲和一次负极性高电压纳秒脉冲加载，增强脉冲电场与细菌的亚细胞结构及生物活性物质的耦合，用于损伤细菌、芽孢、病毒、生物细胞的亚细胞结构、改变生物活性物质结构及构成，用于解决细菌及其芽孢的灭活问题。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1正、负双极性电场灭菌原理示意图。

图2正、负双极性电场灭菌系统结构示意图。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

时序及脉冲参数设定及控制模块是以fpga、arm、plc、单片机或计算机为核心的电子系统，用于根据设定时序和脉冲参数要求，产生并发送控制指令信号，控制正极性脉冲发生器、负极性脉冲发生器以及与供料器、处理器、收集器以及废液储存器相关的液体输送系统、阀门等的运行。

电场灭菌工作原理：

采用脉冲宽度为数纳秒至数十纳秒的正极性电脉冲p1和负极性电脉冲p2对含菌液体进行加载，正极性电脉冲p1和负极性电脉冲p2之间的时间间隔尽量短，一般情况下要求不超过100纳秒，且脉冲源采用重复频率工作方式对含菌液体进行多次重复脉冲电场加载。

首先，利用脉冲宽度为数纳秒至数十纳秒的正极性电脉冲p1建立的正极性脉冲电场，使含菌液体中的细菌、芽孢、病毒和生物细胞受到正极性脉冲电场作用，在正极性脉冲电场作用结束后的极短时间内(一般要求小于等于100纳秒)，脉冲宽度为数纳秒至数十纳秒的负极性电脉冲p2在含菌液体中建立负极性脉冲电场，使含菌液体中的细菌、芽孢、病毒和生物细胞在受到正极性脉冲电场作用之后迅即受到反向的负极性脉冲电场作用，从而使细菌、芽孢、病毒和生物细胞中的蛋白质等极性物质的相对位置、结构发生变化，甚至引起这些物质的分解，使细菌、芽孢、病毒和生物细胞结构受到破坏，使其失活、凋亡甚至解体死亡。

重复频率的多脉冲高强度电场在极性物质分子上可形成强度较大的周期性多次冲击性电场力作用，可使极性物质分子与其附着物质分离或使极性长链分子构型及其团聚状态改变所需的电场强度阈值降低，增强脉冲电场对细胞、细菌及其芽孢、病毒结构及生物物质活性的作用，增强灭菌效率。该方法不会对含菌液体产生明显的加热效应，可避免造成不希望发生的化学反应。该方法不需要使用化学助剂，因此，也不存在化学残留问题。

该技术方案电路框图如图1、2所示：包括但不限于正极性高电压纳秒脉冲发生器、负极性高电压纳秒脉冲发生器、时序及脉冲参数设定及控制模块、脉冲合成模块及处理器；除此之外还可能包括供料器、收集器及废液储存器。

供料器用于输送待处理含菌液体，至少包括储液罐、输送泵和管道、流量控制阀门等。

收集器用于收集经过处理的液体，至少包括储液罐和管道、阀门系统，其进液管道与废液储存器管道的歧口设计应确保收集器阀门开启前菌液不会进入收集器进液歧管。

废液储存器用于收集未经合乎设定参数要求的电场处理过的菌液。

处理器用于对含菌液体进行电场灭菌处理。由高压电极、接地电极、处理腔及壳体等组成，其中高压电极、接地电极之间设计为有足够长度和截面积的空腔(即处理腔)，用作菌液流通通道和对菌液进行电场灭菌处理的高强度电场加载区。处理腔可以为同轴型、平板型等结构，推荐采用电场分布较为均匀的结构，以使通过处理腔的菌液受到的电场作用有较好的一致性。处理腔截面要求能够满足处理流量和流速要求，其长度要求能够满足加载脉冲数要求。处理器外壳接地并要求确保高电压脉冲(正、负极性高电压纳秒脉冲)不能通过菌液耦合到供料器、收集器和废液储存器上。

时序及脉冲参数设定及控制模块检测正极性高电压纳秒脉冲发生器、负极性纳秒脉冲发生器、处理腔、供料器、收集器及废液储存器状态参数并产生控制指令信号控制设备运行。时序及脉冲参数设定及控制模块首先启动供料器向处理腔输送待处理含菌液体，当处理腔中充满待处理含菌液体且菌液流速已稳定在设置值、收集器和废液储存器储液罐中菌液未达到容量上限时，时序及脉冲参数设定及控制模块启动正极性纳秒脉冲发生器和负极性纳秒脉冲发生器，并使它们按照设定时序和脉冲参数要求输出脉冲，通过脉冲合成模块形成正、负极性脉冲馈送至处理器中的高压电极，对处理器中处理腔内的菌液进行处理。时序及脉冲参数设定及控制模块在检测加载到处理腔上的电脉冲参数已达到设定参数且状态稳定后延迟一段时间，确保未经良好处理的菌液不会通过收集器进液管道歧口进入收集器后打开收集器进液阀门，使已完成电场灭菌处理的液体进入收集器。

脉冲合成模块将来自正极性纳秒脉冲发生器的正极性纳秒脉冲和来自负极性纳秒脉冲发生器的负极性纳秒脉冲进行合成处理后输出正、负极性脉冲，馈送至处理器。脉冲合成模块通过在正极性纳秒脉冲发生器与处理器高压电极(脉冲合成模块输出端)之间接入第一高功率脉冲二极管d1，在第一高功率脉冲二极管d1负极端与地线之间接入第二高功率脉冲二极管d2；在负极性纳秒脉冲发生器与处理器高压电极之间接入磁开关ms和锐化开关s，在磁开关ms和锐化开关s公共端与地线之间接入锐化电容c1，实现正极性高电压纳秒脉冲和负极性高电压纳秒脉冲的汇聚并抑制其相互间的串扰。正极性高电压纳秒脉冲发生器输出的单个正极性高电压纳秒脉冲在磁开关ms和锐化开关s公共端处的电压v(t)对时间的积分值小于磁开关ms的伏秒数。负极性高电压纳秒脉冲发生器输出的单个脉冲要求在经过磁开关ms、锐化开关s和锐化电容c1进行脉冲压缩后满足负极性脉冲幅度、脉冲宽度和时序设计要求。

具体电路设计如图2所示。时序及脉冲参数设定及控制模块分别与正极性高电压纳秒脉冲发生器、负极性高电压纳秒脉冲发生器、供料器、处理器、收集器、废液储存器连接。正极性高电压纳秒脉冲发生器高压输出端通过第一高功率脉冲二极管d1连接到处理器高压电极上，同时其负极端与第二高功率脉冲二极管d2负极端并接，第二高功率脉冲二极管d2正极端接地。负极性高电压纳秒脉冲发生器通过磁开关ms连接到锐化开关s和锐化电容c1一端，锐化开关s另一端连接到处理器高压电极上，锐化电容c1另一端接地。处理器地电极及外壳接地。供料器输出管道通过电控阀门接入处理器进料口。处理器出料口通过三通歧管一个输出端口和电控阀门与收集器连接，三通歧管另一个输出端口通过电控阀门与废液储存器连接。废液储存器通过回液管道、输送泵与供料器连接。

本技术方案的工作过程为：首先，时序及脉冲参数设定及控制模块检测正极性高电压纳秒脉冲发生器、负极性高电压纳秒脉冲发生器中脉冲产生电路中的电容器组是否已充电达到预设电压、收集器和废液储存器中液位是否低于启动液位、供料器中液位是否高于启动液位等参数，以确认系统状态是否满足开机条件。当系统状态参数满足开机条件时，触发控制器首先打开供料器与处理器之间的电控阀门，启动供料器向处理器输送含菌液体。

当处理器的处理腔已充满含菌液体且无气泡时，时序及脉冲参数设定及控制模块启动正极性高电压纳秒脉冲发生器和负极性高电压纳秒脉冲发生器使其按照设定时序和脉冲参数要求(即脉冲幅值、脉宽和时间间隔)输出正、负极性纳秒脉冲通过脉冲合成模块馈送至处理器高压电极。正极性高电压纳秒脉冲发生器输出的正极性脉冲通过d1馈送至处理器高压电极。负极性高电压纳秒脉冲发生器输出的负极性高电压纳秒脉冲经磁开关ms、锐化开关s和锐化电容c1进行进一步脉冲压缩后馈送至处理器的高压电极。时序及脉冲参数设定及控制模块触发正极性高电压纳秒脉冲发生器和负极性高电压纳秒脉冲发生器的触发脉冲的时间间隔应使加载到处理器的正、负极性脉冲的时间间隔尽量短(一般要求小于等于100纳秒)。时序及脉冲参数设定及控制模块按照处理装置的灭菌要求以一定的重复频率重复交替触发正、负极性脉冲发生器，以实现对含菌液体的重复频率多次脉冲电场处理。

正、负极性脉冲发生器的输出时间顺序也可以是先输出负极性脉冲。

待正、负极性脉冲发生器及供料器等工作稳定后，处理器输出液体已可确保已达到设定参数电场处理后，时序及脉冲参数设定及控制模块打开收集器进液阀门，将经过电场灭菌处理的液体输送至收集器存储，供后续处理使用。在系统未达到稳定运行之前，处理器输出液体全部送入废液储存器。废液储存器中的废液可以回收至供料器。

当时序及脉冲参数设定及控制模块检测到供料器中含菌液体已基本用尽，不能保证输送至处理器的含菌液体能够充满处理腔且不含气泡时，发送控制指令关闭收集器进液阀门后关闭正、负极性高电压纳秒脉冲发生器。然后关闭供料器输送泵及阀门，系统停机。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。